Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale

Sommario

Dimostriamo la fabbricazione, la calibrazione e le proprietà di due tipi di microelettrodi iono-selettivi (a doppio cilindro e concentrici) per la misurazione delle concentrazioni di ioni nel tessuto cerebrale. Questi vengono poi utilizzati nella preparazione della fetta di ippocampo di topo per dimostrare che l'attività eccitatoria cambia sia le concentrazioni extracellulari di potassio che di sodio.

Abstract

L'attività elettrica nel cervello è accompagnata da significativi flussi di ioni attraverso le membrane, con conseguenti cambiamenti complessi nella concentrazione extracellulare di tutti i principali ioni. Poiché questi spostamenti ionici hanno conseguenze funzionali significative, la loro determinazione quantitativa è spesso necessaria per comprendere la funzione e la disfunzione delle reti neurali in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Nel presente studio, dimostriamo la fabbricazione e la calibrazione di microelettrodi iono-selettivi a doppio barile, che si sono dimostrati strumenti eccellenti per tali misurazioni nel tessuto cerebrale. Inoltre, vengono descritti anche i cosiddetti microelettrodi iono-selettivi "concentrici" che, in base al loro diverso design, offrono una risoluzione temporale di gran lunga migliore dei rapidi cambiamenti ionici. Mostriamo quindi come questi elettrodi possono essere impiegati in preparazioni acute di fette di cervello dell'ippocampo del topo. Utilizzando microelettrodi selettivi per il potassio a doppia canna, sono dimostrate variazioni della concentrazione extracellulare di potassio ([K⁺]_o) in risposta all'applicazione esogena di agonisti del recettore del glutammato o durante l'attività epilettiforme. Inoltre, illustriamo le caratteristiche di risposta degli elettrodi sensibili al sodio, a doppia canna e concentrici e confrontiamo la loro rilevazione delle variazioni della concentrazione extracellulare di sodio ([Na⁺]_o) evocate dal bagno o dall'applicazione di pressione di farmaci. Queste misurazioni mostrano che, sebbene le ampiezze di risposta siano simili, i microelettrodi concentrici di sodio mostrano un rapporto segnale/rumore e un tempo di risposta superiori rispetto al design a doppio cilindro. In generale, le procedure dimostrate saranno facilmente trasferibili alla misurazione di altre specie di ioni, tra cui pH o calcio, e saranno applicabili anche ad altre preparazioni.

Introduzione

La segnalazione elettrica nel cervello si basa sul flusso di ioni attraverso le membrane plasmatiche. I principali movimenti ionici da e verso lo spazio extracellulare non sono mediati solo dal passaggio attraverso canali ionici voltaggio-dipendenti, ma anche dai recettori ionotropici postsinaptici e dai trasportatori ionici. L'attività neuronale è quindi accompagnata da complessi cambiamenti nella concentrazione extracellulare di tutti i principali ioni ¹. Ad esempio, è stato dimostrato che l'afflusso di sodio nei neuroni durante l'attività eccitatoria provoca una diminuzione della concentrazione extracellulare di sodio ([Na⁺]_o) ². Lo stesso vale per la concentrazione extracellulare di calcio perché gli ioni calcio entrano rapidamente sia nelle strutture pre che postsinaptiche ³. Allo stesso tempo, il potassio si muove in modo opposto e questo media un aumento della concentrazione extracellulare di potassio ([K⁺]_o) nell'intervallo mM basso ^4,5. L'attività sinaptica provoca anche cambiamenti nel pH extracellulare che sono in parte mitigati dai concomitanti flussi di membrana gliale che modificano il pH intragliale ^6,7. Questi cambiamenti legati all'attività nelle concentrazioni di ioni extracellulari hanno conseguenze funzionali significative. Ad esempio, anche piccoli aumenti di [K⁺]_o depolarizzano i neuroni e le cellule gliali, alterando così l'eccitabilità neuronale, ed esistono diversi meccanismi per rimuovere l'eccesso di potassio ⁸. Il fallimento di questi può provocare l'attività epilettiforme dei neuroni o fenomeni come la diffusione della depressione ¹.

A causa della loro importanza critica, la determinazione quantitativa delle concentrazioni di ioni extracellulari è spesso necessaria e richiesta per comprendere la funzione e la disfunzione delle reti neurali in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Per decenni, i microelettrodi iono-selettivi a doppia canna si sono dimostrati strumenti eccellenti per tali misurazioni nel tessuto cerebrale ⁹. Per molti ioni sono disponibili sensori altamente specifici con bassa reattività crociata per altri ioni. Oltre ai classici elettrodi a doppia canna, sono stati recentemente introdotti i cosiddetti elettrodi concentrici. Questi ultimi forniscono una risoluzione temporale superiore, ma richiedono un po' più di tempo e fatica per costruirne ¹⁰.

Di seguito, descriveremo la preparazione e la calibrazione di questi due tipi di microelettrodi ionoselettivi. Mostriamo quindi come questi elettrodi possano essere impiegati nelle preparazioni di fette di cervello per misurare le variazioni di [K⁺]_o o [Na⁺]_o indotte dall'attività eccitatoria seguendo diversi paradigmi di stimolazione tra cui il bagno e l'applicazione di pressione di farmaci.

Protocollo

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le linee guida istituzionali Heinrich Heine University Düsseldorf, in Germania, così come la Direttiva Europea Consiglio della Comunità (86/609 / CEE). Tutti gli esperimenti sono stati comunicati alle, e approvati dal Ufficio di assistenza degli animali presso l'impianto di cura degli animali e uso del Heinrich Heine University Düsseldorf, Germania (numero atto istituzionale: O52 / 05). In conformità con la Animal Welfare Act tedesco (Tierschutzgesetz, articoli 4 e 7), senza ulteriore approvazione formale per la rimozione post mortem del tessuto cerebrale era necessario.

1. Preparazione di doppia canna Microelettrodi Ion-selettivi

1. Preparare due capillari di vetro borosilicato con filamento: una con una lunghezza di 7,5 cm ed un diametro esterno di 1,5 mm da utilizzare per la canna sensibile agli ioni, e uno con una lunghezza di 6,5 cm ed un diametro esterno di 1,0 mm per la successiva barile di riferimento.
2. Pulire il CAPIL laries in acetone per 12 ore e poi sciacquare più volte con abs. etanolo e lasciarli asciugare. Gli elettrodi possono essere memorizzati in un essiccatore.
3. Utilizzare colla a due componenti o una piccola striscia di foglio di alluminio per fissare un lungo e breve capillare insieme ad entrambe le estremità. Riscaldare il doppio capillare in un forno a 60 ° C per 1 ora. Questo accelera il processo di polimerizzazione. Conservare gli elettrodi ora in un essiccatore.
4. Centrare il doppio capillare in un estrattore verticale con un mandrino girevole. Riscaldare la bobina delicatamente finché il vetro è sufficientemente morbido per consentire una rotazione orizzontale del mandrino girevole di 180 °. Durante questa fase, evitare l'allungamento del capillare con un cuneo sotto il mandrino.
5. Dopo il raffreddamento, rimuovere l'interruzione meccanica e applicare un secondo protocollo di riscaldamento per tirare fuori il capillare, con conseguente due, capillari a doppia canna taglienti (Figura 1). Il diametro della punta di un doppio capillare dovrebbe essere vicino a 1 micron.

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Figura 1. Architettura di microelettrodi ionoselettive. (A) Fotografia di un microelettrodo a doppia canna. A scopo illustrativo e migliore visibilità, il liquido all'interno della canna di riferimento è stato tinto. (B) Fotografia di un microelettrodo concentrica e l'elettrodo di riferimento corrispondente. La punta del microelettrodo concentrica è mostrata ingrandita alla sua sinistra. In (A) e (B), lo spazio occupato dal sensore di ioni nelle punte delle pipette è post-colorato. In fondo, la disposizione punta di entrambi i tipi di elettrodi è rappresentato schematicamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

6. Se un estrattore verticale con mandrino girevole non è disponibile, di preparare uno ione-Selec doppia cannativa microelettrodo in un estrattore orizzontale utilizzando theta vetro.
   1. A tal fine, tirare theta vetro (diametro esterno di 1,5 mm, lunghezza 7,5 cm) ad comportare due elettrodi con due botti ciascuno. Mark uno di loro per servire come futuro riferimento botte. Silanizzata l'altra simile alla procedura descritta di seguito per servire come futuro barilotto ione-selettivo.
      NOTA: Mentre la preparazione di elettrodi a doppia canna theta-vetro è molto più facile che la preparazione di ritorti elettrodi a doppia canna, sono più inclini a cross-azione tra entrambe le canne come la parete di vetro che separa sottile tra loro tende ad essere poroso il possibile suggerimento.
      NOTA: Poiché il cocktail sensore (vedi sotto) è idrofobo, la superficie interna della canna sensibile agli ioni successivamente deve essere reso idrofobo e da un processo chiamato silanizzazione. Per questo, esametildisilazano (HMDS) viene utilizzato (Figura 2), come descritto nel passaggio successivo.

Figura 2. silanizzazione delle pipette. (A) Hexamethyldisilazane (HMDS) reagisce con i gruppi Si-OH della superficie di vetro interna e rende idrofobico. (B) La foto di sinistra mostra l'intera unità silanizzazione. Una bottiglia bocca larga contenente HMDS è posto sulla sommità di una piastra di circuito riscaldamento a 40 ° C. Sulla parte superiore della bottiglia, un supporto (PH) portante i capillari (PAC) è montato. La fotografia destra mostra un ingrandimento di supporto pipetta (PH) portante i capillari (Cap). (C) vista laterale schematica dei titolari pipetta su misura (PH) per (a destra) capillari doppia canna (sinistra) o concentrici (PAC) montato su una bottiglia a livello di bocca. Cliccate qui per vedere una versione più grande questa figura.

7. Poco prima puelettrodi riempimento di, riempiono circa. 20 ml HMDS in una bottiglia a bocca larga. Attenzione: HMDS è per l'uso in una cappa aspirante solo, vapori sono pericolosi per la salute! Chiudere la bottiglia e metterlo su una piastra riscaldante, preimpostato a 40 ° C. Preriscaldare un forno, posto sotto il cofano e, fino a 200 ° C.
8. Riempire la canna riferimento fino alla punta con acqua distillata per impedirne la silanizzazione durante la seguente procedura.
9. Mettere capillare a doppia canna con la punta in su su uno speciale supporto su misura (Figura 2B, 2C). L'estremità aperta smussata deve raggiungere liberamente attraverso la parte inferiore del supporto (Figura 2C, sinistra). Successivamente, posizionare il supporto sulla bottiglia bocca contenente le HMDS pre-riscaldato per 70 min.
   NOTA: assicurarsi che il vapore HMDS può fluire attraverso i capillari liberamente. Durante un processo di silanizzazione, 20 ml di HMDS non evaporano completamente, e la bottiglia può quindi essere utilizzato più volte.
10. Dopoguerrads, trasferire i capillari ad un supporto metallico e nel forno preriscaldato per due ore. Questo si asciugherà entrambe le canne.
11. Dopo silanizzazione, tenere i capillari asciutto fino al momento dell'uso. Mentre la prima procedura richiede circa 3,5 ore in totale, elettrodi possono essere memorizzati in un essiccatore per diverse settimane.
12. Il giorno del loro uso sperimentale, preparare elettrodi ionoselettivi riempiendo la punta della canna silanizzata con 1-2 ml di sensore ione-selettivo (Figura 1A). Per microelettrodi potassio sensibili, utilizzare il valinomicina vettore; e per microelettrodi sodio-sensibili, utilizzare ETH 157 come vettore.
13. Osservare che il rivelatore di ioni-selettivi è molto viscoso rendendo difficile per la punta per riempire correttamente.
14. Riempire il barile di riferimento con soluzione salina HEPES-buffered (vedi sotto).
    Nota: mentre altri più semplice soluzione salina, iso-osmotica potrebbe essere utilizzato come bene, preferiamo usare una soluzione salina la cui composizione è sostanzialmente simile ala salina di perfusione (ACSF, vedi 3.6.), in quanto potrebbe fuoriuscire e penetrare nel tessuto durante gli esperimenti. Pertanto, è anche essenziale che tale soluzione salina non contiene una maggiore concentrazione dello ione da determinare rispetto ACSF utilizzato.
15. Backfill il sensore con soluzione salina che contiene un'alta concentrazione dello ione da rilevare. Così, reinterro del sensore con 100 mM NaCl soluzione fisiologica (sodio per microelettrodi sensibili) o KCl mm 100 (per microelettrodi potassio-sensitive). Essere sicuri di non inserire le bolle d'aria supplementari durante questa procedura.
16. Se la silanizzazione ha avuto successo e il sensore è riempito correttamente, osservare la superficie del sensore formare una superficie concava chiaramente visibile contro il riempimento (Figura 1A). In caso contrario, il sensore può essere ritirata dalla parete dei capillari e la punta non sarà riempita. Tali elettrodi non saranno funzionali.
17. Inserire fili d'argento clorurati in entrambe le canne (fare attenzione a non toccare il senSor) e sigillare ogni barile con impronte dentarie (Figura 1A).

2. Preparazione di concentrico ionoselettivo Microelettrodi

1. Per la canna esterna, utilizzare capillari di vetro a pareti sottili con filamento (diametro esterno 2.0 mm) e una lunghezza di 7,5 cm. Per la canna interna, prendere capillari sottili d'acciaio con filamenti, un diametro esterno di 1,2 mm e una lunghezza di 10 cm.
2. Pulire i capillari in acetone per 12 ore. e poi sciacquare diverse volte con abs. etanolo e lasciarli asciugare. Gli elettrodi possono essere memorizzati in un essiccatore.
3. Riempire circa. 20 ml HMDS in una bottiglia a bocca larga. ATTENZIONE! HMDS è per l'uso in una cappa aspirante solo, vapori sono pericolosi per la salute. Chiudere la bottiglia e metterlo su una piastra riscaldante, preimpostato a 40 ° C. Preriscaldare un forno, posto sotto il cofano e, fino a 200 ° C.
4. Inserire il capillare 2,0 millimetri in un estrattore orizzontale e tirarlo fuori di provocare capillari con brevi ceri e una punta Diameter ~ 4 micron (Figura 1B).
5. Mettere tirato-out 2.0 mm capillare con la punta su sopra un supporto speciale misura (Figura 2B, 2C figura) in modo che la sua estremità smussata apre alla cavità del flacone (Figura 2C, destra). Successivamente inserire questo supporto sulla bottiglia bocca contenente le HMDS pre-riscaldato per 70 min. Assicurarsi che il vapore HMDS può fluire attraverso tutti i capillari.
6. Successivamente, trasferire i capillari ad un supporto metallico e nel forno preriscaldato per due ore.
7. Dopo silanizzazione, tenere i capillari asciutto fino al momento dell'uso. Mentre la prima procedura richiede circa 3,5 ore in totale, ora archiviare gli elettrodi in un essiccatore per diverse settimane.
8. Appena prima dell'uso, riempire una piccola quantità di sensore (0,2 ml) nel capillare silanizzata (Figura 1B).
9. Per preparare il capillare interno, inserire un piccolo diametro capillare nel estrattore ed estrarre comportare duecapillari con lunghi ceri e punte acuminate (Figura 1B). Riempire con NaCl 100 mm (microelettrodi sodio-sensibile) o KCl 100 mm (microelettrodi potassio-sensitive) salino.
10. Posizionare il sensore pieno e il capillare soluzione salina direttamente in linea con l'altro su un tappo di generazione personalizzata a base di lamelle. Inserire il capillare più piccola per un breve tratto nel capillare più grande.
11. Fissare i capillari passaggio ad un altro vetrino con pasta modellabile, trasferimento alla fase di un microscopio e visualizzare con un ingrandimento 100x. Con l'aiuto di una bacchetta di vetro che è montato su un micromanipolatore e ruotando fini azionamento della fase del microscopio, far avanzare lentamente il capillare esterno sopra il capillare interno finché la distanza tra le punte è approssimativamente 5 micron (Figura 1B).
12. Fissare l'estremità aperta del capillare esterno sul capillare interno con cera dentale. In alternativa, applicare una piccola goccia di cianoacrilato (Crazy Glue) instead di cera.
    NOTA: L'aggiunta di una piccola goccia d'acqua polimerizzare la colla e fissare gli elettrodi in posizione. Inserire un filo d'argento clorurato nella canna interna e sigillare con impronte dentarie (Figura 1B).
13. Per preparare l'elettrodo di riferimento, richiedere parecchio 7,5 cm capillare con filamento e un diametro esterno di 1.5 mm ed estrarre con un estrattore verticale. Assicurarsi che le punte sono relativamente lunghi, ma non troppo affilata (punta diametro ~ 1 micron).
14. Gettare la pipetta superiore, aprire il mandrino più bassa e sollevare la pipetta inferiore di circa 5 mm. Richiudere il mandrino e sollevarlo fino alla punta dell'elettrodo inferiore è posizionata circa 5 mm sopra la bobina di riscaldamento. Riscaldare la bobina e utilizzare pinze per piegare la punta di circa 45 ° rispetto al lato. Pipetta inferiore di circa 1-2 mm. Bend ancora da circa -45 ° per dirigere la punta torna in parallelo all'albero principale (Figura 1B). Questa procedura è necessaria per consentire la chiusura posizionamento della punta del RIFERIMESNO dell'elettrodo all'elettrodo concentrica.
15. Riempire la canna di riferimento con soluzione salina tamponata HEPES-(vedi sotto), inserire un filo di argento clorurato e sigillare la canna con cera dentale (Figura 1B).

3. Salines

1. Preparare salina per riempimento di elettrodi potassio sensibili (vedi 1.15.) Composti da KCl 100 mm. Saline per riempimento di elettrodi sensibili sodio è composto di NaCl 100 mM.
2. Preparare salina per riempimento di botti di riferimento (. Salina HEPES-buffered, vedi 1.16) è composto da (in mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl _2, 2 _MgSO4, 1.25 NaH ₂ PO _4, e 25 HEPES, titolato con NaOH comportare un pH di 7,4.
3. Preparare salina per la calibrazione degli elettrodi potassio sensibili sono composti da 25 mM HEPES e un totale di 150 mM NaCl e KCl, pH regolato a 7,4 con NMDG-OH (N-metil-D-glucammina). Qui, la calibrazione è stata eseguita con saline contenenti 1, 2, 4 o 10 mMKCl; ACSF conteneva 2,5 mM KCl (Figura 5).
4. Preparare salina per la taratura degli elettrodi di sodio sensibili come segue; (in mM), 25 HEPES 3 KCl, un totale di 160 NaCl e NMDG-Cl, pH regolato a 7,4 con NMDG-OH. Eseguire la calibrazione con soluzione salina contenente (in mM) 70, 100, 130 o 160 NaCl; ACSF conteneva NaCl 152 (Figura 6).
5. Per la determinazione di cross-reazione del sensore con altri ioni, per es., PH, preparare saline taratura addizionali con concentrazioni di ioni fissi, ma variando pH.
   NOTA: Anche se questa procedura non è dimostrato in questo studio, si prega dovrebbe fare riferimento al precedente lavoro affrontare questo problema (ad esempio ^11,12).
6. Preparare fettine di tessuto cerebrale acuto in soluzione salina composto (in mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 0,5 CaCl _2, 6 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3 e 20 glucosio, bollito con 95% O ₂ e 5 % CO _2, risultando in un pH di7.4.
7. Eseguire esperimenti in fettine cerebrali nel liquido artificiale cerebrospinale (ACSF) composto (in mM): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2 CaCl _2, 1 MgCl _2, 1,25 NaH ₂ PO _4, 26 _NaHCO3 e 20 glucosio, bollito con 95 % O ₂ e 5% CO2, risultando in un pH di 7,4.
8. Per la stimolazione dei neuroni e cellule gliali, preparare soluzioni contenenti glutammato mM 0,2, 0,3, 0,4 o 0,5 o 10 mm L-aspartato sciolto in ACSF. Per l'applicazione di pressione, sciogliere glutammato 10 mM in soluzione salina HEPES-buffered.
9. Preparare pipetta richiesta di applicazione della pressione. Inserire capillari di vetro a pareti sottili con filamento (diametro esterno 2,0 millimetri) e una lunghezza di 7,5 cm nel estrattore orizzontale e tirare fuori di provocare un diametro punta di ~ 1 micron.
10. Per l'induzione di attività epilettiforme, preparare ACSF gratuito contenente magnesio 10 micron bicucullina methiodide.
11. Per inibire la generazione di potenziali d'azione, preparare un 10 mM magazzino solutioni di tetrodotossina (TTX) in acqua distillata. Durante gli esperimenti, TTX viene aggiunto direttamente al ACSF comportare una concentrazione finale di 0,5 mM.
12. Per evitare l'attivazione di recettori AMPA-, preparare una soluzione madre 50 mm di ciano-nitroquinoxaline-dione (CNQX) in dimetilsolfossido (DMSO). Durante gli esperimenti, questo viene aggiunto direttamente al ACSF comportare una concentrazione finale di 100 mM.
13. Per bloccare l'attivazione di recettori NMDA, preparare una soluzione madre 50 mm di amino-phosphonopentanoate (APV) in 70 mM _NaHCO3. Durante gli esperimenti, questo viene aggiunto direttamente al ACSF comportare una concentrazione finale di 100 mM.

4. La calibrazione di microelettrodi Ion selettivi

1. Calibrare microelettrodo ionoselettivo immediatamente prima e dopo ogni esperimento.
2. Collegare gli elettrodi di micromanipolatori e inserirli in una camera sperimentale ACSF-perfusione, posto sotto un microscopio stereo (Figura 3 g>, 4). Posizionare l'elettrodo di riferimento nella precamera (Figura 4A, B). Accendere il bagno di perfusione, in modo che il flusso è di circa 2 ml / min.

Figura 3. Lo spazio di lavoro sperimentale. L'impianto di registrazione è costituito da un tavolo ammortizzata porta la fase x / y-traslazionale con il bagno sperimentale, i micromanipolatori, e uno stereomicroscopio con ottica di elevata qualità. Il microscopio stereo è anche dotato di una fotocamera CCD a scopo di documentazione. Inoltre, viene utilizzato un dispositivo di applicazione di pressione per Drug Application focale. Gli elettrodi di registrazione sono accoppiati attraverso lo stadio testa per un amplificatore differenziale. I dati digitalizzati (un convertitore A / D) viene registrato con un computer. La perfusione bagno è realizzato da un micro pompa peristaltica (non mostrata).> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Accendere il convertitore A / D, l'amplificatore differenziale, e il computer, e avviare il software di registrazione (Figura 3, 4). Poiché la resistenza delle canne ionoselettivi è molto elevato (10-20 GΩ; vedi sotto), utilizzare una speciale amplificatore elettrometro ad alta impedenza di ingresso (R = 10 _in TΩ) e una corrente di polarizzazione piccola (I _{polarizzazione} = 50 fA - 1 pA).

Figura 4. elettronica e design dello spazio del set up sperimentale. (A) Rappresentazione schematica della disposizione di registrazione. Le punte di una doppia canna microelettrodo (blu) e un microelettrodo concentrica (rosso) sono disposti in un bagno sperimentale riempito con soluzione fisiologica. L'elettrodo di riferimento è indicato schematicamente bagno. Il Poten TIAL rilevato dai barili ionoselettivi (V ₁₎ è composto dal campo elettrico potenziale (V _ref) e il potenziale ionico (V _ion), mentre le botti di riferimento (V ₂₎ solo rilevamento _V ref. Per isolare V _ion, V _ref viene sottratto dal V _{1 mediante} un amplificatore differenziale (DA). (B) Topografia della fase sperimentale con un microelettrodo concentrica a posto. Il centro di fase sperimentale costituito dalla vasca sperimentale contenente la preparazione fetta. Per mettere a terra il bagno, l'elettrodo di riferimento bagno è immerso nella pre-camera che ospita anche l'ingresso di perfusione. Lo stadio si è messo a terra da un connettore di terra separato. Il microelettrodo concentrici e il suo elettrodo di riferimento sono portati da titolari pipetta diverso azionati da micromanipolatori. Microelettrodo ed elettrodo di riferimento sono accoppiati elettronicamente alla fase testa dell'amplificatore.e.com/files/ftp_upload/53058/53058fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

4. Collegare fili d'argento clorurati ai rispettivi ingressi dello stadio testa dell'amplificatore differenziale (Figura 4). Determinare le resistenze degli elettrodi. Assicurarsi che la resistenza della canna riferimento è compresa tra 30-100 MW e la resistenza della canna sensibile agli ioni è tra 10-20 GΩ.
5. Regolare segnali di tensione a zero e avviare la registrazione.
6. Si noti che il potenziale rilevata dai barili ionoselettivi (V ₁₎ è composto dal campo elettrico potenziale (V _ref) e il potenziale ionico (V _ion), mentre le botti di riferimento (V ₂₎ solo rilevamento _V ref. Per isolare V _ion, V _ref viene sottratto dal V _{1 mediante} un amplificatore differenziale (DA) (Figura 4A).
7. Dopo aver ottenuto una linea di base stabile,interruttore saline calibrazione contenenti concentrazioni definite dello ione da misurare.
   NOTA: La figura 5A mostra la calibrazione di un microelettrodo doppia canna potassio sensibile. Nella Figura 6A, la taratura di entrambi una doppietta, così come mostra il concentrica microelettrodo -sensitive Na ^+. Mentre noi non descriviamo la procedura qui, si noti che le possibili interferenze con altri ioni devono essere controllati prima di usare un ionoforo specifica (vedi anche 3.4.).

Figura 5. Calibrazione di microelettrodi doppietta potassio-selettiva. (A) Variazione della tensione della canna di riferimento _(Vref) e del K ⁺ -potential (V _{K +)} in risposta ai cambiamenti della vasca K ⁺ concentrazione ( [K ^+] _b) come indicato. (B) Mezzaappezzamento -logarithmic di [K ^+] _b contro V _{K +.} Un grafico lineare dei dati rivela una pendenza di circa 56 mV. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

8. Determinare la risposta di tensione della canna ione-selettivo in risposta ad una variazione nella concentrazione di ioni noto. Dati trama in un unico grafico logaritmico (Figura 5B, 6B) e determinare la pendenza. Un sensore ideale segue una relazione descritta dall'equazione di Nernst (vedi esempio ^13):

V: misurata potenziale di elettrodo;
V _0: potenziale standard di riduzione, ad esempio per un filo AgCl ad una temperatura di 298,15 K e una pressione parziale di 101,325 kPa (assoluta)
R: costante dei gas (8.314 joule / grado Kelvin / mole)
T: temperatura assoluta (in Kelvin)
z: carica sulla ione (+ 1 per potassio e sodio)
F: costante di Faraday (96.500 coulomb)
c ': concentrazione di ioni extracellulare
c '': concentrazione di ioni intracellulari

Ai fini pratici, e il logaritmo naturale sono convertiti alla pendenza s Nernst che è quindi valido per un determinato ione e della temperatura:

NOTA: Per gli elettrodi potassio e sodio, una risposta di tensione ideale del sensore presenta così una pendenza lineare di circa -58 mV a temperatura ambiente. Alcuni deviazione di questo può essere accettato (Figura 5B, 6B). È essenziale, tuttavia, che le caratteristiche di risposta di un dato elettrodo non cambiano significativamente (di oltre il 10%, vedi sotto) prima e dopo un esperimento.

Figura 6. Taratura di microelettrodi sodio-selettivo e confronto di doppia canna con elettrodi concentrici (A) Top tracce:. Variazione della tensione delle botti di riferimento (V _rif) di un elettrodo a doppia canna (nero traccia tratteggiata) e una elettrodo concentrico (grigio traccia) in risposta ai cambiamenti nella vasca di concentrazione ^di Na + ([Na ^+] _b) come indicato. Si noti che le risposte tensione di entrambi gli elettrodi sono praticamente identici. Tracce di fondo: variazioni della tensione della Na ⁺ -potential (V _{Na +)} di una doppia canna elettrodo (traccia nera) ed un elettrodo concentrica (grigio traccia) in risposta alle variazioni di [Na ^+] _b. (B) trame mezza logaritmiche del [Na ^+] _b rispetto al V _{Na +} di entrambi gli elettrodi. Trame lineare dei dati rivelano una pendenza di circa 48 mV per entrambi gli elettrodi.(C) Reazione del V _{Na +} di una doppia canna (trace nero) e un elettrodo concentrica (grigio trace) ad una variazione rapida della [Na ^+] _b da 152 mM a 70 mM. Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo concentrica è significativamente più veloce. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

9. Determinare il tempo di risposta degli elettrodi, che dipende dal diametro della punta, la forma della punta e dallo spessore della fase sensore nella punta dell'elettrodo.
   NOTA: microelettrodi sodio-sensibile in questo sperimentale istituito e impiegando un rapido cambiamento tra le diverse saline di perfusione (cambio a termine presso la punta dell'elettrodo entro 500 msec), canna doppio raggiunto un potenziale stabile entro 9,7 ± 4,5 sec quandopassando da 152 mM a 70 mM [Na ^+] (n = 6). Entro la stessa impostazione, concentrici microelettrodi sodio-sensibili raggiunto un potenziale stabile entro ± 0,3 solo 0,8 secondi (n = 6) (Figura 6C). Questo sottolinea la risoluzione temporale superiore concentrico rispetto a microelettrodi doppietta.

5. dissezione di tessuto

1. Per la generazione di fette acuta, anestetizzare i topi di giorni dopo la nascita 16-20 con _CO 2 e rapidamente decapitato (a seguito della raccomandazione della Commissione europea pubblicata in: L'eutanasia degli animali da esperimento, Lussemburgo: Ufficio delle pubblicazioni ufficiali delle Comunità europee, 1997; ISBN 92-827-9694-9).
2. Preparare fette di tessuto di ippocampo (spessore 250 micron), a seguito di una procedura standard (si veda ad esempio ^14).

6. procedure sperimentali

1. Trasferire una fetta nella camera sperimentale e fissarlo con ungriglia.
2. Abbassare il microelettrodo ionoselettivo calibrato sulla superficie fetta e infilzare il radiatum strato della regione CA1 ad una profondità di circa 50 micron con l'elettrodo.
   NOTA: Toccando la superficie fetta con il microelettrodo porta a fluttuazioni caratteristici canna sensibile agli ioni. Inoltre, danni alle cellule durante impalamento del tessuto può causare variazioni pure. Attendere che di base si è stabilizzata.
3. Per l'applicazione della pressione di agonisti trasmettitore, riempire un pipetta applicazione con il composto (ad esempio glutammato 0.5 mm). Fissare la pipetta ad un micromanipolatore e accoppiarlo ad un dispositivo di applicazione di pressione.
4. Bassa pipetta applicazione nel tessuto e accuratamente posizionarlo in prossimità della punta del microelettrodo ione-selettivi (~ 20-40 micron). Avviare l'applicazione di pressione (ad esempio 10 sec, 40 mbar) e variazioni di tensione record come monitorato dal microelettrodi ioni-selettivi.
5. Per l'applicazione bagno di droghe, swprurito tra le diverse saline di perfusione per una durata determinata.
6. Per terminare l'esperimento, prelevare con attenzione il microelettrodi ionico selettivo dal tessuto e registrare qualsiasi deriva in potenzialità dal valore originale di zero che potrebbero essersi verificati durante i periodi di registrazione prolungati.
7. Rimuovere preparazione fetta dal bagno ed eseguire una seconda calibrazione del microelettrodo ione-selettivo.
   NOTA: Ciò è necessario perché la punta dell'elettrodo può intasarsi durante il suo movimento attraverso il tessuto. Pertanto, è essenziale assicurare che l'elettrodo ancora risponde correttamente alle variazioni di concentrazione di ioni. Gli esperimenti dovrebbero essere respinti se la risposta dell'elettrodo per un cambiamento di dieci volte della concentrazione di ioni è diminuita di oltre il 10%. Elettrodi sia di lavoro possono in linea di principio essere riutilizzati in diversi esperimenti. Questo è particolarmente vero per gli elettrodi concentrici, che può durare anche per diversi giorni. E 'fondamentale, tuttavia, che le procedure di taratura sono ritorbato prima e dopo ogni singolo esperimento per garantire il corretto funzionamento degli elettrodi.

Analisi 7. I dati

1. Per convertire la risposta di tensione dell'elettrodo ione-selettivo ai cambiamenti nella concentrazione di ioni extracellulare, prima convertire equazione 2 per determinare la variazione del potenziale _{di ioni} ΔV (mV) come segue (dimostrato qui per K ⁺ elettrodi -sensitive, procedimento analogo vale per ^Na + elettrodi -sensitive):

V _{K +:} variazioni del potenziale della canna valinomicina (mV)

s: slope Nernst

K ^+] _B: concentrazione basale di potassio (nel nostro caso 2,5 mm K ⁺⁾

K ^+] _o: variazioni di [K _^+] o durante l'esperimento

2. Calcolare la media aritmetica delle piste derivati ​​dalle trame logaritmiche singoli of la calibrazione prima e dopo l'esperimento (vedere la figura 5B, 6B, vedi punto 4.8) per recuperare "s".
3. Per calcolare i cambiamenti del [K _^+] o (Δ [K ^+] _o, in mm), riorganizzare equazione 3 a:

Risultati

Per monitorare [K ^+] _o e sue variazioni in risposta all'attività eccitatoria, un microelettrodo doppia canna potassio-selettivo è stato inserito nel radiatum strato dell'area CA1. Pochi minuti dopo impalamento, la canna ionoselettivo dell'elettrodo raggiunto una linea di base stabile (Figura 7A), corrispondente ad un [K ^+] _o di circa 2,8 mm, un valore prossimo al [K ^+] del ACSF utilizzato ( 2,5 mm). Bagno applicazione di glutammato 0,5 mM per 10 sec indotto un aumento reversibile [K ^+] _o di circa 4 mm, seguito da un undershoot al basale pari a ~ 0,7 mM (Figura 7A). L'abbassamento della concentrazione di glutammato a 0,4, 0,3, e 0,2 mM causato una corrispondente riduzione dell'ampiezza sia l'aumento transitorio e sottomodulazioni [K ^+] _o (Figura 7A).

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Figura 7. transitori potassio extracellulari in risposta all'attività eccitatoria. (A) [K ^+] _o transitori, consistente in un aumento seguito da un undershoot inferiore al valore basale, indotta da bagno applicazione di diverse concentrazioni di glutammato per 10 secondi come indicato. (B) L'influenza di una perfusione con bloccanti del recettore del glutammato (CNQX, 100 micron, APV, 100 micron) e tetrodotossina (TTX; 0,5 micron) su [K ^+] _o transienti indotta dalla applicazione bagno di glutammato 0.5 mm per 10 sec. (C) spontaneo [K ^+] _o transienti in presenza di 0 mg ²⁺ / BIC. Gli esperimenti riportati in AC sono stati eseguiti utilizzando elettrodi a doppia canna. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). Si prega di click qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Esperimenti precedenti hanno dimostrato che tali [K ^+] _o segnali glutammato indotto non risultano significativamente modificati durante l'applicazione di TTX, e sono quindi in gran parte indipendente sull'apertura dei canali del sodio voltaggio-dipendenti e l'azione neuronale potenziale di generazione di ^15,16. Per studiare i meccanismi alla base delle osservati [K ^+] _o cambiamenti in risposta al glutammato, abbiamo applicato bloccanti del recettore del glutammato, cioè CNQX (100 micron; bloccante dei recettori AMPA) e APV (100 micron; bloccante dei recettori NMDA) in presenza di TTX (0,5 mM). Al Bagno perfusione con questi bloccanti, glutammato indotta [K ^+] _o cambiamenti erano praticamente abolito, confermando la loro dipendenza l'apertura di canali recettori del glutammato ionotropi come riportato in precedenza (ad esempio, ^17; Figura 7B).

Per dimostrare ulteriormente tegli rilevanza di glutamatergico di eccitazione per la generazione di extracellulare [K ^+] i segnali, le fette sono stati perfusi con nominalmente ^Mg 2 + -free salina contenente 10 mM bicucullina methiodide (0mg ²⁺ / BIC). Questo allevia voltaggio-dipendenti Mg ²⁺ -block dei recettori NMDA e smorza l'inibizione bloccando i recettori GABA _A, provocando spontanea attività epilettiforme ricorrente nella rete (ad esempio, ^18,19). Come previsto ^20, spontanea, ricorrente [K _^+] o transienti, pari a circa 1,5 mm sono stati rilevati in 0mg ²⁺ / salina BIC (Figura 7C). Tra queste risposte, più piccolo [K ^+] _o transienti con una ampiezza media di circa 0,2 mM verificato (figura 7C).

In una seconda serie di esperimenti, abbiamo utilizzato [Na ^+] microelettrodi sensitive per determinare [Na ^+] _o cambiamenti evocati mediante l'applicazione diagonisti glutammato. Qui, abbiamo anche confrontato le caratteristiche di risposta di microelettrodi a due canne e concentriche che impiegano due diversi paradigmi di applicazione. [Na ^+] microelettrodi -sensitive erano posizionati nella radiatum strato a una profondità di circa 50 micron. Dopo una linea di base stabile è stato raggiunto, il glutammato agonista L-aspartato è stato applicato per bagno perfusione (10 mM, 120 sec, bagno perfusione a 2,5 ml / min). Come osservato in precedenza ^21, applicazione di aspartato ha causato una lenta diminuzione del [Na ^+] _o di circa 15 mm, che è durato circa 5 minuti e poi ha iniziato a recuperare di nuovo al basale (Figura 8A). In particolare, mentre le ampiezze di picco e cinetica delle [Na ^+] _o segnali determinati da entrambi gli elettrodi erano virtualmente identiche in queste condizioni, elettrodi concentrici mostravano una linea di base stabile e una maggiore rumorosità inferiore (Figura 8A).

Per verificare il r esponse caratteristiche dei diversi elettrodi sotto un paradigma un'applicazione più rapida, abbiamo glutammato pressione applicata attraverso una pipetta di vetro fine posizionata nella radiatum strato a una distanza di 20-40 micron dalla punta del microelettrodo ione-selettivo. Come previsto ^21, applicazione di glutammato (10 mM) per 200 ms causato un calo nella _o [Na ^+] (Figura 8B). Le ampiezze di picco del _o diminuzione [Na ^+] erano nello stesso intervallo per entrambi i tipi di elettrodi (doppia canna: 4,5 - 13.5 mM, n = 14; concentrici: 2.0 - 19.1 mM, n = 15). Tuttavia, in contrasto con i risultati ottenuti con lenta perfusione vasca (vedi sopra), non solo il rapporto segnale-rumore, ma anche l'andamento temporale dei [Na ^+] _o segnali rilevati dai due tipi di elettrodi differivano significativamente. Il tempo medio di picco è stato 3,5 secondi per la doppia canna e solo 1,3 secondi per i microelettrodi concentrici.

controparti ve_content "> Quindi, questi risultati dimostrano e confermano la cinetica di risposta più veloci del concentriche rispetto microelettrodi a doppia canna ^Na + -selettivo, (vedi Figura 6C e 8B), come è stato anche notato per Ca ^{2+ e} pH-selettivi ¹⁰ . A differenza del primo studio, in cui la stimolazione sinaptica breve scoppio è stata effettuata per evocare transitori ioni veloce sinapticamente-indotti, c'era solo una tendenza, ma nessuna differenza significativa nelle ampiezze di picco medie tra elettrodi concentrici e doppia canna con la nostra applicazione paradigma. Questo è probabilmente dovuto al fatto che la distanza della pipetta applicazione dalla punta del microelettrodo ionoselettivo variava di un fattore di due (20-40 micron), e di conseguenza, che la concentrazione glutammato massimo in corrispondenza della zona di destinazione non era la stessa in diversi esperimenti, ostacolando qualsiasi differenza esistente in ampiezze di picco.

(A) In alto tracce: Variazione della Voltage delle canne di riferimento _(VREF) di una doppia canna elettrodo (nero traccia tratteggiata) ed un elettrodo concentrica (grigio traccia) in risposta ai cambiamenti nella vasca di concentrazione ^di Na + ([Na ^+] _b) come indicato. Si noti che le risposte tensione di entrambi gli elettrodi sono praticamente identici. Tracce di fondo: variazioni della tensione della Na ⁺ -potential (V _{Na +)} di una doppia canna elettrodo (traccia nera) ed un elettrodo concentrica (grigio traccia) in risposta alle variazioni di [Na ^+] _b. (B) trame mezza logaritmiche del [Na ^+] _b rispetto al V _{Na +} di entrambi gli elettrodi. Trame lineare dei dati rivelano una pendenza di circa 48 mV per entrambi gli elettrodi. (C) Reazione del V _{Na +} di una doppia canna (trace nero) e un elettrodo concentrica (grigio trace) ad una variazione rapida della [Na ^+] _b da 152 mM a 70 mM. Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo concentrica è significativamente faster. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20).

Figura 8: transitori di sodio extracellulari rilevate tramite elettrodi a doppia canna e concentriche.
(A) i cambiamenti transitori _V ref e [Na ^+] _o indotta da bagno perfusione con aspartato 10 mm per 120 sec, come indicato dalla barra. Le tracce superiori mostrano una registrazione eseguita con un elettrodo a due canne, le tracce inferiori sono stati registrati utilizzando un elettrodo concentrica. (B) cambiamenti transitori V _{ref e} [Na ^+] _o indotta applicando pressione locale con glutammato 10 mM per 0,2 sec come indicato dalla freccia. Le tracce superiori mostrano una registrazione eseguita con un elettrodo a due canne, le tracce inferiori sono stati registrati utilizzando un elettrodo concentrica.Linee rosse tratteggiate rappresentano attacchi lineari del periodo tra l'inizio del segnale al massimo. Si noti che il tempo di risposta dell'elettrodo concentrica è significativamente più veloce in questa condizione. A scopo illustrativo, le tracce sono state levigate con un filtro Sawitzky-Golay (larghezza 20). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Liquido a base porta-elettrodi ionoselettivi sono stati impiegati con successo per decenni e per molti ioni, sensori altamente specifici sono disponibili ^22-26. Quando utilizzato nello spazio extracellulare (ECS) di preparazioni cerebrali vertebrati, si deve tenere presente, tuttavia, che questa è una tecnica molto invasiva: mentre la larghezza della ECS è solo circa 20-50 nm, il diametro di ione-selettivo microelettrodi è di circa 1 micron (elettrodi a doppia canna) o più grandi (elettrodi concentrici). Le punte dei microelettrodi ionoselettive saranno quindi non solo danneggiare il tessuto durante la loro impalamento del tessuto, ma anche ingrandire la ECS, favorendo una sottovalutazione dei transitori di ioni. Nonostante queste insidie, transitori ioni extracellulari in risposta all'attività neuronale sono notevolmente coerenti tra i diversi laboratori ^7,8, attestanti l'affidabilità di questo metodo.

Le prestazioni e l'idoneità di elettrodi ionoselettividipende dalla loro sensibilità e selettività, che è definita dal cocktail sensore ('ionoforo membrana liquida') utilizzato. Cocktail sensori contengono una speciale molecola carrier, per es valinomicina K ⁺ microelettrodi -selettivo che presenta un'elevata selettività per il potassio ^27. Nonostante, cross-reattività con altri ioni può avvenire e deve essere testato. Valinomicina presenta una significativa reattività crociata per ammonio, che deve essere considerato quando si interpretano i risultati (ad esempio, ^11,12). Inoltre, poiché la tensione di risposta dei ionofori segue un comportamento Nernst (cfr equazione 1), il rapporto segnale-rumore e soglia di rilevamento dipendono dalla concentrazione dello ione da misurare. Così, mentre piccolo [K ^+] _o transienti evocare grandi variazioni di tensione contro la bassa linea di base [K ^+] _o, piccolo [Na ^+] _o transitori sono molto più difficili da individuare contro hibasale gh [Na ^+] _o (vedere la figura 5 e 6).

Le prestazioni di elettrodi ionoselettivi è determinato anche dalla risoluzione temporale, che è largamente governata dalla sua costante di tempo elettrica. Quest'ultima è determinata principalmente dalla resistenza assiale del sensore, e dalla capacità distribuita lungo la lunghezza della pipetta, tra le soluzioni interne e il fluido esterno. Nella configurazione a doppia canna, la resistenza è alta, a causa della lunga colonna di sensore ione ripiena. Per un dato dielettrico isolante (in questo caso vetro borosilicato), la capacità è governato dallo spessore dielettrico. In elettrodi a doppia canna, la larghezza dielettrico equivale alla parete di vetro della pipetta. Quando il vetro si assottiglia in prossimità della punta, la larghezza dielettrico cade, e la capacità aumenta. Questi fattori si combinano per produrre elettrodi con tempi di risposta che vanno da alcune centinaia di millisecondi a diversesecondi, come questi fattori sono molteplici.

Un importante vantaggio del disegno concentrico è che sia la resistenza assiale e la capacità al bagno sono notevolmente ridotte. I derivatori pipetta concentrici maggior parte della resistenza dello scambiatore di ioni ripiena, lasciando solo un residuo negli ultimi micrometri prima della punta. Inoltre, la soluzione di riempimento all'interno della pipetta concentrica è fisicamente distanziato dal bagno, separato dallo spessore di due pareti di vetro, riducendo notevolmente la capacità. Come illustrato in precedenza ^10, l'effetto combinato della ridotta resistenza e capacità è un miglioramento della risoluzione temporale di due ordini di grandezza. In caso di Ca ²⁺ concentrici e pH microelettrodi, 90% i tempi di risposta erano partire da 10-20 msec ^10. Un vantaggio relativo del disegno concentrica è il livello di rumore inferiore (vedi figura 8). Grazie alla resistenza notevolmente ridotto, transitori di tensione da qualsiasi ambienrumore t sono ridotti al minimo. Inoltre, il recupero da tali transitori è rapido, a causa della costante di tempo veloce. Tali manufatti sono quindi piccolo e veloce, e hanno un effetto meno dirompente sulle registrazioni fisiologiche (vedi Figura 8).

Ci sono anche degli svantaggi della tecnica concentrica. Innanzitutto, il loro assemblaggio è più complesso e richiede tempo. Un secondo inconveniente è la necessità di posizionare un microelettrodo riferimento separato con la punta, che comporta l'utilizzo della propria micromanipolatore separato o un doppio manipolatore specializzata. Infine, microelettrodi doppia canna possono essere estesi ad un disegno tripla canna, consentendo rilevamento di due specie ioniche differenti allo stesso tempo ^28, che non è possibile per elettrodi concentrici.

Insidie ​​più comuni

Silanizzazione inefficiente.

Il passo più importante, e ostacolo principale nella fabbricazione di qualsiasi liquido-senso basate microelettrodo ionoselettivo è la procedura silanizzazione. Quando gli elettrodi non riescono a rispondere ai cambiamenti nella concentrazione di ioni specifici, o di rispondere con una risposta sub-Nernst (vale a dire, ben meno di 58 mV per dieci volte differenza di concentrazione), scarsa efficacia di silanizzazione è in genere la causa. Nella nostra esperienza, questo può verificarsi se l'umidità atmosferica è troppo alto, o troppo basso, tipico delle condizioni piena estate o inverno, rispettivamente. Se è fattibile per esercitare un certo controllo dell'umidità ambientale, questi problemi possono essere superati.

Resistenza dell'elettrodo è troppo alta.

Se necessario, la resistenza della canna sensibile agli ioni può essere ridotta di bisellatura. A tal fine, esporre la sua punta a un forte getto di abrasivo sospeso in acqua per un paio di secondi. Questo farà sì che la punta upmost per rompere e abbassare la resistenza al valore desiderato.

Ponti salini.

Saleponti tra le botti di ioni e di riferimento determinano elettrodi scarsamente o niente di rispondere e possono quindi anche confondere notevolmente le loro prestazioni nella calibrazione. Come accennato in precedenza (vedi punto 1.6.), Questo è soprattutto un problema quando si sceglie a doppia canna di vetro theta, ma è un evento raro quando si utilizza l'offset, tecnica botte contorto qui descritto.

Con la facilità di fabbricazione in mente, il design a doppia canna originale di Lux ²⁹ può essere spesso utilizzato proficuamente. Questo metodo utilizza pre-riempimento delle botti di ioni e di riferimento con soluzioni saline, un'esposizione veloce per una soluzione di silano con la sua aspirazione e l'espulsione dalla punta, seguendo per incorporazione di scambiatore ionico, anche tramite la punta (vedi ^30,31) . Questi elettrodi possono essere realizzati in circa 10 minuti, ma il loro formato di punta è in genere 4 micron o più e sono più inclini a fallire nel corso di un esperimento. Al contrario, i metodi silanizzazione che comportano l'esposizione al vapore silano e caloreing può produrre elettrodi con punte più piccoli che durano giorni, e, a volte settimane.

Nel loro insieme, ci sono diversi protocolli e approcci su come prepararsi microelettrodi ionoselettive. Qui, abbiamo descritto due principali procedure per la fabbricazione di microelettrodi due canne e concentrici intrecciati che funzionano bene e affidabile nei nostri laboratori, con un tasso di successo complessivo prossimo al 100%. È importante sottolineare che queste tecniche saranno trasferibili alla misurazione di altri ioni specie, tra cui il pH o di calcio, e sarà anche essere applicabile ad altri preparati che il cervello, comprese le cavità piene di liquido o di fluidi in genere. Ultimo, ma non meno importante, microelettrodi ionoselettive consentono la determinazione delle concentrazioni di ioni all'interno delle cellule. A causa della loro relativamente grandi dimensioni punta (~ 1 micron), tale volontà, però, sarà possibile solo in cellule con un corpo a grandi cellule, quali ad esempio, ha trovato in preparati invertebrati ^28,32.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Abrasivo	MicroPolish	Buehler GmbH	Disciolto in
capillari in vetro borosilicato	1405059	Hilgenberg	Pipetta di applicazione; 75 mm x 2 mm, spessore della parete 0,3 mm
Capillari in vetro borosilicato con filamento	GC 150 F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	Per il sensore di microelettrodi a doppia canna
Capillari in vetro borosilicato con filamento	GC100-F-15	Clark Electromedical Instruments, Harvard Apparatus	Per il riferimento di microelettrodi a doppia canna
Capillari in vetro borosilicato con filamento	GB-200TF-15	Canale	esterno concentrico. D.E. 2,0 mm
Capillari in vetro borosilicato con filamento	GB-120TF-10	Science Products	Canale interno concentrico. D.E. 1,2 mm
Digidata	1322A	Axon Instruments Amplificatore
elettrometrico con headstage		Su misura	Rin = 10 TΩ e Ibias=50 fA-1pA (disponibili in commercio  alternative: es.g. Dagan IX2-700, con headstage (resistenza di feedback da 10 Gig) o EPMS-07, NPI, Tamm, Germania)
Camera sperimentale		Su misura	Disponibile in commercio da es.   Warner Instruments, Stati Uniti;   Scientifica, Regno Unito
Fornace		Heraeus	Deve rimanere costante a 200 gradi C
Cera dura appiccicosa / cera dentale	Deiberit 502	Siladent Dr. Boehme & Schoeps GmbH
Piastra		Su misura	Deve rimanere costante a 40 gradi C
Porta microelettrodi in plexiglas		Su misura	Doppio cilindro: O.D.   capillari 1,5 mm, concentrici: O.D.  capillari 2 mm
Micromanipolatore		Leitz
Micromanipolatore	MD4R	Leica
Stereomicroscopio	M205C	Leica
Objective	Plan 0.8xLWD	Estrattore per
	Modello PP-830	Narishige	Microelettrodi concentrici
Estrattore per pipette	Modello P-97	Sutter Instruments	Sensore di microelettrodi concentrici
Sistema pneumatico di espulsione dei farmaci	Picospritzter Tipo II	General Valve TM Corporation
Stadio a coda di rondine da viaggio	DT 25/M	Thorlabs
Colla bicomponente	Araldite	Huntsman advanced materials GmbH	Si può anche usare una piccola striscia di foglio di alluminio per incollare i capillari insieme.
Silverwire	99,9%	Affettatrice / Vibratomo Wieland Edelmetalle
	650 V	Thermo Scientific
Software	AxoScope 8.1	Estrattore verticale Axon Instruments
	Tipo PE-2	Narishige Scientific Instruments	Con un mandrino girevole per microelettrodi a doppia canna
x/y stadio traslazionale		Su misura
1(S),9(R)-(−)-Bicucullina metioduro Sigma	aldrich	14343	Antagonista competitivo dei recettori GABAA (fotosensibili); ATTENZIONE antagonista tossico
CNQX	Sigma aldrich	C-127	AMPA/kainato; ATTENZIONE tossico
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma aldrich	D5879
DL-AP5	Alfa Aesar	J64210	antagonista del recettore NMDA; ATTENZIONE
Esametiltililazano tossico (HMDS)	Sigma aldrich	440191	ATTENZIONE: Infiammabile, tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione) e corrosivo per i metalli e la pelle
Acido L-aspartico	Sigma aldrich	A9256	Attiva NMDA e non-NMDA e EAAT Acido L-glutammico
sale monosodico idrato	Sigma aldrich	G1626	Attiva NMDA-R, AMPA-R, QA-R e KA-R),  mGluR e EAAT
Ionoforo di potassio I - cocktail B	Fluka	60403	A base di valinomicina; ATTENZIONE tossico
Sodio ionoforo II - cocktail A	Fluka	71178	Basato su ETH 157
TTX	Ascent Scientific	Asc-055	Inibitore dei canali Na+ voltaggio-dipendenti; ATTENZIONE acqua tossica
, ultra pura	Sigma aldrich	W3500