Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

Sommario

Descriviamo un test di sensibilità ai farmaci ad alto rendimento per cellule primarie di mieloma multiplo. Consiste in una ricostruzione del microambiente del midollo osseo (compresa la matrice extracellulare e lo stroma) in piastre multipozzetto e in un metodo non invasivo per la quantificazione longitudinale della vitalità cellulare.

Abstract

In questo lavoro descriviamo un nuovo approccio che unisce ex vivo test di sensibilità di droga e l'analisi di immagini digitali per stimare chemiosensibilità ed eterogeneità di mieloma multiplo (MM), le cellule derivate da pazienti. Questo approccio consiste nel seminare cellule di MM primarie appena estratti da aspirati midollari nelle camere di microfluidica attuate in piastre multi-così, ognuno composto da una ricostruzione del microambiente midollare, tra cui matrice extracellulare (collagene o membrana basale matrice) e stroma (paziente- le cellule staminali mesenchimali derivate) o cellule endoteliali umane di derivazione (HUVECs). Le camere sono drogati con diversi agenti e concentrazioni, e vengono esposte in sequenza per 96 ore attraverso il microscopio a campo luminoso, in un microscopio motorizzato dotato di una fotocamera digitale. Software di analisi dell'immagine digitale rileva le cellule vive e morte dalla presenza o assenza di movimento della membrana, e genera le curve di cambiamento della redditività in funzione of concentrazione di farmaco e il tempo di esposizione. Usiamo un modello computazionale per determinare i parametri di chemiosensibilità della popolazione tumorale per ciascun farmaco, così come il numero di sub-popolazioni presenti come misura di eterogeneità tumorale. Questi modelli su misura del paziente possono poi essere utilizzati per simulare regimi terapeutici e valutare la risposta clinica.

Introduzione

L'obiettivo di questo metodo è quello di caratterizzare la sensibilità ai farmaci del mieloma multiplo (MM) cellule primarie ad un pannello di agenti ex vivo, il più vicino possibile alle condizioni fisiologiche, e con sufficiente precisione che questi risultati possono essere utilizzati per identificare chemioresistente sub popolazioni nel carico tumorale e, in ultima analisi, di parametrizzare modelli computazionali studiati per valutare la risposta clinica.

Modelli di calcolo sono strumenti potenti per analizzare sistemi complessi, quali le interazioni tumore-ospite-terapia. Tuttavia, i modelli sono solo buono come i dati ....

Protocollo

L'uso di cellule umane derivate da biopsie è stato approvato dal Comitato Etico del Moffitt e condotta sotto la sperimentazione clinica MCC # 14745 condotto presso l'H. Lee Moffitt Cancer Center e Istituto di ricerca come descritto di seguito.

1. Selezione di MM cellule da midollo osseo aspirati

1. Raccogliere aspirati di midollo osseo (20 ml) di pazienti in siringa eparina sodica.
2. Isolare le cellule mononucleate mediante centrifugazione osseo diluito (1: 1 con PBS sterile) su un gradiente di mezzo sterile acquosa centrifugazione a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente.
3. Raccogliere l'interfaccia,....

Risultati

Il flusso di questo esperimento è brevemente descritto nella Figura 1 Se tutti i passaggi sono stati completati con successo, le immagini ottenute con il microscopio dovrebbe essere equivalente alla Figura 2:. Vivono cellule di MM devono essere chiaramente visibili come dischi luminosi e BMSCs o HUVECs dovrebbero essere appena visibile e ben distribuita in background. Come si vede nella figura 2A, cellule di MM variano nel formato da un paziente all'altro, ma in gen.......

Discussione

In sintesi, questo è un metodo di throughput potente e alta quantificare chemiosensibilità delle cellule MM primarie ed ex vivo farmacodinamica dei farmaci in una ricostruzione del midollo osseo. I passaggi critici all'interno questo protocollo sono il corretto semina dei pozzi e focalizzazione adeguata (vedi Figura 2 per i risultati attesi): assicurare che le cellule stromali MM e sono uniformemente distribuiti, che le cellule stromali sono aderenti al fondo del pozzo, che tutti MM cellule.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
EVOS FL AUTO	AMG	AMAFD1000+ AMC1000	Microscopio digitale dotato di tavolino motorizzato e incubatore da banco.
piastra a 384 pozzetti CellBind	CORNING CLS3683	SIGMA	Corning CellBIND piastre a 384 pozzetti piastra a 384 pozzetti, polistirene, superficie CellBIND, sterile, fondo piatto trasparente, nero, con coperchio
piastra a 1.536 pozzetti CellBind	CORNING CLS3832	ALDRICH	Corning piastre a 1.536 pozzetti, base bassa, trattamento superficiale CellBIND, sterile
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	GE17-1440-02 SIGMA	Per in vitro isolamento di linfociti dal sangue periferico umano.
CD138 perline magnetiche	Miltenyi	130-051-301	Sfere magnetiche coniugate anticorpali per la selezione di cellule CD138+.
Colonne LS	Miltenyi	130-042-401	Colonna per la separazione delle celle.
Separatore MidiMACS	Miltenyi	130-042-302	Magnete per colonna di separazione.
Matrigel	Sigma-Aldrich	E6909 SIGMA	ECM Gel di Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma murino
Getrex	Life Technologies	A1413201	senza LDEV Fattore di crescita ridotto Matrice della membrana basale
HUVEC	Life Technologies	C-003-25P-B	Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)
RPMI-1640 media	GIBCO	11875-093	RPMI 1640 Medium + L-Glutammina + Rosso Fenolo
FBS Inattivato a caldo	GIBCO	10082-147	Siero fetale bovino, certificato, inattivato a caldo, origine statunitense
3,1 mg/ml Collagene bovino di tipo I	Soluzione avanzata di	Biomatrix 5005-B	, Tipo I, 3 mg/ml, 100 ml
Precision XS	BIOTEK		PRC3841 Sistema di pipettatori robotizzato

collagene bovino