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Articolo metodologico

L'utilizzo di biosensori enzimatica per quantificare endogena ATP o H

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DOI:

10.3791/53059

⸱

12 ottobre 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

I biosensori a microelettrodi enzimatici consentono misurazioni in tempo reale della segnalazione cellulare extracellulare in concentrazioni biologicamente rilevanti. I seguenti protocolli estendono le applicazioni dei biosensori alla rilevazione ex vivo e in vivo di ATP e H2O2 nel rene.

Abstract

Biosensori microelettrodi enzimatici sono stati ampiamente utilizzati per misurare il segnale extracellulare in tempo reale. La maggior parte del loro uso è stato limitato a fettine di cervello e colture cellulari neuronali. Recentemente, questa tecnologia è stata applicata a tutto organi. I progressi nella progettazione dei sensori hanno reso possibile la misurazione di segnalazione delle cellule nel sangue-perfuso nei reni vivo. Elencare i presenti protocolli i passi necessari per misurare ATP e H 2 O 2 segnalazione nell'interstizio rene di ratto. Due disegni sensore separato sono utilizzati per la ex vivo e in vivo protocolli. Entrambi i tipi di sensori sono rivestiti con un biolayer enzimatico sottile sopra di uno strato permselettività dare rapida risposta, biosensori sensibili e selettivi. Lo strato permselettività protegge il segnale dagli interferenti in tessuto biologico, e lo strato enzimatica utilizza la reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-phosphate ossidasi in presenza di ATP per produrre H 2 O 2. La serie di sensori utilizzati per gli studi ex vivo ulteriormente rilevato analita mediante ossidazione di H 2 O 2 in un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. I sensori per gli studi in vivo sono invece basati sulla riduzione di H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. Modifiche concentrazione finale vengono rilevati da amperometria tempo reale seguito da taratura a concentrazioni note di analita. Inoltre, la specificità del segnale amperometrico può essere confermato con l'aggiunta di enzimi quali catalasi e apyrase che rompono H 2 O 2 e ATP corrispondentemente. Questi sensori anche dipendono fortemente calibrazioni accurate prima e dopo ogni esperimento. I due protocolli seguenti stabiliscono lo studio di rilevamento in tempo reale di ATP e H 2O 2 in tessuti renali, e può essere ulteriormente modificato per estendere il metodo descritto per l'uso in altre preparazioni biologiche o organi interi.

Introduzione

Biosensori microelettrodi enzimatico (anche riferimento come sensori nel presente manoscritto) sono stati uno strumento prezioso per lo studio dei processi di segnalazione dinamici nelle cellule e nei tessuti viventi. I sensori offrono una maggiore risoluzione temporale e spaziale delle molecole di segnalazione cellulare in concentrazioni biologicamente rilevanti. Invece di campionamento e analizzare fluidi extracellulari effettuate ad intervalli più lunghi periodi di tempo, questi sensori rispondono più velocemente loro enzimi reagiscono all'analita, producendo misurazioni in tempo reale 1,2. Rilevamento rapido delle concentrazioni interstiziali dei fattori autocrini e paracrini, come purine o perossido di idrogeno, e le dinamiche del loro rilascio può essere utilizzato per stabilire un profilo per gli effetti dei farmaci in condizioni normali e patologiche 3. Attualmente, la maggior parte delle applicazioni che utilizzano sensori sono stati in fettine di tessuto cerebrale e colture cellulari 4-10. I protocolli descritti in questo scopo manoscrittostabilire i mezzi per misurare con precisione le concentrazioni in tempo reale di analiti nei reni interi.

I seguenti protocolli sono stati sviluppati per studiare ATP interstiziale e H 2 O 2 segnalazione nei reni. In ambiente nativo del rene, l'ATP extracellulare viene rapidamente catabolizzata da ectonucleotidases endogeni nei suoi derivati ​​(ADP, AMP e adenosina). I sensori utilizzati sono altamente selettivi in ATP su altri purine o ATP prodotti di degradazione 11. Questo offre un grande vantaggio in quanto permette il monitoraggio accurato delle concentrazioni costanti e dinamiche di rilascio di ATP e la sua funzione di segnalazione. Concentrazione di ATP interstiziale viene misurata utilizzando la combinazione di due microelettrodi, un sensore di ATP e un sensore Null. Il sensore Null in combinazione con applicazioni catalasi è in grado di rilevare interstiziale H 2 O 2 12 concentrazioni. I seguenti protocolli utilizzano due diversi disegni di sensors che presentano caratteristiche ottimali sia per ex vivo o in vivo. in applicazioni

Entrambi i modelli sono basati sulla reazione catalitica sequenziale di glicerolo chinasi e glicerolo-3-fosfato ossidasi contenuta in uno strato sensore enzimatica ed è guidata dalla presenza di ATP. Nella serie di sensori utilizzati negli studi ex vivo, H 2 O 2, il prodotto finale di reazione enzimatica, viene rilevato mediante ossidazione su un platino / iridio (Pt-Ir) elettrodo a filo. Sensori per studi in vivo sono invece basati sulla riduzione H 2 O 2 in un mediatore rivestito elettrodo d'oro progettata per il tessuto sangue perfuso. In figura 1 è uno schema di entrambi i protocolli descritti in questo manoscritto. Il sensore Null è identico al suo sensore ATP corrispondente tranne che manca degli enzimi legati. Pertanto, in aggiunta al rilevamento di H 2 O 2 con l'enzima catalasi, il sensore mea NullSures interferenze aspecifiche. Concentrazioni di ATP sono calcolati sottraendo il Null rilevato interferenze aspecifiche e sfondo H 2 O 2 dal segnale sensore ATP. Diversi sensori sono anche disponibili in commercio per individuare altri analiti tra cui l'adenosina, ionosine, ipoxantina, acetilcolina, colina, glutammato, glucosio, lattato, d-serina per applicazioni ex vivo o adenosina, ionosine, e ipoxantina in vivo se abbinato con la corrispondente Null sensore.

La capacità del sensore di rilevare esattamente analiti dipende il corretto pre e post-13 calibrazioni. Questo assicura che l'analisi rappresenta la deriva della sensibilità del sensore che si verifica durante l'uso in tessuti biologici. Il sensore contiene un deposito di glicerolo che viene utilizzato come reagente nelle reazioni enzimatiche sensore. Se il sensore non è usato in soluzioni contenenti glicerolo bagno, laverà nel tempo. Shorter rvolte ecording sono poi necessarie per minimizzare la deriva del sensore. Inoltre sensore incrostazione da proteasi endogene e frammenti di proteine ​​può notevolmente diminuire la sensibilità dei sensori 14.

Il presente manoscritto stabilisce l'uso di biosensori microelettrodo enzimatiche per ex vivo e in vivo preparazioni renali. Real-time analita quantificazione fornisce dettagli senza precedenti di segnalazione cellulare che possono rivelare nuove informazioni sui meccanismi delle malattie renali e agenti farmacologici.

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Protocollo

Le seguenti procedure sugli animali aderito alla guida NIH per la cura e l'uso di animali da laboratorio. L'approvazione preventiva è stato ottenuto dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC).
NOTA: Revisione delle istruzioni del produttore del sensore dovrebbe essere fatto durante la progettazione dell'esperimento e prima del loro utilizzo. Seguendo queste istruzioni produrrà risultati ottimali quando si utilizzano i sensori.

1. Calibrazione sensore

  1. Preparare soluzioni fresche prima dell'inizio dell'esperimento.
  2. Creare tampone A contenente 10 mM tampone napi, NaCl 100 mM, 1 mM MgCl 2, e glicerolo 2 mM. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Conservare a 2-8 ° C.
  3. Usando una concentrazione di ATP magazzino (100 mm) conservati a -20 ° C, creare una nuova soluzione di calibrazione 10 mM ATP con l'aggiunta di 10 microlitri magazzino a 90 ml di tampone A.
  4. Reidratare il sensore ATP posizionando la punta (Figura 2) in tegli camera di reidratazione contenente tampone A per almeno 10 minuti a 2-8 ° C.
    NOTA: Dopo la reidratazione, i sensori non deve essere esposto all'aria per più di 20 secondi o la sensibilità del sensore può essere ridotta. Se si prevedono lunghe esposizioni all'aria, immergere il sensore per breve tempo in una soluzione di glicerolo. I sensori possono essere utilizzati per diversi esperimenti, ma questi devono avvenire lo stesso giorno come sensore di reidratazione. I sensori possono essere memorizzati nella camera reidratazione con tampone A fino a 24 ore.
  5. Accendere potenziostato doppio canale (figura 3) e avviare il software di sistema di registrazione.
  6. Preparare una camera di taratura con 3 ml di tampone A. Inserire l'elettrodo di riferimento nella camera di calibrazione. Prendere ogni sensore dalla camera di reidratazione, quindi collegarlo al manipolatore e inserirla nella soluzione di camera di taratura.
    NOTA: Utilizzare un siliconato capsula di Petri standard come una camera di taratura. Effettuare tutte le calibrazioni e studies in una gabbia di Faraday su un laboratorio tavolo aria ottimizzata per ridurre il rumore del segnale durante le registrazioni Amperometry (Figura 4). Le calibrazioni sono meglio farlo il più vicino l'inizio della raccolta dei dati il ​​più possibile. Per le applicazioni in vivo il tempo ottimale per la taratura durante il periodo di animale recupero post-operatorio.
  7. Ex vivo di calibrazione
    1. Eseguire voltammetria ciclica nella camera di calibrazione pedalando sensori da -500 mV a +500 mV ad una velocità di 100 mV / sec per 10 cicli. Questo migliora notevolmente la sensibilità dei sensori. Vedere la Figura 5 per le tracce osservate dai 10 cicli.
    2. Polarizzare sensori al 600 mV dopo l'ultimo ciclo. La corrente del sensore decadrà a un asintoto. Una lettura stabile si ottiene dopo un minimo di 5 min. Registrare la lettura dello zero.
  8. Calibrazione del sensore vivo in
    1. Non eseguire la voltammetria ciclica sul senso in vivors. Invece, polarizzare il sensore nella camera di calibrazione per 30 sec a +500 mV. Quindi impostare il potenziostato a 0 mV e consentire al corrente del sensore a salire a un asintoto. La corrente del sensore ci vorranno almeno 2 minuti per asintoto. Registrare la lettura dello zero.
  9. Consecutivamente aggiungere set quantità di soluzione di ATP nella camera di produrre una linea di taratura che comprende un campo di rilevamento desiderata. La soluzione ATP produce un forte picco nel segnale del sensore inizialmente, seguito da un decadimento come ATP diffonde uniformemente in tutta la camera. Valori segnale di registrazione una volta che il livello del segnale è stabilizzata dopo ogni aggiunta di ATP. Figure 6A e 7 mostrano tracce e suggerito concentrazioni di ATP sia ex vivo e in vivo, rispettivamente.
    NOTA: E 'importante confermare la selettività degli elettrodi usando spazzini degli analiti. Il presente protocollo utilizzato apyrase per testare la specificità del sensore ATP e catalasi per l'H 2 O 2 segnale (figure 6B). Se i farmaci sono da somministrare, misure della loro reattività con i sensori devono essere determinati prima dello studio.
  10. Aggiungere 3 ml di apyrase da uno stock di 2 mg / ml (89 UN / mg) per verificare la specificità del sensore ATP (la corrente prodotta dall'applicazione ATP dovrebbe ridurre al livello zero (Figura 7).
  11. Aggiungere 3 ml di catalasi da uno stock di 2mg / ml (100 UN / mg) per testare la specificità del sensore nullo (la corrente prodotta da H 2 O 2 applicazione dovrebbe ridurre la lettura zero).

2. Chirurgia Animale Per Gli Studi Sensor

  1. Intervento chirurgico per ex vivo
    1. Anestetizzare l'animale sperimentale con isoflurano (5% di induzione, 1,5-2,5% manutenzione) / medico di grado O 2 o altro metodo riconosciuto. 15 '12 Gli animali devono essere continuamente monitorate al fine di garantire un adeguato livello di anestesia. Stin grado respiratorio reazione votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
      Nota: Euthanize l'animale secondo protocolli IACUC approvati. Al termine di tutte le procedure non sopravvivenza eutanasia animali profondamente anestetizzati da toracotomia inducendo pneumotorace per garantire la scomparsa umana dell'animale 12.
    2. Posizionare il ratto su un tavolo operatorio temperatura controllata in posizione supina. Pur mantenendo una profondità adeguata anestetico, fare una incisione mediana di circa 5 cm in linea con il rene sinistro ed esporre l'aorta addominale distale.
    3. Avvolgere una legatura attorno al celiaca e arterie mesenterica superiore, e l'aorta addominale sopra queste arterie, ma non legare. Avvolgere due legature intorno all'aorta addominale al di sotto delle arterie renali.
    4. Bloccare l'aorta addominale sopra le legature. Legare la legatura inferiore. Cateterizzare l'aorta addominale con tubo in polietilene (PE50). Fissare il catetere con la seconda legatura dell'aorta.
    5. Rimuovere il morsetto e legare le mesenterica e celiaci arterie. Profumato il rene a 6 ml / min con soluzione salina bilanciata Hanks a temperatura ambiente per 2-3 minuti fino a quando il rene è completamente imbiancato.
    6. Asportare il rene ed il catetere, connessa porzione dell'aorta. Posizionare il rene in una piastra di Petri da 3 ml riempita di soluzione del bagno.
      Nota: protocollo esperimento può essere eseguita a temperatura ambiente. La soluzione del bagno contiene in mM: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, 1 CaCl 2, 10 HEPES, pH 7,35 regolato con NaOH.
  2. Intervento chirurgico per in vivo
    1. Anestetizzare il topo utilizzando protocolli IACUC approvati. Per l'analisi in vivo anestetizzare i ratti con ketamina (20 mg / kg IM) e inactin (50 mg / kg ip). Gli animali devono essere costantemente monitorati per garantire un adeguato livello di anestesia. Una reazione respiratoria stabile votare e punta pizzico vengono utilizzati per confermare l'anestesia corretta.
    2. Dopo adeguata profondità dell'anestesia è ottenereed, posizionare il ratto in posizione supina su una superficie a terra temperatura controllata situata sul tavolo dell'aria. La superficie deve essere preriscaldato e mantenuta a 36 ° C.
    3. Pur mantenendo un'adeguata profondità dell'anestesia, fare una incisione mediana circa 5 cm in linea con il rene.
    4. Utilizzare una sutura per deviare e ancorare il tessuto cutaneo e sottocutaneo in modo che l'intero organo è visibile. Posizionare il rene in una tazza rene per ridurre al minimo eventuali artefatti da movimento.
    5. Utilizzare infusione IV del 2% BSA: 0,9% NaCl a 1 ml / 100 g / h attraverso la vena giugulare di mantenere il volume del sangue. Cannulare entrambi gli ureteri per la raccolta delle urine. Posizionare le fasce intorno mesenterici e celiaci arterie superiori e l'aorta distale per la manipolazione della pressione di perfusione renale (Figure 10A).
    6. Se è richiesta l'applicazione di agenti farmacologici durante gli esperimenti in vivo, l'inserimento di un catetere interstiziale è raccomandato (Figure 10B ).

Setup 3. Acquisizione Dati

  1. Aprire il programma di acquisizione dati e impostare la polarità sia ex vivo e in vivo per anodica positiva. Impostare il programma per salvare i dati come codice ASCII.
  2. Posizionare i micromanipolatori per rapido inserimento dei sensori nelle reni.
    NOTA: In alternativa, utilizzare una sonda fittizia attaccato al micromanipolatore per contribuire a realizzare il posizionamento desiderato di sensori.
  3. Ex vivo acquisizione dati
    1. Profumato rene con soluzione del bagno (da 2.1.6) tramite l'aorta cannulata a una velocità costante di 650 microlitri / min. Utilizzando le forbici chirurgiche, rimuovere con attenzione la capsula renale, che è necessaria per l'inserimento del sensore.
    2. Fissare il rene con elastici legati sopra il rene e collegati al piatto siliconata con perni.
    3. Posizionare l'elettrodo di riferimento vicino al rene nella capsula di Petri con la punta sommersala soluzione tampone.
  4. In acquisizione dei dati in vivo
    1. Posizionare il rene in una tazza rene. A seconda del ceppo e l'età dell'animale utilizzare una dimensione di coppa che contiene il rene liberamente. Figura 8 mostra due dimensioni di tazze renali. Tazze simili sono utilizzati per approcci fisiologici differenti focalizzati sull'analisi della funzione renale come micropuntura ecc 16.
      Nota: La posizione della coppa rene è fondamentale per eliminare il rumore meccanico prodotto dalla respirazione animale, ma non dovrebbe interferire con o bloccare perfusione renale o flusso di urina.
    2. Lasciare 45 minuti di tempo di recupero prima di eseguire la raccolta dei dati.
    3. Utilizzando un ago 26-30G, forare foratura nella posizione desiderata e la profondità del sensore nel rene. Asciugare il foro superficie per rimuovere il sangue trasudato. Aggiungere la soluzione di glicerolo alla superficie del rene. Questo consentirà di evitare la superficie rene si secchi durante l'esperimento.
    4. Togliere il primo sensore dalla camera di reidratazione e collegarlo al micromanipolatore. Rapidamente, entro 20 secondi, inserire l'elettrodo nel foro appena creata nel rene. Ripetere i passaggi 3,5-3,9 per il sensore nullo.
    5. Inserire l'elettrodo di riferimento nel rene, circa 1 cm dal dai sensori.
  5. Accendere potenziostato e attivare il programma di registrazione sul computer. La Figura 9 mostra la configurazione finale del rene ex vivo di acquisizione dati. La figura 10 mostra la configurazione finale del rene in vivo acquisizione dati con un catetere inserito.

Analisi 4. I dati

  1. Importare il file di dati ASCII in origine o qualsiasi altro software simile.
  2. Relazione corrente Concentrazione
    1. Utilizzare la funzione di adattamento / estrapolare lineare per costruire una concentrazione lineare (asse x) di corrente (asse y) relazione per l'ATP o H 2 O 2 punti di taratura (figure 6 e 7).
      Linea fit lineare: y = mx + b
  3. Equiparare la corrente alla concentrazione
  4. Sottrarre le tracce misurati del sensore nullo da quelli del sensore ATP per ottenere la corrente attuale prodotta da ATP intracellulare.
  5. Convertire i valori ATP pA ottenuti dalla amperometria a Nm utilizzando l'equazione di taratura descritto in 4.2.1. Determinare la concentrazione della traccia dati sottratto del sensore ATP importando ogni corrente regolata nel valore "x" e risolvendo per y (la concentrazione di analita).
  6. Analogamente, calcolare la concentrazione di H 2 O 2 dalla sua equazione di taratura se necessario.

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Risultati

Il disegno del microelettrodo biosensore enzimatico consente il rilevamento in tempo reale di analiti nei reni interi. Il disegno esperimento generale sia ex vivo o in vivo è illustrato in Figura 1 .I sensori utilizzati e le procedure chirurgiche variano a seconda se lo studio è ex vivo o in vivo.

Per ottenere risultati riproducibili, pre accurate calibrazioni e post sono critici. Figura 6A mostra una traccia rappresentati...

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Discussione

Gli attuali protocolli sono stati sviluppati per fornire una maggiore risoluzione temporale e spaziale di ATP e H 2 O 2 di segnalazione per ex vivo isolati, perfusione e in vivo reni sangue-perfusione. Le differenze tra i protocolli ei sensori utilizzati qui garantiscono l'acquisizione dei dati ottimale sia per gli agenti farmacologici o studi fisiologici. I protocolli sono costituiti da 1) calibrazione del sensore, 2) intervento chirurgico, 3) l'installazione di acquisizi...

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Dichiarazioni

Sensori per la registrazione video di questo manoscritto sono stati forniti da Sarissa biomedica Limited (Coventry, UK).

Ringraziamenti

Apprezziamo Sarissa biomedica per il loro lavoro nello sviluppo dei sensori utilizzati nel presente manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Heart, Lung, and Blood Institute concede HL108880 (A. Staruschenko), HL 116264 (A. Cowley) e HL 122.662 (A. Staruschenko e A. Cowley), un progetto finanziato dal Medical College of commissione per gli affari di ricerca Wisconsin # 9306830 (O. Palygin) e avanzando un sano Wisconsin Programma di Ricerca e Formazione # 9.520.217, e il giovane Investigator Grant del National Kidney Foundation (O. Palygin).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit sensoreSarissa BiomedicalSBK-ATP-05-125Il kit include flacone di conservazione, camera di reidratazione, elettrodi ed elettrodi di riferimento. Il kit include anche la scelta dei sensori da parte dell'utente.
Sarissaprobe ATP Biosensor 125 μ mSarissa BiomedicalSBS-ATP-05-125conservare a 2-8 oC prima dell'uso
Sarissagold ATP Biosensor 50 μ mSarissa BiomedicalSGS-ATP-10-50conservare a 2-8 oC prima dell'uso
Sarissaprobe null sensor 125 μ mSarissa BiomedicalSBS-NUL-20-125conservare a 2-8 oC prima dell'uso
Sarissagold sensore nullo 50 μ mSarissa BiomedicalSGS-NUL-10-50negozio a 2-8 oC prima dell'uso
Sarissaprobe ATP ManualeSarissa Biomedicalhttp://www.sarissa-biomedical.com/media/31563/instructions-atp.pdf
gabbia di Faraday Potenziostato a doppio canale TMC
Digi-IvyDY2021Gabbia di Faraday di tipo II
Programma di acquisizione datiDigi-IvyDY2000
Pompa di perfusioneRazel Scientific InstrumentsModello R99E
Illuminatore a fibre otticheMicromanipolatore SchottACE 1
NarishigeMM-3
supporto magnetico per micromanipolatoreNarishigeGJ-8
tavolo d'ariaTMC63-500
ventilatore isofluranoLEI MedicalM2000
piastra di Petri da 3 mlScientific
Santa Cruz26-30 G
pernidi dissezione standard
catetereTubo in polietilene (PE50)
colla tissutale per catetereVetbond1469SB
suturaLookSP117
elasticiqualsiasi elastico largo 2-4 mm
silicone MomentiveRTV-615 Clear 1#
clampFine Science Tools18052-03
di dissezione standardIl kit dovrebbe includere bisturi e sissori di dissezione 
Coppettarenale Di prodotti
chimici standardSigma-Aldrich
ATPSigma-AldrichA6559-25UMO100 mM ATP soluzione
perossido di idrogenoSigma-Aldrich216763
gliceroloSigma-AldrichG9012
ApirasiSigma-AldrichA7646
CatalasiSigma-AldrichC40
isofluranoClipper10250
inactinaSigma-AldrichT133
ketaminaClipper2010012
Hanks soluzione salina bilanciata Gibco14025092
Fisher ago S3358OA kit di propria progettazione

Riferimenti

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