Articolo metodologico

Generazione e analisi quantitativa della pulsato a bassa frequenza ad ultrasuoni per determinare la sensibilità di Sonic di non trattata e trattata cellule neoplastiche

11.5K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/53060

⸱

22 luglio 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

In questo articolo

Sommario

Il danno selettivo delle cellule leucemiche umane può essere ottenuto attraverso un nuovo approccio di applicazione di ultrasuoni a bassa frequenza sia con che senza pretrattamento chemioterapico di cellule leucemiche ed ematopoietiche normali.

Abstract

Gli ultrasuoni a bassa frequenza nell'intervallo da 20 a 60 kHz sono una nuova modalità fisica con cui indurre la lisi cellulare selettiva e la morte nelle cellule neoplastiche. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato in combinazione con agenti specializzati noti come sonosensibilizzatori per aumentare l'entità del danno preferenziale esercitato dagli ultrasuoni contro le cellule neoplastiche, un approccio denominato terapia sonodinamica (SDT). Viene presentata la metodologia per la generazione e l'applicazione di ultrasuoni a bassa frequenza in un contesto preclinico in vitro per dimostrare che è possibile ottenere una distruzione cellulare riproducibile al fine di esaminare e confrontare gli effetti della sonicazione su cellule neoplastiche e normali. Ciò offre un mezzo con cui sonicare in modo affidabile le cellule neoplastiche al livello di coerenza richiesto per la valutazione terapeutica preclinica. Inoltre, vengono discussi gli effetti degli agenti che deplevano il colesterolo e che agiscono verso il citoscheletro sul potenziamento della sensibilità ultrasonica nelle cellule neoplastiche al fine di elaborare meccanismi d'azione che favoriscono approcci sonochemioterapici.

Introduzione

Gli ultrasuoni si riferiscono a qualsiasi onda di pressione sonora oscillante con una frequenza superiore al limite superiore delle capacità uditive umane (~ 20 kHz)1. Gli ultrasuoni a bassa frequenza nell'intervallo 20-60 kHz sono stati utilizzati in laboratorio come mezzo per generare emulsioni, preparare campioni cellulari per l'estrazione dell'acido nucleico, per la disgregazione dei tessuti e per una varietà di altri test. L'utilità degli ultrasuoni a bassa frequenza è stata estesa anche all'ambiente industriale per la saldatura, la pulizia di vari materiali e la lavorazione dei materiali. I generatori di ultrasuoni disponibili in commercio sono disponibili in frequenze che vanno da 18 a 60 kHz e in potenze a fondo scala da 100 a 1.200 W.

Sebbene l'ecografia sia stata a lungo utilizzata in ambito clinico per l'imaging diagnostico, è stata applicata come modalità terapeutica solo di recente. Gli ultrasuoni ≥1 MHz sono in grado di interrompere in modo sicuro i calcoli urinari (calcoli renali) e biliari (calcoli nella cistifellea o nel fegato) nei pazienti per ridurre i sintomi2,3. Questo approccio, noto come litotrissia extracorporea ad onde d'urto (ESWL), è ora ampiamente applicato in clinica (più di un milione di pazienti vengono trattati ogni anno con ESWL solo negli Stati Uniti4) e offre una modalità con cui rompere in modo non invasivo i calcoli con danni collaterali minimi attraverso l'uso di impulsi acustici ad alta intensità focalizzati applicati esternamente2-4.

A causa delle forze di taglio dirette uniche, nonché delle bolle di cavitazione generate dagli ultrasuoni ad alta intensità, queste metodologie sono state esaminate nella terapia del cancro per il trattamento del carcinoma prostatico resistente alla castrazione e dell'adenocarcinoma pancreatico in un approccio noto come ultrasuoni focalizzati ad alta intensità (HIFU)5-8. In modo molto simile all'ESWL, HIFU utilizza più fasci di ultrasuoni e li focalizza su un'area focale selezionata per generare temperature di 60 °C o superiori attraverso l'uso di energia acustica, inducendo necrosi coagulativa nel tessuto bersaglio5. Sebbene esistano attualmente altre modalità di termoablazione (ablazione con radiofrequenza e ablazione a microonde), l'HIFU offre un netto vantaggio rispetto a questi metodi in quanto è l'unica modalità ipertermica non invasiva5. HIFU ha ottenuto risultati contrastanti in clinica ed è attualmente disponibile solo negli studi clinici8-11. Tuttavia, il limitato successo che ha ottenuto e i dati in vivo molto promettenti acquisiti da modelli preclinici di mammiferi hanno dimostrato il potenziale degli ultrasuoni nella terapia del cancro.

Nel tentativo di migliorare l'HIFU, i ricercatori hanno tentato di combinare gli ultrasuoni con agenti antineoplastici appropriati per generare una forma di sonochemioterapia. La terapia sonodinamica (SDT) è una nuova promettente modalità di trattamento che ha dimostrato un'impressionante attività antineoplastica sia in studi in vitro che in vivo1. È stato dimostrato che gli ultrasuoni danneggiano preferenzialmente le cellule maligne in base alla differenza di dimensioni tra tali cellule e quelle di istologia normale1,5. La SDT incorpora agenti specializzati noti come sonosensibilizzatori per aumentare l'entità del danno preferenziale esercitato dagli ultrasuoni contro le cellule neoplastiche. Mentre le applicazioni terapeutiche della SDT sono state precedentemente esaminate, i sistemi a ultrasuoni utilizzati utilizzano tipicamente ultrasuoni a frequenza più elevata (≥1 MHz) e gli effetti degli ultrasuoni a bassa frequenza kHz devono ancora essere completamente esplorati. Le frequenze più basse degli ultrasuoni sono spesso più abili nel produrre cavitazione inerziale, un fenomeno che provoca la distruzione delle cellule a causa del rapido collasso delle microbolle, inducendo danni fisico-chimici12-14. Questa differenza nella generazione di cavitazione inerziale tra gli ultrasuoni MHz e quelli a basso kHz è stata attribuita al fatto che le frequenze d'onda più basse consentono alle microbolle di crescere più tempo per diffusione rettificata nel semiciclo di espansione, producendo di conseguenza collassi più violenti durante il successivo semiciclo di compressione12.

Abbiamo precedentemente dimostrato che le cellule di leucemia monocitica umana U937 sono sensibili agli ultrasuoni a bassa frequenza (23,5 kHz) e che questa sensibilità può essere notevolmente aumentata attraverso l'applicazione di agenti antineoplastici che perturbano il citoscheletro15. Inoltre, abbiamo dimostrato che le cellule sono preferenzialmente danneggiate in base alle dimensioni, con le cellule più grandi che mostrano una maggiore sensibilità agli ultrasuoni. Inoltre, le cellule staminali ematopoietiche umane normali (hHSC) e i leucociti a dimensioni cellulari comparabili sono molto più resistenti alla sonicazione rispetto alle loro controparti neoplastiche15, suggerendo provvisoriamente che gli ultrasuoni a bassa frequenza possono essere utilizzati per danneggiare preferenzialmente le cellule maligne in presenza di tessuto normale.

Per esaminare ulteriormente le proprietà uniche degli ultrasuoni a bassa frequenza per un potenziale uso terapeutico, abbiamo sviluppato procedure di pulizia e stabilizzazione per aumentare l'efficacia e l'affidabilità di uno dei nostri attuali sistemi di sonicazione, il disgregatore cellulare Branson modello SLPe 150 W, 40 kHz, dotato di una tromba da 20 mm inserita in una tazza da 7,62 cm. Inoltre, siamo stati in grado di determinare con precisione le energie di cavitazione del campione, nonché le forme d'onda e l'ampiezza coerenti nell'intervallo di 40 kHz utilizzando un misuratore di cavitazione e un oscilloscopio con idrofono. Perfezionando e sistematizzando i nostri protocolli, siamo stati in grado di stabilire la coerenza delle nostre sonicazioni sperimentali, permettendoci di confrontare quantitativamente le sensibilità sonore di cellule neoplastiche e normali di diversi lignaggi istogenetici. Il nostro protocollo per il sistema a 40 kHz è presentato in dettaglio in modo che i laboratori interessati siano in grado di eseguire esperimenti comparabili e di valutare i nostri risultati sugli effetti antineoplastici suscitati dagli ultrasuoni a bassa frequenza. Inoltre, esaminiamo gli effetti dose-dipendenti della metil-β-ciclodestrina (MeβCD; Figura 1), un agente che riduce il colesterolo, sull'aumento della sensibilità ultrasonica delle cellule leucemiche monocitiche umane U937 e THP1.

Protocollo

1. Pulizia del sistema sonificatore cellulare

  1. Pulire l'unione tra il corno e il convertitore utilizzando cloroformio e un batuffolo di cotone. Applicare un olio leggero o un olio minerale sulle filettature del corno e del convertitore per rimuovere ulteriormente l'accumulo di trucioli di metallo, ruggine o ossidazione.
  2. Utilizzare il cloroformio per rimuovere l'olio e qualsiasi altro contaminante dal raccordo dopo aver pulito i fili con olio.

2. Rimontaggio del Sonificatore Cellulare e Configurazione del Sistema

  1. Ricollegare l'avvisatore acustico al convertitore. Per serrare correttamente il sistema, rimuovere il convertitore e l'avvisatore acustico assemblati dal gruppo della tazza estraendo l'avvisatore acustico dal fondo della tazza (Figura 2A). Posizionare una chiave a fessura all'interno di uno dei tre piccoli fori vicino alla parte superiore del convertitore (Figura 2B). Quindi, posizionare una chiave dinamometrica dotata di una zampa di gallina da 1/2 pollice sulla parte scanalata del corno (Figura 2B). Serrare in senso orario standard fino a quando il torsiometro segna 54,23 N.m (Figura 2C), la coppia consigliata dal produttore16. Rimontare il convertitore e il clacson serrati nella tazza e montare il clacson e il convertitore su un supporto ad anello in posizione verticale. Ricollegare il convertitore all'alimentazione prima di impostare il sistema per il dosaggio sperimentale a impulsi.
  2. Impostare il sistema per il dosaggio degli impulsi utilizzando 1 secondo di sonicazione con 1 secondo tra gli impulsi. Diversi modelli di dosaggio possono essere utilizzati per altre condizioni sperimentali. Molte variabili, come il volume dell'acqua e il diametro del corno, potrebbero richiedere modifiche a questo dosaggio. Utilizzando i suddetti tipi di campioni cellulari, il volume e la concentrazione, i dati empirici e l'osservazione hanno portato alla formulazione di questo regime di dosaggio.
  3. Regolare il sistema all'ampiezza desiderata. In questo protocollo, utilizzare un'ampiezza del 33% e del 50% per prevenire la completa distruzione cellulare, il che renderebbe difficile o impossibile valutare l'efficacia dei sonosensibilizzatori.
    NOTA: In questo studio vengono confrontate le ampiezze.

3. Valutazione dell'intensità e della funzione del sistema

  1. Tenere il misuratore di cavitazione a 1,5 cm, che è il livello di sonicazione del campione. Annotare le letture per valutare che il sistema stia funzionando a un'intensità prevista. Utilizzando il sistema attuale e i livelli dell'acqua, aspettatevi tra 100-110 W/cm2 per il 33% di ampiezza e 115-125 W/cm2 per il 50% di ampiezza. Annotare le letture del misuratore di cavitazione dal display del misuratore che rappresenta direttamente l'energia di cavitazione in W/cm2. Effettuare queste letture sulla superficie dell'acqua e assicurarsi che non siano presenti bolle sulla parte anteriore della sonda del misuratore.
    NOTA: È importante notare che queste procedure vengono eseguite senza il cappuccio per l'accesso sopra il clacson. Non è necessario ripeterli dopo ogni sonicazione. Piuttosto, dovrebbero essere eseguiti solo dopo la pulizia, il rimontaggio e la configurazione del sistema.
  2. Mettere l'idrofono in una fiala per campioni contenente 12,5 ml di acqua per immergere completamente il sensore dell'idrofono. Sospendere l'idrofono utilizzando il supporto ad anello.
  3. Collegare l'idrofono all'ingresso dell'oscilloscopio per valutare le caratteristiche della forma d'onda. Esaminare l'oscilloscopio per verificare la presenza di un'onda sinusoidale chiara, poiché le onde aberranti possono alterare la frequenza del sistema rispetto alle specifiche del produttore. Sia il misuratore di cavitazione che l'oscilloscopio forniscono una lettura della frequenza, ma solo l'oscilloscopio mostrerà onde aberranti che sono indicative di un sistema difettoso o di un assemblaggio improprio.

4. Preparazione delle cellule e del terreno

  1. Preparare il terreno utilizzando 240 ml di Iscove's Modified Dubecco's Medium (IMDM) e 50 ml di siero fetale bovino. Non scongelare il siero fetale bovino in un bagno di acqua calda, poiché un rapido aumento della temperatura può portare a una compromissione della stabilità del siero. Combinare 240 μl di gentamicina 50 mg/ml e 5 ml di penicillina/streptomicina 100x in un pallone di coltura standard e aggiungere al terreno. Conservare il fluido a 4 °C.
  2. Seminare le cellule U937 a ~4 x 104 cellule/ml in un pallone da 25 cm2 utilizzando il terreno preparato. Valutare la concentrazione e la vitalità delle cellule utilizzando un contatore di cellule TC20 e l'esclusione del blu di tripano inserendo 15-20 μl di cellule e 15-20 μl di blu di tripano in una provetta da microcentrifuga e mescolando il contenuto. Pipettare 15-20 μl di questa miscela in un vetrino di campionamento TC20 e iniziare i conteggi posizionando il vetrino nel contatore di cellule TC20.
  3. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 e verificare la vitalità cellulare utilizzando l'esclusione del blu di tripano e il contatore di cellule TC20. Quando le cellule hanno raggiunto una concentrazione appropriata e/o sono state trattate con sonosensibilizzatori per un periodo di tempo adeguato, trasferire 3 ml di cellule dal pallone di coltura in un flaconcino di vetro a scintillazione da 20 ml. In questo protocollo, coltivare cellule U937 per 48 ore, quindi trattare con 0,5, 1 o 5 mM di MeβCD per 30 minuti per esaurire sufficientemente il colesterolo delle cellule prima della sonicazione.

5. Sonicazione cellulare

  1. Degassare l'acqua distillata deionizzata utilizzando un pallone di Buchner sottovuoto. Trasferire l'acqua nel corno della tazza e riempirlo fino a un livello di 15 mm sopra la parte superiore del corno. Il processo di sonicazione provoca un ulteriore degassamento dell'acqua per un periodo di pochi minuti e può portare a incongruenze nel corso dell'esperimento se il sistema non viene eseguito prima della sonicazione del campione. Pertanto, far funzionare il sistema per ~7 minuti prima della sonicazione del campione.
  2. Fissare la fiala di scintillazione contenente le celle al dispositivo di fissaggio. Quindi, fissare il dispositivo di tenuta alla parte superiore del corno della tazza e regolarlo a un'altezza di 15 mm dalla parte superiore del corno (sulla superficie dell'acqua utilizzando il meccanismo di scorrimento).
  3. Le cellule vengono tipicamente sonicate utilizzando tre impulsi di ultrasuoni di 1 secondo, con una spaziatura di 1 secondo tra ciascuno di questi impulsi. Per questo protocollo, sonicare le celle al 33% e al 50% di ampiezza utilizzando il dosaggio a impulsi sopra menzionato.

6. Valutazione dei danni post-sonicazione delle celle

  1. Valutare il danno e la vitalità delle celle sospese utilizzando il blu di tripano e il contatore di celle TC20. Inoltre, analizzare il campione utilizzando un contatore Z2. Per l'analisi con contatore Z2, pipettare una sospensione cellulare da 100 μl in 20 ml di soluzione salina isotonica (rapporto 200:1). Prima dell'analisi, lavare l'apertura dell'analizzatore di particelle Z2 almeno due volte utilizzando soluzione salina isotonica. Posizionare il campione Z2 nel supporto del contatore e sollevare la piattaforma fino all'apertura prima di iniziare i conteggi.
  2. Acquisire i dati dai contatori TC20 e Z2 utilizzando il software fornito dal produttore. Analizza questi dati per rilevare il danno cellulare, la vitalità e la creazione di detriti cellulari dalla sonicazione.

7. Saggio XTT per determinare la vitalità cellulare e l'attività mitocondriale delle cellule U937 e THP1 trattate

  1. Prima dei saggi XTT, coltivare le cellule U937 e THP1 nelle stesse condizioni. Pretrattare le cellule con lo stesso intervallo di concentrazione di MeβCD per 30 minuti prima della sonicazione. Utilizzare gli stessi parametri degli ultrasuoni di prima, tranne per il fatto che le celle vengono ora sonicate utilizzando un intervallo di 1-3 impulsi di un secondo distanziati di un secondo l'uno dall'altro per sviluppare un intervallo di danni che il kit XTT deve valutare.
    Nota: Molti di questi passaggi sono tratti direttamente dal manuale del kit XTT e vengono ripetuti solo per comodità dei laboratori interessati.
  2. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 200 x g per 10 min. Risospendere il pellet cellulare nel terreno di coltura precedentemente descritto. Risospendere le cellule a ~1 x 105 cellule/ml. Seminare le cellule U937 a 100 μl per pozzetto in una piastra per microtitolazione a fondo piatto a 96 pozzetti in triplice copia, quindi ripetere per le cellule THP1 utilizzando una piastra separata a 96 pozzetti. Includere 3 pozzetti di controllo contenenti 100 μl di terreno di crescita completo da solo come letture dell'assorbanza in bianco. Quindi, incubare le piastre inoculate per 24 ore.
  3. Scongelare due aliquote del reagente XTT e del reagente di attivazione a 37 °C prima dell'uso. Agitare delicatamente le aliquote fino ad ottenere soluzioni limpide. Aggiungere 0,1 ml del reagente di attivazione a 5,0 ml del reagente XTT, che forma una soluzione XTT attivata sufficiente per un saggio su piastra per microtitolazione a 96 pozzetti. Ripetere il processo per l'altro piatto.
  4. Aggiungere 50 μl della soluzione XTT attivata in ciascun pozzetto. Rimettere la piastra nell'incubatore di CO2 per colture cellulari per 2 ore. Agitare delicatamente la piastra dopo il periodo di incubazione per distribuire uniformemente il colore arancione nei pozzetti positivi. Misurare l'assorbanza dei pozzetti del saggio contenenti le cellule e dei pozzetti di controllo del fondo bianco a una lunghezza d'onda compresa tra 450 e 500 nm utilizzando un lettore di piastre per microtitolazione.
  5. Azzerare il lettore di piastre per microtitolazione utilizzando i pozzetti di controllo in bianco o sottrarre il loro valore medio dai risultati specifici. Misurare nuovamente l'assorbanza di tutti i pozzetti del saggio a una lunghezza d'onda compresa tra 630-690 nm e sottrarre i valori dai valori di 450-500 nm ottenuti. Nota: questa seconda determinazione dell'assorbanza aiuta a eliminare le letture non specifiche dai risultati del test. Il test XTT è stato ripetuto quattro volte per entrambe le linee cellulari.

Risultati

La stabilità del sistema è fondamentale per ottenere risultati ripetibili e affidabili. La corretta specifica di coppia di 54,23 N.m ha permesso un accoppiamento adeguato tra trasduttore e sonotrodo2, con la coerenza dell'onda valutata mediante l'uso di un oscilloscopio e di un idrofono (Figura 3A). Figura 3B mostra le misurazioni all'interno della provetta del campione, mentre Figura 3C valuta la stabilità all'interno del corno a coppa. Come previsto, l'ampiezza è risultata leggermente ridotta a causa dell'assorbimento di parte dell'energia da parte del vetro. Tuttavia, l'onda non è risultata perturbata né distorta né nel pannello B né nel C, condizione necessaria per una consegna affidabile dell'energia sonica al campione. Un'onda che non appare come un'onda sinusoidale singola e ben definita indica un trasduttore difettoso o un montaggio non corretto. Questo aspetto è illustrato in Figura 3D, che mostra molteplici onde anomale, una chiara assenza di un'onda sinusoidale e una frequenza misurata non compatibile con un sistema funzionante correttamente. Il misuratore di cavitazione utilizzato per misurare l'energia di cavitazione generata (Figura 4) ha rilevato un'intensità sonora di 100-110 W/cm2 al 33% di ampiezza e di 125-130 W/cm2 al 50% di ampiezza.

Una volta che il sistema a 40 kHz è stato correttamente calibrato e assemblato nella sua interezza (Figura 5), è stata facilmente raggiunta una distruzione cellulare affidabile, come determinato dai contatori TC20 e Z2 (Figura 6). Come previsto, danni cellulari più estesi sono stati osservati nelle popolazioni cellulari sottoposte a sonificazione al 50%, piuttosto che al 33% di ampiezza. Tuttavia, un'ampiezza del 33% è utile come punto di partenza per rilevare potenziali effetti sensibilizzanti alla sonificazione indotti da agenti somministrati, poiché provoca danni evidenti, ma lascia spazio per rilevare ulteriori danni quando vengono applicati agenti per valutare il loro potenziamento della sensibilità ultrasonica. Questo è illustrato nella Figura 7A, dove vengono presentati gli effetti dose-dipendenti di MeβCD nel potenziare la sensibilità ultrasonica delle cellule U937. Sebbene le cellule trattate con MeβCD ma non sottoposte a sonificazione fossero molto simili nella vitalità alle cellule non sottoposte a sonificazione e non trattate, la vitalità è notevolmente diminuita dopo tre impulsi di ultrasuoni a 40 kHz della durata di 1 secondo. Inoltre, la riduzione della vitalità dopo la sonificazione sembra essere dose-dipendente, poiché 5 mM di MeβCD hanno prodotto la maggiore diminuzione del numero di cellule, seguiti da 1 mM e poi da 0,5 mM di MeβCD.

Effetti simili sulla vitalità cellulare e sull'attività mitocondriale sono stati osservati sia nelle cellule U937 che nelle THP1 trattate con concentrazioni variabili di MeβCD prima della sonificazione, come valutato con il kit XTT (Figura 7B). Sebbene le cellule THP1 sembrino leggermente più resistenti alla sonificazione rispetto alle cellule U937, entrambe le linee di leucemia umana subiscono danni in maniera dose-dipendente. Concentrazioni più elevate di MeβCD e un numero maggiore di impulsi di ultrasuoni hanno prodotto la minore riduzione dell'XTT in un derivato solubile di colore arancione brillante, sia per le cellule U937 che per le THP1, corrispondente a una minore vitalità cellulare e attività mitocondriale.

Diagramma della struttura del ciclodestrina; anelli chimici, legami glicosidici; formula molecolare.
Figura 1. Struttura molecolare della metil-β-ciclodestrina. (A) Struttura completa della metil-β-ciclodestrina (MeβCD). (B) MeβCD è un polimero costituito da sette unità ripetitive con un gruppo R pari a H oppure CH3. Formula molecolare: C56H98O35. Peso molecolare = 1331,36.

Impostazione per la misurazione della coppia; chiave dinamometrica, chiave a forcella; diagramma dell'assemblaggio meccanico.
Figura 2. Applicazione corretta della coppia al sistema ad ultrasuoni da 40 kHz. (A) Il cornetto e il convertitore vengono rimossi dalla coppa prima dell’applicazione della coppia. (B) Posizionare la chiave a forcella e la chiave dinamometrica nelle rispettive posizioni. (C) Applicare una coppia di 54,23 N.m in senso orario prima di ricollegare il cornetto e il convertitore alla coppa.

Oscilloscopio che mostra l'analisi della forma d'onda; elaborazione del segnale elettronico; grafico che mostra modelli d'onda.
Figura 3. Utilizzo di un oscilloscopio per caratterizzare la forma d'onda del sistema ad ultrasuoni. (A) Un oscilloscopio dotato di idrofono può essere utilizzato per valutare l'ampiezza e la costanza della forma d'onda. (B) Una registrazione effettuata con il contenitore direttamente sopra il corno a 1,5 cm e impostato al 33% di ampiezza. (C) La forma d'onda mostrata qui proviene da una lettura ottenuta posizionando l'idrofono all'interno di una provetta di vetro per scintillazione da 20 ml. La provetta è posizionata a 1,5 cm sopra il corno e nuovamente impostata al 33% di ampiezza. (D) Un'immagine catturata da un oscilloscopio di un sistema con frequenze anomale, come ci si aspetterebbe da un sistema difettoso o da un accoppiamento improprio tra corno e convertitore. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Configurazione del misuratore di energia UEM-001-ITI con sonda di misura e registrazione dati per studi elettrici.
Figura 4. Utilizzo di un misuratore di cavitazione per caratterizzare l'intensità sonora del sistema ad ultrasuoni. Il misuratore di cavitazione mostrato in figura viene utilizzato per rappresentare l'energia di cavitazione in W/cm2. Si tratta di uno strumento molto importante per valutare la costanza dell'energia rispetto al campione.

Impostazione di equilibrio statico con indicatore del livello dell'acqua; apparecchiatura per esperimento di meccanica dei fluidi.
Figura 5. Componenti principali del sistema ad ultrasuoni a 40 kHz. Il sistema ad ultrasuoni è mostrato completo di corna a coppa (A), apparecchio di riscaldamento (B), convertitore (C) e meccanismo di posizionamento del campione (D). Questa progettazione consente un facile posizionamento del campione (E) sopra la corna (F).

Vitalità cellulare e conteggio sotto trattamento con ultrasuoni; il grafico mostra gli effetti dell'ampiezza non sonificata rispetto a quella variabile.
Figura 6. Effetti di diversi livelli di ampiezza sulla lisi ultrasonica di cellule U937 utilizzando i contatori TC20 e Z2. Le cellule sono state sonificate con il dismembratore cellulare a 40 kHz a un'ampiezza del 33% (100-110 W/cm2) o del 50% (125-130 W/cm2), applicando tre impulsi di ultrasuoni di 1 secondo ciascuno, intervallati da 1 secondo tra un impulso e l'altro. (A) Una schermata del software del contatore Z2 mostra l'effetto della sonificazione sulle cellule U937. (B) I dati ottenuti dal contatore TC20 sono stati riportati in un grafico per dimostrare la riproducibilità dei risultati. Questi dati includono il numero totale di cellule e quello di cellule vitali, nonché la valutazione della vitalità cellulare mediante colorante trypan blu. Le barre rappresentano l'errore standard della media (SEM) per 4 popolazioni cellulari indipendenti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Effetto degli ultrasuoni sulla dimensione cellulare; grafici a barre e a linee; trattamento con MeBCD; analisi dell'assorbanza; 40 kHz.
Figura 7. Effetti della metil-β-ciclodestrina sulla potenziazione della sensibilità ultrasonica delle cellule U937 e THP1. (A) Le cellule U937 sono state trattate con concentrazioni variabili di MeβCD per 30 min prima di essere sottoposte a sonificazione con ultrasuoni a 40 kHz (105 W/cm2) mediante tre impulsi di 1 secondo intervallati da 1 secondo. Le popolazioni cellulari sono state suddivise in ≥12 µm e ≥17 µm. (B) Le cellule U937 o THP1 sono state nuovamente trattate con concentrazioni variabili di MeβCD per 30 min prima di essere sottoposte a sonificazione con il sistema a 40 kHz, utilizzando da 1 a 3 impulsi di 1 secondo di ultrasuoni intervallati da 1 secondo. La vitalità cellulare e l'attività mitocondriale sono state valutate mediante il kit XTT. Sono state seminate 100 µl di cellule per pozzetto in una piastra microtitolatrice a 96 pozzetti con fondo piatto. La piastra è stata incubata per 24 ore prima dell'aggiunta della soluzione XTT. Successivamente, le cellule sono state incubate per ulteriori 2 ore prima della lettura della lunghezza d'onda. Le barre rappresentano l'errore standard della media (SEM) di 4 popolazioni cellulari indipendenti. Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Per ottenere risultati ottimali, è necessario prestare particolare attenzione a posizionare con cura il campione e a pulire il raccordo convertitore-tromba. Il posizionamento del campione nel corno è importante per ottenere una distruzione cellulare costante, poiché la modifica della distanza dal corno altererà i focolai acustici e quindi altererà l'energia a cui il campione è esposto. L'energia acustica all'interno del corno a coppa può essere mappata utilizzando il misuratore di cavitazione per trovare la posizione di massima cavitazione. Inoltre, il misuratore di cavitazione, insieme all'oscilloscopio, sono fondamentali per determinare l'intensità del suono a cui sono esposte le cellule, nonché l'omogeneità della forma d'onda. Pertanto, questi strumenti devono essere utilizzati per rilevare i problemi con il sistema e aiutare a determinare la risoluzione dei problemi che potrebbe essere necessaria per correggere l'instabilità del sistema.

Come accennato in precedenza, il sistema a bassa frequenza può agire per degassare ulteriormente l'acqua durante l'esperimento se non viene fatto funzionare per diversi minuti prima della sonicazione del campione. Questa corsa iniziale deve essere eseguita per produrre un mezzo di sonicazione relativamente degassato e quindi risultati coerenti durante gli esperimenti. Inoltre, le cellule non devono essere sonicate all'ampiezza massima o in prossimità di essa quando si valuta l'efficacia dei sonosensibilizzatori, poiché la vera portata della sensibilizzazione sarebbe difficile da valutare. L'utilizzo di un'ampiezza del 33% sul sistema a 40 kHz è un'impostazione ideale, in quanto produce danni notevoli, ma fornisce ai sonosensibilizzatori ampio spazio per dimostrare la loro efficacia, come dimostrato con MeβCD contro le cellule U937 e THP1 (Figura 7). Questi dati confermano anche che la MeβCD sensibilizza più linee leucemiche agli ultrasuoni a bassa frequenza in modo dose-dipendente.

Ci sono stati un certo numero di esperimenti fatti con frequenze più elevate nell'intervallo da 0,75 MHz a 8 MHz che mostrano prove di bolle di cavitazione intramembrana generate attraverso la sonicazione17-19. Tuttavia, rimangono ancora domande riguardo all'esatto meccanismo della lisi cellulare indotta dagli ultrasuoni18. Abbiamo dimostrato un legame tra la fluidificazione del citoscheletro e l'aumento della sensibilità sonica utilizzando gli ultrasuoni a bassa frequenza15, un fenomeno dimostrato da altri laboratori20, 21. Inoltre, abbiamo scoperto che gli agenti che alterano i microfilamenti come la citocalasina B potenziano la sensibilità ultrasonica in più linee leucemiche, ma non nelle hHSC o nei leucociti22, suggerendo che l'inibizione della polimerizzazione dell'actina può essere un meccanismo sonosensibilizzante di particolare interesse. Abbiamo anche osservato che la vincristina, un agente che altera i microtubuli e inibisce la polimerizzazione della tubulina23, 24, aumenta notevolmente la sensibilità ultrasonica di diversi tipi di leucemia in vitro , tra cui la leucemia mieloide acuta, la leucemia mieloide cronica e la leucemia linfoide acuta. Al contrario, gli agenti diretti al citoscheletro che stabilizzano i componenti del citoscheletro (paclitaxel e jasplachinolide) sembrano rendere le cellule resistenti alla sonicazione, riflessa da tassi più bassi di lisi cellulare22. Nel loro insieme, questi dati supportano l'ipotesi che la fluidificazione delle componenti citoscheletriche delle cellule neoplastiche sia effettivamente un fattore importante nell'aumentare l'efficacia della SDT25. Il presente studio dimostra anche che la deplezione del colesterolo può essere un altro metodo con cui potenziare ulteriormente la sensibilità ultrasonica delle cellule neoplastiche, poiché le cellule U937 trattate con MeβCD sono marcatamente sensibilizzate agli ultrasuoni a 40 kHz.

Mentre i nostri protocolli di sonicazione hanno dimostrato una marcata attività antineoplastica in vitro, la metodologia attuale è limitata al lavoro in coltura e a piccoli modelli di vertebrati che sono in grado di adattarsi alle fiale utilizzate per la sonicazione. Abbiamo dimostrato che il pesce zebra può essere sonicato in modo sicuro utilizzando ultrasuoni pulsati a bassa frequenza (20 kHz) e che la loro tolleranza agli agenti chemioterapici è quantitativamente paragonabile alle dosi tollerate dai modelli murini26, suggerendo che il pesce zebra portatore di tumore può essere utilizzato in indagini preliminari per valutare l'attività antineoplastica in vivo di questi protocolli. Tuttavia, la somministrazione di agenti chemioterapici prima della sonicazione di modelli di mammiferi è stata riportata nell'intervalloMHz 1 e tali protocolli possono probabilmente essere estesi per incorporare ultrasuoni a bassa frequenza, nonché agenti che riducono il colesterolo e diretti al citoscheletro.

Le potenziali applicazioni cliniche di questa forma di SDT possono comportare la sonicazione extracorporea del sangue in cui gli agenti antineoplastici vengono somministrati per via endovenosa (i.v.) prima che il sangue venga rimosso per la sonicazione25. Questo metodo rimuove le potenziali barriere sonore poste dall'anatomia umana e può essere un modo efficace per danneggiare le esplosioni leucemiche, così come le metastasi da tumori solidi. È anche possibile che gli agenti che deplevano il colesterolo e diretti al citoscheletro possano essere utilizzati nei protocolli HIFU che sono già in fase di esame clinico nel tentativo di migliorare l'efficacia di questa modalità di trattamento.

I metodi descritti nel presente studio sono in grado di valutare il valore di potenziali sonosensibilizzatori e un ulteriore perfezionamento del sistema potrebbe migliorare questa utilità. Tuttavia, ci sono molte variabili da considerare quando si utilizzano tali dispositivi a ultrasuoni, tra cui la qualità dell'alimentazione, i focolai acustici e la variazione individuale tra i convertitori. Pertanto, la ricerca futura si concentrerà sulla visualizzazione delle onde soniche e sulla comprensione della loro influenza sui risultati. La SDT ha dimostrato di migliorare la lisi cellulare in vitro e potrebbe rivelarsi clinicamente valida se venissero acquisiti più dati in vivo in modelli di mammifero. Nel nostro laboratorio continuano gli esperimenti che esaminano altre caratteristiche potenzialmente sfruttabili delle cellule maligne, nonché varie modalità combinate che coinvolgono più agenti e ultrasuoni.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il personale del workshop del Dipartimento di Fisica dell'Università di Syracuse per la loro assistenza innovativa in questioni relative alla progettazione del nostro sistema.

Materiali

Il Riscaldatore a Kit di analisi della proliferazione cellulare
Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
medio di Dulbecco modificato di Iscove con NaHCO3 e 25mM Hepes Life Technologies12440079
Soluzione di amfotericina B Sigma-AldrichA2942 
Soluzione di penicillina/streptomicina 100x Life Technologies10378-016
Siero fetale bovinoSigma-Aldrich12105
Branson SLPe 40kHz Disgregatore cellulare con 3" (25 mm) CuphornBranson Ultrasonics101-063-726Dispositivo di sonicazione
Calore vivace SDC Controllore digitale della temperatura da banco con riscaldatore a bicchiere da 1000 mlcalore vivaceSDCJF1A-GBH1000-1utilizzato per il controllo della temperatura
Misuratore di celle Beckman-Coulter Z2 con AccuComp® SoftwareBeckman-Coulter6605700
Bio-Rad TC20 Contatore cellulare automatizzatoBio-Rad145-0102
Gentamicina 50 mg/mlSigma-AldrichG1397 
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
Falcon 50 ml e 25 ml Fiasche di coltura ventilateFisher Scientific353082
Lonza L-Glutammina 200 mM 0,85% NaClLonza17-605C 
Seal-Rite Provette per microcentrifuga da 1,5 mlUSA Scientific1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml Fiale e tappiBeckman-Coulter  A35473
AccuJet Pro Auto Pipet BrandTech Scientific26330
USA Scientific 10 ml Pipette sierologiche monousoUSA Scientific1071-0810
Tip One 100 μ l e 1.000 μ l Punte con filtroUSA Scientific1120-1840, 1126-7810
100 μ l Micropipetta Wheaton851164
1.000 μ l MicropipettaWheaton851168
Vetrini di conteggio a doppia cameraBio-Rad145-0015
Forma Scientific Incubatore a doppia camera con rivestimento d'acquaForma Scientific3131
Tektronix  Oscilloscopio digitale al fosforo DPO 2002BTektronixDPO2002Butilizzato per misurare la forma d'onda ultrasonica
PPB MegaSonics Modello PB-500 Misuratore di energia ultrasonicaPPB MegasonicsPB-500 utilizzato per valutare l'intensità del suono in W/cm2
Teledyne RESON TC4013-1 IdrofonoTeledyneTC4013-1 Si collega all'oscilloscopio 
Wheaton 250 ml FlaconiSigma-AldrichZ364827
20 ml Fiale di vetro scintillante Sigma-AldrichZ190527
Soluzione salina isotonica Beckman-Coulter Beckman-CoulterN/Adiluente per contatore Z2
Cloroformio 99%Sigma-AldrichC2432
Etanolo 200 Prova Anidro Sigma-Aldrich459836
Mineral OilN/A
XTTATCC30-1011K
Lettore di micropiastre a 96 pozzettiCole-Palmer  EW-13055-54
U937 Cellule di leucemia monocitica umanaATCCCRL­ 1593.2
THP1 Cellule di leucemia monocitica umanaATCCTIB-202

Riferimenti

  1. Trendowski, M. The promise of sonodynamic therapy. Cancer Metastasis Rev. 33 (1), 143-160 (2014).
  2. Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis. J Urol. 179 (1), 194-197 (2008).
  3. Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial. J Urol. 174 (2), 595-599 (2005).
  4. McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review. Rev Urol. 15 (2), 49-60 (2013).
  5. Mitragotri, S. Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications. Nat Rev Drug Discov. 4 (3), 255-260 (2005).
  6. Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer. BJU Int. 110 (9), 1228-1242 (2012).
  7. Li, P. Z., et al. High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11 (6), 655-660 (2012).
  8. Xiaoping, L., Leizhen, Z. Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer. Int J Hyperthermia. 29 (7), 678-682 (2013).
  9. Lukka, H., et al. High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review. Clin Oncol (R Coll Radiol). 23 (2), 117-127 (2011).
  10. So, A. I. HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer). Can Urol Assoc J. 5 (6), 424-426 (2011).
  11. Crouzet, S., et al. Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients. Eur Urol. 65 (5), 907-914 (2014).
  12. Tezel, A., Mitragotri, S. Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis. Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).
  13. Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport. Pharm Res. 19 (8), 1160-1169 (2002).
  14. Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery. Biol Pharm Bull. 32 (5), 916-920 (2009).
  15. Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells. Anticancer Res. 34 (5), 2195-2202 (2014).
  16. Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. , Branson Ultrasonics Corporation. Available from: http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf (2010).
  17. Lagneaux, L., et al. Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells. Exp Hematol. 30 (11), 1293-1301 (2002).
  18. Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (8), 3258-3263 (2011).
  19. Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes. Biophys J. 84 (5), 3087-3101 (2003).
  20. Mizrahi, N., et al. Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics. Soft Matter. 8 (8), 2438-2443 (2012).
  21. Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization. J R Soc Interface. 11 (95), 20140071(2014).
  22. Trendowski, M., et al. Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound. Cancer Lett. In press, (2015).
  23. Dumontet, C., Sikic, B. I. Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death. J Clin Oncol. 17 (3), 1061-1070 (1999).
  24. Verrills, N. M., Kavallaris, M. Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies. Curr Pharm Des. 11 (13), 1719-1733 (2005).
  25. Trendowski, M. The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy. Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).
  26. Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo. In Vivo. 28 (6), 1021-1031 (2014).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Terapia sonodinamicaagente depletore di colesterolometil beta ciclodestrinavalutazione della vitalit cellularesaggio XTTcontacelle automaticomisuratore di cavitazionesensore idrofonicocalibrazione della chiave dinamometrica

Articoli correlati