Un Screenable In Vivo Saggio per mitocondriale modulatori Uso Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

Sommario

Viene descritto un protocollo per il rilevamento in vivo degli effetti degli inibitori mitocondriali nell'organismo modello Caenorhabditis elegans e per l'identificazione di potenziali composti potenzianti. Questo protocollo può essere utilizzato per lo screening di librerie di farmaci alla ricerca di composti che modulano la funzione mitocondriale.

Abstract

L'organismo modello multicellulare Caenorhabditis elegans è un piccolo nematode di circa 1 mm di dimensione in età adulta che è geneticamente e sperimentalmente trattabile. È economico e facile da coltivare e dosare in terreno liquido, il che lo rende adatto per lo screening a media produttività. Abbiamo precedentemente convalidato l'uso di ceppi transgenici di luciferasi che esprimono C. elegans per fornire una rapida valutazione in vivo dei livelli di ATP del nematode. ^1-3 Qui presentiamo i materiali e la procedura necessari per eseguire saggi biologici con i ceppi bioluminescenti di C. elegans PE254 o PE255 (o uno qualsiasi dei loro ceppi derivati). Il protocollo consente il rilevamento in vivo degli effetti subletali dei farmaci che possono identificare la tossicità mitocondriale, nonché il rilevamento in vivo di potenziali effetti benefici dei farmaci. Risultati rappresentativi sono forniti per le sostanze chimiche paraquat, rotenone, ossalacetato e per quattro composti inibitori della luciferasi della lucciola. La metodologia può essere ampliata per fornire una piattaforma per lo screening di librerie di farmaci per composti in grado di modulare la funzione mitocondriale. La valutazione preclinica della tossicità dei farmaci viene spesso effettuata su linee cellulari umane cancerose immortalizzate che derivano ATP principalmente dalla glicolisi e sono spesso tolleranti alle tossiche mitocondriali. ^4,5 Al contrario, C. elegans dipende dalla fosforilazione ossidativa per sostenere lo sviluppo nell'età adulta, tracciando un parallelo con l'uomo e fornendo un'opportunità unica per la valutazione dei composti nel contesto fisiologico di un intero organismo multicellulare vivo.

Introduzione

Lo scopo generale di questa procedura è la quantificazione rapida dello stato energetico di C. elegans in vivo, al fine di utilizzare questo come un endpoint screening composti. Il razionale si basa sull'espressione della luciferasi di lucciola transgenica nel nematode C. elegans ^1-3 tramite il plasmide pSLGCV ⁽¹ https://www.addgene.org/49862). L'enzima luciferasi è fusa alla proteina fluorescente GFP verde e si esprime costitutivamente e ubiquitariamente nel citoplasma (perossisoma luciferasi segnale di targeting è stato rimosso). Questo porta ad emissione di luce quando il substrato luciferina è fornito esogenamente. Come il verme è trasparente, la luce può essere misurata in un luminometro come unità di luce relativa (RLU). Combustibili ATP cellulare la reazione bioluminescenza e la sua disponibilità determina i livelli di luce prodotte. Di conseguenza, luminometria offre un convenient significa valutare livelli di ATP relativi e per estensione la funzione mitocondriale, dal momento che la produzione di ATP si verifica principalmente nei mitocondri. Un legame tra i livelli di funzione e bioluminescenza mitocondriale è stata dimostrata in precedenza attraverso il silenziamento di geni mitocondriali catena di trasporto degli elettroni e concomitante emissione luminosa ridotta. ¹

I ceppi bioluminescenza generati sono stati designati PE254 (feIs4) e PE255 (feIs5) ¹ (vedi elenco dei materiali) e può essere usato in modo intercambiabile. ³ Una serie di studi hanno utilizzato questi ceppi di sensori a riferire sui livelli di ATP cellulare in vivo in seguito all'esposizione a varie sostanze chimiche xenobiotici come l'azoturo di sodio ^1, cadmio ^2, delle acque reflue estratto fanghi ^3, 5'-fluoro-2-deossiuridina ^6, e un nitrosamine specifiche del tabacco ^7. Le tensioni sono state anche utili per monitorare gli effetti dell'esposizione a radiazione ultravioletta C ^{8 e gli effetti di interruzione della funzione respiratoria mitocondriale. catena di 1,9 Una prima versione del sensore di luminescenza che esprime il gene della luciferasi, senza una fusione GFP (PE39) è stato usato anche nella ricerca di effetti di metalli pesanti e di una delle vie respiratorie . sganciamento 10 ceppi PE254 PE255 e portare la luciferasi: GFP fusione e fluorescenza GFP ha mostrato di aumentare proporzionalmente con la massa nematode, che offre un mezzo conveniente per la normalizzazione dei valori di luminescenza 6,9 Gli effetti di importo differenziale di vermi per bene possono anche essere. preso in considerazione includendo più replicati tecnici nel test (un minimo di 5 pozzi per condizione). 3}

Il protocollo offre la possibilità di monitorare in vivo dei livelli di energia (in contrapposizione alla più tecnicamente laboriosa in vitro determinazioni ATP) consente di screening composto e riposizionamento nel contesto fisiologico di un intero muorganismo lticellular. La procedura può essere estesa ad una varietà di ambienti genetici attraversando il transgene cromosomicamente integrato in disponibili ceppi mutanti e / o mettendo a tacere i geni di RNA interferenza; in tal modo, sfruttando appieno C. elegans come organismo modello. Il metodo dovrebbe aiutare a ridurre il fallimento fase tardiva di farmaci candidati a causa di tossicità mitocondriale e dare un contributo alla riduzione della sperimentazione animale superiore.

Protocollo

NOTA: Eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili (armadio flusso laminare) e con materiali pre-sterilizzati in autoclave (126 ° C, 11 min). Una piastra LB con striato fuori E. coli OP50 conservato a 4 ° C è necessaria, striscia fuori su piatti LB freschi e restreak ogni mese.

1. batterica alimentare (Escherichia coli OP50) Preparazione

1. Giorno 1. Inoculare 2 x 5 ml LB in due bottiglie universali con una singola colonia di E. coli OP50 e posto a scuotere incubatore a 37 ° C (220 rpm) per 8 ore.
2. Dopo 8 ore di incubazione, utilizzare 2 ml di E. coli OP50 LB cultura a inoculare ciascuna di 3 x 200 ml LB. Luogo palloni in scuotendo incubatore (220 rpm) O / N (17 ore) a 37 ° C.
3. Pesare 20 x 50 ml provette da centrifuga e scrivere peso sul tubo.
4. Giorno 2. Utilizzando una pipetta sierologica, un'aliquota 30 ml di O / N E. cultura coli OP50 in pre pesava provette. Centrifugare a 7.741 xg, 10 ° C, 8 min.
5. Decantare attentamente il supernatante, mantenere la provetta capovolta con coperchio e lasciare riposare per qualche minuto. Usando una pipetta, rimuovere tutto il supernatante eccesso che possono essere raccolti nel coperchio. Pesare il tubo e calcolare il peso del pellet.
6. Calcolare il volume necessario per fornire una sospensione di 30 g / L e marcare questo volume sul tubo. Tubi Data, etichette e posto a -20 ° C per l'uso entro 1-3 mesi a - 80 ° C, se la conservazione per più di 3 mesi.
7. Preparare sospensione batterica per la coltivazione di nematodi; consentire pellet batterico per scongelare e aggiungere volume richiesto di S mezzo completo ^11,12 a ciascuna provetta, vortex delicatamente per risospendere pellet, contenuti piscina di tubi diversi per ottenere il volume richiesto. Lavorare in condizioni di sterilità.

2. Preparazione degli standard di droga in un formato piastra a 96 pozzetti

NOTA: Se si utilizza una libreria di droga, le piastre di droga sono forniti a un singoloconcentrazione del composto in DMSO. Screening primario proverà composti ad un'unica concentrazione. Seguire le istruzioni per la preparazione del piatto di droga per il test composto di conferma in una serie di operazioni di concentrazione tra 0-160 micron, selezionati dopo la significatività statistica a 10 micron. I passaggi riportati di seguito possono essere adattati per testare altre concentrazioni.

ATTENZIONE! Seguire le necessarie precauzioni per la manipolazione farmaci (generalmente Maschera per il viso, occhiali di sicurezza, guanti sono obbligatori).

1. Preparare piatto farmaco con standard per lo screening di conferma lavoro: pesare la quantità necessaria di composto in provette sterili 1,7 ml microcentrifuga e preparare composti 16 mM in DMSO (cioè, 100x concentrata rispetto alla concentrazione superiore desiderata per l'esposizione).
2. In serie diluire 16 magazzino mm 1: 2 in DMSO per ottenere 8, 4, 2, 1, 0.5 e standard di 0,25 mm (condizioni sterili). Questi sono concentrate 100x e saranno diluiti fino a concentrazioni finali di 0 (solo veicolo),2.5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 mM (in 1% DMSO) durante l'esposizione al farmaco.
3. In una cappa a flusso laminare, posizionare 20-50 ml per pozzetto di standard composti all'interno di una colonna di una piastra a 96 pozzetti, per esempio la posizione piastra A1: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mm, F1:, 0,5 mM G1: droga 0,25 mm e H1: DMSO. Utilizzare diverse colonne per la serie di diluizione di diversi farmaci.
4. Veicolo Aliquotare dei pozzetti di colonna 12 nella piastra di droga.
   NOTA: Ciò faciliterà test di controllo del veicolo giù colonne Oltre ai test lungo fila H, assicurando tale veicolo è testato in posizioni rappresentativi dell'intera piastra.
   NOTA: Ogni piatto droga per lo screening di conferma detiene serie di diluizioni per un massimo di 11 farmaci diversi da testare più il controllo del veicolo.
5. Etichetta e lamina di tenuta, coprire con pellicola e posto a -20 ° C fino al momento.

3. Esperimenti nematodi

NOTA: Eseguire tutte le fasi under condizioni di sterilità, in modo asettico e con pre sterilizzati materiali e reagenti. Mantenere C. elegans Ceppi sistematicamente su piastre NGM con E. coli OP50. ¹² tempi suggeriti per le diverse fasi di protocollo sono forniti nella tabella 1.

1. Giorno 1 compito: istituito coltura liquida di ceppo biosensore per la successiva sincronizzazione.
   1. Raccogliere nematodi da una piastra NGM 6 centimetri (con un sacco di giovani larve dove il cibo è appena esaurito) in 2 ml S completa e trasferimento a pallone con 30 g / L E. coli OP50 in S completa (volume totale 30 ml in un pallone di vetro della capacità di 250 ml conica). Incubare 3 giorni a 20 ° C, 160 rpm.
2. Giorno 4 compito (consentire circa 30-35 min): cultura candeggina per raccogliere uova e sincronizzare popolazione verme. Effettuare tutte le fasi di centrifugazione per 1 minuto, 600 x g.
   1. Preparare la soluzione di candeggina al momento dell'uso: per ogni 16 ml di 0,156 M KOH / NaOH aggiungere 4 ml di candeggina.
   2. Versare 2 x 14 mlcultura verme in 15 tubi centrifugazione coniche ml. Lasciare worm di stabilirsi per gravità (3 min). Rimuovere e gettare liquidi nematodi sopra stabiliti. Aggiungere 5 ml di soluzione di candeggina per ogni provetta e avviare il timer. Combina i volumi in un tubo.
   3. Capovolgere il tubo delicatamente per 2 minuti, controllare sotto stereoscope per la rottura di vermi e il rilascio di uova in sospensione. Quando più uova vengono rilasciati o in un tempo massimo di 2 min in soluzione di candeggina, centrifuga.
   4. Rimuovere con attenzione il surnatante. Lavare 1x pellet con 14 ml S completo e centrifugare.
   5. Gettare il surnatante, aggiungere soluzione di candeggina 10 ml e avviare il timer (questa seconda fase candeggina assicura che la maggior parte delle carcasse vite senza fine si disintegrano e non più sono visti sotto stereoscope). Dopo un tempo massimo in soluzione di candeggina di 2 min, centrifuga.
   6. Lavare pellet 3x in S completo, decantare delicatamente surnatante e risospendere pellet in 14 ml S completi dopo ogni centrifugazione. Dopo il lavaggio finale, risospendere pellet uovo in 14 ml S complete.
   7. Trasferire il volume di un pallone di vetro conica. Incubare 18-24 ore a 20 ° C, 160 rpm.
      NOTA: Raccolto uova si schiudono O / N e arrestano lo sviluppo al primo stadio larvale (L1) a causa della mancanza di cibo, di conseguenza, essi saranno tutti nella stessa fase della crescita.
3. Giorno 5 compito: istituito culture verme sincronizzati per le prove di droga.
   NOTA: Worms sospese nel medio fame tendono ad aderire alle superfici plastiche idrofobe quali puntali per pipette e tubi. 0,01% di Tween-20 è un tensioattivo utilizzato qui per renderizzare superfici plastiche più idrofilo e consentire una maggiore accuratezza nel conteggio (0,01% Triton-X100 può anche essere usato). Quando nematodi sono nel mezzo INTEGRATO batterica, che non tendono ad aderire alla plastica.
   1. Determinare il numero di L1 tratteggiate di nel pallone, tenere pallone su piattaforma (160 rpm) agitando.
      1. Prendere 3x 100 campioni microlitri dalla boccetta (utilizzare una punta pulita ogni volta) in 1,7 ml microprovette separati con 900 ml di liquido medium 0,01% Tween-20.
         NOTA: Aspire 100 campione microlitri nella punta pulita solo una volta. Poi, quando l'erogazione, pipetta su e giù un paio di volte nel mezzo interpolazione integrato per rilasciare eventuali worm che aderiscono alla punta.
      2. Contare i nematodi a 4x 10 gocce microlitri da ogni provetta di diluizione triplicato. Calcolare il valore medio e stimare il numero di vermi presenti nel pallone vetro conico.
   2. Calcolare il volume della sospensione nematode covato richiesto per costituire una cultura 2 x 20 ml con 10 nematodi a 10 ml. Aumentare il volume calcolato del 10% per tenere conto di alcuni conseguente perdita nematode durante le fasi di centrifugazione.
   3. Volume di decantare richiesto in 2 x 15 ml tubi centrifugazione (pre-pesato). Pesare i tubi per ottenere volume effettivo erogato, vortice delicatamente e regolare di indirizzare il volume, rimuovendo il volume in eccesso con una pipetta da 5 ml (solo la punta sterile deve entrare il tubo).
   4. Portare il volume a 14 ml con S freschi complete per statoh nematodi. Centrifugare (1 min, 600 g). Rimuovere e scartare il surnatante con attenzione a non disturbare il pellet nematode.
   5. Aggiungere 5 ml di S completo di 30 g / L E. coli OP50 ai nematodi pellet. Trasferire i 5 ml in ciascuna provetta in un pallone di vetro conica contenente 15 ml S completi di 30 g / L E. coli OP50. Annotare nematodi tempo sono stati forniti con il cibo.
   6. Agitare delicatamente pallone (160 giri al minuto), prendere 9 x 10 gocce microlitri su vetrini microscopici (utilizzano punte fresche ogni volta) per contare nematodi e confermare medio di circa 10 (± 2) ogni 10 ml.
   7. Mettere fiaschi nematode a scuotere incubatore a 20 ° C, 160 rpm per 42-44 ore.
4. Giorno 7 compito: trasferimento di nematodi a 96 pozzetti e avviare l'esposizione al farmaco.
   1. Unire le culture nematodi in un unico pallone, tenere vorticoso fiasco delicatamente e mettere 3 x 4 ml di coltura nematode in 60 ml trogolo sterile. Mettere depressione su una piattaforma di scuotimento (160 rpm).
   2. Utilizzare 8 channel pipetta di aliquota 25 microlitri nematodi sospese per pozzetto di 96 micropiastre bene neri con fondo trasparente piatta (per l'adozione di entrambe le letture di luminescenza e fluorescenza, o placche bianche per luminescenza solo). Coprire con il coperchio piatto e mettere da parte.
      1. Dopo messa a punto di ogni 2 piastre, posizionare un altro 2 x 2,5 ml nematodi in depressione per sostituire volume perso (tenere un 'volume morto' in depressione di circa 7 ml).
      2. Istituito 13/14 piatti con nematodi. 11 piastre nematodi saranno tenuti a testare due piastre di droga a 96 pozzetti. La piastra nematode 12 ^th verrà caricata esclusivamente con veicolo come controllo. La piastra di 13 ^° sarà utilizzato per stabilire fluorescenza di fondo il giorno 8 (vedi sotto). Una piastra supplementare può essere preparata per l'uso si dovessero verificare errori durante set up.
   3. Aliquota 74 ml di S completi per ogni piatto bene e posto in una camera umida (vedere l'elenco dei materiali) in un incubatore tremante (20 ° C, 160 giri al minuto) untIl pronto a composti in esame aliquota al momento dello sviluppo prescelto (ad esempio, 45 hr 30 min dopo cibo disponibile). [Volume per pozzo è ora 99 microlitri].
   4. Scongelare piatto droga (s) di prova.
   5. Utilizzare pipetta multicanale per impostare piastre di nematodi con la droga, cambiando punte ogni volta. Lasciare 5 min per 96 pozzetti per aliquotando droga.
      1. Prendere 1 ml ^dal 1 ° colonna della piastra di droga e aggiungere alle colonne 1-5 di un piatto contenente nematodi; ripetere da 2 colonne ^° nella piastra di droga in colonne 8-12 del piatto contenente nematodi. Aggiungere 1 ml di veicolo per colonne 6 e 7 della piastra nematode.
         NOTA: Il volume totale per pozzetto nella piastra nematode sarà 100 microlitri conseguente diluizione 1: 100 di composto / veicolo.
      2. Ripetere processo aggiungendo 1 ml di / 4 ^{esima colonna 3} ° della piastra farmaco per colonne 1-5 / 8-12 della seconda piastra nematode; aggiungere veicolo colonne 6 e 7 della piastra nematode.
      3. Continuare a testare colonne a piatti droga rimanenti. Impostare un minimo di un piatto nematodi con veicolo in tutti i pozzetti campionando dalla colonna 12 della piastra di droga. Luogo piastre posteriori in camere umide scuotendo incubatore (20 ° C, 160 rpm) per 20-22 ore (vedere nota per il giorno 8).
   6. Part-preparare il buffer luminescenza per giorno seguente: aggiungere DMSO e il 10% Triton-X-100 al volume richiesto di S completa per ottenere 1% DMSO e 0,15% Triton X-100. Lasciare 5 ml per piastra di lettura per luminescenza, oltre a 1 ml per adescamento luminometro iniettore.
5. Giorno 8 compito: Leggi endpoint sperimentali - fluorescenza e bioluminescenza. (Letture di fluorescenza GFP sono raccomandati come un mezzo per normalizzare i dati bioluminescenza.)
   NOTA: Obiettivo di leggere gli endpoint per 66-67 ore dopo cibo fornito ai nematodi, al fine di evitare che una significativa produzione di progenie nelle condizioni sperimentali descritte.
   1. Impostare piatto da utilizzare come sfondo per le letture di controllo GFP. Combine così contenuti da ¹³ piastra in una provetta da 15 ml. Lasciare nematodi a stabilirsi (2-3 minuti). Utilizzare il surnatante per caricare una micropiastra (nera con fondo trasparente) con 100 ml sospensione batterica per bene.
      1. Osservare piastra di controllo sfondo al microscopio annotare i pozzi dove nematodi possono essere visti. Escludere queste dalla stima sfondo utilizzato nella successiva analisi dei dati.
   2. Leggi di fluorescenza di ogni piastra a 96 pozzetti, compreso il controllo di sfondo. (Impostazioni: ottica di fondo del piatto, filtri di eccitazione 485/20; 528/20 emissione).
   3. Preparare buffer per le letture di luminescenza: aggiungere luciferina (20 mm) al part-preparati tampone (dal giorno precedente), per ottenere buffer di luminescenza con 1% DMSO (1x), Triton-X100 (3x) e 0,3 luciferina mM 0,15% (3x ). Prime luminometro iniettore 6x con 150 microlitri di buffer luminescenza.
      1. Passo precedente si assume 1% DMSO come veicolo durante l'esposizione al farmaco. Quando il veicolo è l'acqua, regolare la concentration di DMSO in tampone luminescenza al 3% (cioè, 3x).
   4. Lavorare con una piastra alla volta. Dispensare 50 microlitri di buffer luminescenza per pozzetto. (150 ml di volume finale di bene, la diluizione 3x di tampone luminescenza: 1% DMSO, 0,05% Triton-X100 e 0,1 mm luciferina concentrazioni finali.) Luogo immediatamente a scuotere piattaforma e avviare il timer.
      1. Dopo 3 minuti a piattaforma (160 rpm) tremante, leggere luminescenza (1 sec per misura).

Analisi 4. I dati

1. Sottrarre fondo media GFP leggere dai risultati di fluorescenza. Dividere bioluminescenza da rispettivi lettura GFP.
   1. Quando viene rilevato un valore elevato per GFP nematodi esposti ad un composto, misurare la fluorescenza del composto sul proprio per tenere conto di alcuna fluorescenza composto. Se superiore alla media, utilizzare questo come sfondo invece.
2. Bioluminescenza Express, GFP normalizzata bioluminescenza unnd Dati GFP fluorescenza come percentuale del valore medio per il controllo del veicolo in ciascuna piastra.
3. Tracciare valori medi e barre di errore per ogni concentrazione.
4. Test per la significatività statistica utilizzando 2-analisi della varianza (ANOVA) con effetti di 'Concentrazione', 'Experiment' e la loro interazione (ogni punto i dati si riferiscono a un singolo bene), e utilizzare il test di Dunnett come test post-hoc (vs . controllo del veicolo).
   NOTA: se l '"esperimento" o termini "interazione" sono significative, ulteriori esperimenti possono essere richiesti per confermare la risposta. Qualora non la variabilità tra esperimenti emerge dall'osservazione di trame di dati, un One-way ANOVA può essere eseguita su dati raccolti da esperimenti indipendenti.
   1. Per l'analisi statistica della piastra (s) con un solo veicolo, selezionare tutti i pozzetti nelle colonne 6 -7 e tutti i pozzetti, fila H come gruppo di controllo (queste sono le posizioni abitualmente assegnati a veicolo durante il test composto).

Risultati

Risultati rappresentativi per illustrare il metodo sono stati ottenuti per rotenone (Figura 1), paraquat (figura 2), ossalacetato (figura 3), e 4 composti che sono stati raccolti come inibitori lucciola luciferasi durante lo screening di una libreria di droga ¹³ (Figura 4). L'esposizione al farmaco è stato avviato nella fase L4 in tutti i casi, ma gli esperimenti di esposizione paraquat sono stati avviati a 41 ore dopo il cibo prima disponibile ai nematodi rispetto a 45-46 ore per gli altri composti. Il protocollo consente un certo grado di flessibilità nella scelta del tempo per l'inizio della esposizione al farmaco e la lunghezza di esposizione. Tuttavia, a fini di screening, impostare tempi dovrebbero essere rispettati selezionato una volta, per la riproducibilità tra esperimenti. Gli endpoint devono essere misurate entro 66-67 ore di tempo di sviluppo, al fine di evitare che ampia la deposizione delle uova e la schiusa della progenie nei pozzi. Linee guida per temporizzazioni sono forniti in Tgrado 1.

Rotenone, un complesso mitocondriale I inibitore, ridotto bioluminescenza dopo entrambi relativamente brevi (2 ore) e lunghe esposizioni (24 hr) a un intervallo di concentrazioni (Figura 1). In questo caso, non sono state prese misure GFP, ma il numero di repliche tecnici usati (n = 6) è sufficiente per uniformare eventuali differenze di numeri verme tra ^pozzetti 3. L'esposizione 24 ore è una finestra di tempo nel quale crescono nematodi, e lo sviluppo più lento a causa di I inibizione complesso è pensato di contribuire alla diminuzione bioluminescenza. Ciò è stato confermato mediante osservazione visiva sotto stereoscope al ritardo nello sviluppo visto, in particolare a concentrazioni di 20 mM e superiori; in aggiunta alcuni letalità fu notata da 40 micron (osservazioni qualitative non quantificati). Nessuna mortalità è stata osservata dopo l'esposizione di 2 ore, ma gli effetti sulla circolazione verme sono stati visti. Un forte calo bioluminescenza rispetto ai controlli occuRred alla concentrazione più bassa di rotenone testato 2,5 pM, per cui effetti non sono stati rilevati facilmente mediante osservazione visiva rapida in 2 ore di esposizione. Questo calo della bioluminescenza è coerente con ridotta ATP cellulare. L'inibizione massima è stata ottenuta con la più bassa concentrazione di rotenone utilizzato (2.5 mM) indicante che qualsiasi esperimenti successivi specificamente destinati rotenone devono essere eseguite tra 0 e 5 mM [intervallo di concentrazione 0-160 mM è stato selezionato come parte di un confronto con altri farmaci inizialmente identificate come aventi effetti significativi a 10 micron (che sarà pubblicato altrove)].

Il paraquat erbicidi colpisce la funzione mitocondriale attraverso aumento di specie reattive dell'ossigeno. Qui, dimostriamo il suo effetto sulla bioluminescenza di C. elegans ceppo PE254 dopo esposizione ad una gamma di concentrazioni per 24 ore (Figura 2). Come il ceppo porta un luc :: fusione GFP, GFP fluorescenza era also misurata come mezzo di normalizzazione. ^6,9 Paraquat diminuito bioluminescenza, GFP fluorescenza e bioluminescenza normalizzato significativamente. Il test post-hoc Dunnet indicato che le concentrazioni di paraquat con significative differenze rispetto al controllo del veicolo erano 4 e 8 mm per bioluminescenza e bioluminescenza normalizzato, nonché 2 mM per bioluminescenza normalizzata. L'unica concentrazione di ridurre in modo significativo fluorescenza GFP è stato di 8 mm, concentrazione alla quale gli effetti di crescita e la vite senza fine morti occasionali sono stati osservati (osservazioni qualitative). Il calo bioluminescenza (bioluminescenza e normalizzato) era maggiore di quella della fluorescenza, coerente con riduzione della funzione mitocondriale e effetti sulla produzione di ATP.

L'ossalacetato intermedio ciclo dell'acido citrico testato su C. elegans ceppo PE254 ad un'unica concentrazione di 8 mM, ha portato ad un aumento della bioluminescenza (Figura 3). Nessun GFP fluorescenzamisurazioni SNO sono state ottenute o osservazione visiva supplementare svolte; tuttavia tale risposta ad una concentrazione unica meriterebbe ulteriore esposizione di conferma a una serie di concentrazioni, e le osservazioni più dettagliate degli effetti. Un miglioramento della bioluminescenza da questo composto non è sorprendente in quanto si può ipotizzare di portare ad una maggiore attività del ciclo dell'acido citrico, con in definitiva una maggiore produzione di ATP (tuttavia sarebbe preferibile controllare eventuali effetti sui livelli luciferasi valutando fluorescenza GFP in esperimenti successivi). I set di dati ossalacetato mostrati rivelano il grado di variabilità nella risposta visto in esperimenti basati luciferasi. Nella nostra esperienza questa variabilità è una caratteristica del sistema di prova particolarmente per condizioni di esposizione meno dannosi.

La lucciola luciferasi composti inibitori DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 e DDD00023047 sono stati testati in vitro, cercando in effetti sul puenzima rified e in vivo utilizzando il C. elegans luc: GFP che esprimono tensione. Non vi era alcuna prova che nessuno dei composti testati causato la morte di nematodi nelle condizioni di esposizione. Tutti i composti 4 influenzati l'attività luciferasica in vitro alle concentrazioni testate 2 e 100 pM 25 (Figura 4A). DDD00001434 ucciso l'attività della luciferasi purificato quasi completamente, che ha fornito una giustificazione credibile per il forte calo in vivo bioluminescenza (Figura 4B). Anche se, in vitro e in vivo non sono direttamente confrontabili, la risposta a DDD00023047 era simile in entrambi i saggi. DDD0001477 e DDD00000635 causato un calo maggiore in vivo che in vitro. Questi composti sono stati forniti ai vermi vivi 22 ore prima del substrato luciferina, ei risultati possono riflettere sul fatto che non erano facilmente spostati dal sito attivo luciferasi quando luciferina divenne available. In alternativa, DDD0001477 e DDD00000635 possono avere un ulteriore effetto sui livelli di ATP cellulare. Questo avrebbe dovuto essere valutata con mezzi che non comportano luciferasi lucciola. Da segnalare è stata la forte valorizzazione del segnale di GFP in vermi vivi esposti al composto DDD00000635. Questo sarà discusso sotto.

Figura 1. Il complesso I mitocondriale inibitore rotenone diminuito dello stato energetico di C. elegans come misurato da bioluminescenza di ceppo PE254. sincronizzato L4 vermi fase (45-46 ore dopo cibo fornito L1 larve) esposta a 0, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 mM rotenone in 1% DMSO per 2 hr (breve) o 24 ore (lunga esposizione) letture precedenti di bioluminescenza, rispettivamente a 48 e 69 ore di sviluppo verme dopo i pasti forniti. Bioluminescenza (unità relativa unità leggere, RLU) è stata espressa come percentuale del veicolo (1% DMSValori O). Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici per ciascuna concentrazione rotenone (n = 6). Tutte le concentrazioni testate hanno determinato una differenza statisticamente significativa rispetto al controllo del veicolo (p <0.001).

Figura 2. Il paraquat ossidativo stress diminuisce lo stato energetico di C. elegans ceppo PE254 in maniera dipendente dalla concentrazione (misurata mediante bioluminescenza). sincronizzato L4 vermi stadio (per comodità in questo caso a 41 ore dopo cibo fornito L1 larve) sono stati esposti a 0, 0,25, 0,5, 1, 2, 4 o 8 paraquat mM per 24 ore. GFP fluorescenza (unità relativa unità Fluorescenza, RFU) è stato utilizzato per normalizzare i dati bioluminescenza (unità RLU), entrambi gli endpoint ottenuti a 65 ore di sviluppo. I dati sono espressi come percentuale di controlli (1% DMSO). Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici(n = 5 per diverse concentrazioni; n = 18 per i controlli). One-way ANOVA: *** p <0,001 rispetto al controllo del veicolo.

Figura 3. Il ciclo dell'acido citrico ossalacetato intermedio (8 mm) migliorato la bioluminescenza di C. elegans ceppo PE254. Sincronizzato L4 vermi fase (45-46 ore dopo il cibo fornito a larve L1) sono stati esposti a preparati al momento ossalacetato mm 8 per 18 ore ± 30 min. Bioluminescenza (unità RLU) è stato letto in un momento dello sviluppo di 63,5 ore ± 1 ora ed è stata espressa come percentuale del controllo del veicolo _(DDH 2 O). Diverse colonne rappresentano diversi set di dati di 8 repliche tecniche destinate a diverse piastre da 96 pozzetti all'interno dello stesso esperimento. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici (n = 8). 2 vie-ANOVA con 'set' e 'la concentrazione' come fattori: ̵6; Set 'p> 0.05,' concentrazione 'p <0.001 e termine di interazione p> 0,05.

La

B

Figura 4. Prove di risposte alle 4 composti dalla scoperta di nuovi farmaci biblioteca composto Dundee ¹³ (C1: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 e C4: DDD00023047) con nota attività inibitoria su Firefly luciferasi luminescenza. (A) Effetto di composti sull'attività dei purificato lucciola luciferasi (misurata come unità di luce, RLU), espresso come percentuale del controllo del veicolo. Il kit di bioluminescenza CLSII ATP (Roche, Manheim, Germania) è stato utilizzato in base alle istruzioni con la stessa quantità di enzima luciferasi in aliquote di pozzetti (bianco 96-well micropiastre). ATP è stato fornito ad una concentrazione finale di 10 mM e 1 ml di composto (concentrazione finale indicato) o è stato aggiunto DMSO (1%). Segnale di luminescenza è stato integrato per 10 sec. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici (n = 4). Analisi: One-way ANOVA; * p <0,05 o *** p <0,001 rispetto al controllo del veicolo. Differenze tra 25 e 100 micron molto significativi per C1 (DDD00001434; p <0.001), e significativo per C2 e C3 (rispettivamente DDD0001477 e DDD00000635; p <0,05). (B) in vivo misure di bioluminescenza, bioluminescenza normalizzata a fluorescenza GFP e GFP fluorescenza di C. elegans ceppo PE254 in 67 ore di tempo di sviluppo a seguito di esposizione a composti di prova per 22 ore. Le barre di errore rappresentano SEM di repliche tecnici (n = 8). L'analisi statistica (one-way-ANOVA) condotta su dati raccolti da 3 serie di dati (3 xn = 8). * p <0,05 o *** p <0,001 rispetto al rispettivo controllo del veicolo. Differences tra i 25 ei 100 micron solo statisticamente significativa (p <0.05) per bioluminescenza normalizzato a seguito di esposizione a C4 (DDD00023047).

Ora del giorno	Giorno 1	Giorno 2	3 ° giorno	Giorno 4	5 ° giorno	Giorno 6	Giorno 7	Giorno 8
9-10								Fase 5
10-11								Fase 5
11-12							Fase 4	Fase 5
12-13							Fase 4
13-14
14-15
15-16
16-17	Passo 1				Fase 3
17-18
18-19				Passo 2

Tabella 1. Panoramica delle fasi di protocollo da effettuare in ogni giorno di esperimenti nematode (sezione 3) e ha suggerito timing.

Discussione

L'organismo modello C. elegans fornisce un potente sistema sperimentale. E 'facile da cultura e produce abbondante prole geneticamente identico ad un ciclo di vita di 3,5 giorni da uovo ad adulto riprodurre (via fasi larvali giovanili L1 fino alla L4). Grazie alle sue ridotte dimensioni, può essere coltivata facilmente in piastre a 96 pozzetti, facilitando lo screening composto. Vi presentiamo un protocollo di screening fenotipico sulla base di ceppi di C. elegans che fungono da sensori in vivo dei livelli di energia. ¹⁴ Il protocollo è applicabile a qualsiasi laboratorio, anche se è necessario un luminometro piastra a 96 pozzetti e un armadio sterile. È importante prevenire la contaminazione in saggi utilizzando buona tecnica di laboratorio. Se si opera manualmente, il numero massimo di lastre nematodi ottenibile è 13 per esperimento permettendo la sperimentazione di droga 2x piastre da 96 pozzetti e comprendente due piastre veicolo. I risultati rappresentativi sono presentati per il complesso I mitocondriale inibitore rotenone, il generatore paraquat superossido, il ciclo dell'acido citrico ossalacetato intermedio e quattro composti con nota attività inibitoria lucciola luciferasi. I primi due composti hanno portato ad una diminuzione della bioluminescenza come previsto, mentre ossalacetato ha portato ad un miglioramento, che può derivare dalla maggiore produzione di ATP. I set di dati ossalacetato dimostrano anche la variabilità intrinseca in esperimenti sulla base di luciferasi di lucciola come reporter. Un minimo di tre esperimenti indipendenti sono consigliabili per accertare la robustezza delle risposte ai composti sconosciuti.

Inibizione dell'attività lucciola luciferasi era identificabile con un metodo in vitro utilizzando un kit commerciale. ³ Uno dei composti determinato un notevole aumento fluorescenza GFP coerente con l'inibitore aumentare i livelli di GFP-tag lucciola luciferasi legandosi all'enzima di luciferasi attiva sito, e rendendolo più stabile. ¹⁵ In alcuni casi(non in questo caso particolare) ciò può portare ad un aumento dei livelli di bioluminescenza quando l'inibitore viene spostato da eccesso di substrato. ¹⁵ è, quindi, importante non interpretare i risultati erroneamente da composti che interagiscono con l'enzima lucciola come diminuzione o aumento dei livelli di ATP / funzione mitocondriale. Le variazioni del segnale di luminescenza molto spesso sono correlate con le misure aggiuntive di salute come il movimento, sviluppo e crescita. Come esempio, un composto è un inibitore luciferasi indagato se viene rilevato un drastico calo segnale bioluminescenza ma vermi sono indistinguibili dai controlli di osservazione microscopica. Un aumento di fluorescenza GFP, non spiegato dalla crescita o autofluorescenza composto, può anche puntare a un inibitore. Un certo numero di inibitori luciferasi ¹⁵ sono noti e sono stati inseriti in PubChem. Pertanto, in prima istanza, è buona norma consultare le informazioni sugli inibitori luciferasi detenuti da PubChem; seguito da tressante degli effetti composti in test in vitro con l'enzima purificato ³ e / o la conferma degli effetti sulla funzione mitocondriale con mezzi supplementari. ^16,17

Misure GFP fluorescenza consentono il rilevamento di livelli di luciferasi lucciola (e il potenziale rilevamento di alcuni inibitori enzimatici luciferasi come discusso sopra) facendo un forte caso per misurare questo endpoint accanto bioluminescenza, ove possibile. Normalizzazione delle letture bioluminescenza per GFP è anche un mezzo di contabilizzazione delle variazioni di numeri senza fine tra i pozzi (anche se questo può essere ottenuto anche con l'inclusione di molteplici replicati tecnici). Per una maggiore sensibilità, è importante per sottrarre fluorescenza di fondo dalle letture. Il protocollo valuta contributo della sospensione batterica alla fluorescenza di fondo, tuttavia nematode autofluorescenza non è rappresentato (una limitazione del test corrente, particolarmente critico per qualsiasi stu invecchiamentomuore dato che i nematodi autofluorescenza aumenta con l'età). Autofluorescenza di composti in esame dovrebbe essere valutata anche in parallelo. GFP normalizzazione sembrerebbe indispensabile dove i ricercatori desiderano adattarsi protocollo di confrontare piscine ATP cellulari in diversi mutanti genetici o dopo silenziamento di geni diversi, al fine di controllare eventuali differenze di deformazione a livello di espressione del transgene bioluminescenza.

I parametri critici all'interno del protocollo includono lo stadio di sviluppo in cui viene iniziata l'esposizione, la durata dell'esposizione, e ottenendo un numero simile di nematodi nei diversi pozzetti. L'esposizione può iniziare in qualsiasi stadio di sviluppo dei nematodi, tuttavia fase L3 o più è preferibile. Da questo punto in poi, nematodi dipendono fosforilazione ossidativa per lo sviluppo in età adulta, come evidenziato da un aumento molto significativo contenuto di mtDNA, consumo di ossigeno e livelli di ATP. ^18,19,20 L'attuale protocollo avvia manifestazioniUre allo stadio L4. La ragione per aliquotando nematodi a piastre da 96 pozzetti solo in questa fase (piuttosto che quando sono stati forniti con il cibo alla fase L1), è che anche se le piastre sono posti in camere umide per minimizzare l'evaporazione, un grado di evaporazione avviene ancora in il nostro incubatore agitazione, visto come molto piccole gocce formano sui coperchi (questo potrebbe non essere un problema con altri incubatori tremanti). Aliquotandolo nematodi a piastre appena prima dell'aggiunta standard droga, la concentrazione effettiva di farmaco non è influenzata da qualsiasi piccola variazione di volume per evaporazione. Caricamento di una piastra nematode con veicolo è utile solo per controllare che i nematodi sono stati equamente distribuiti tra i pozzetti. Eventuali differenze significative trovati per il veicolo unico piatto sarebbe indicativo di scarsa tecnica nel dispensare i nematodi a pozzetti.

La durata dell'esposizione è un fattore importante da considerare. Se gli effetti sullo stato di energia indipendente della crescita sono di interesse, proprotocollo può essere modificato per ospitare esposizioni più brevi (da risposte quasi immediate a, per esempio, 2 hr). D'altra parte, l'ingresso di composti in C. tessuti elegans possono richiedere un certo tempo. Per esempio 12-24 ore sono tenuti a raggiungere concentrazioni interne massime di resveratrolo e 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUDR). ²¹ Di conseguenza, di un'esposizione più lunga (da 18 a 24 ore) può essere giustificabile per massimizzare i livelli di esposizione. Il tempo di esposizione deve essere limitata a volte che non permettono livelli significativi di riproduzione avvengano nel pozzo. Si raccomanda che il tempo di sviluppo totale di nematodi è tenuta sotto 66-67 ore. Anche se conveniente, nematodi sono gravida da allora e hanno avviato egglaying. Tuttavia abbiamo trovato letture bioluminescenza da preparazioni a base di uova trascurabile (non mostrato). L'espressione del transgene guidato sur-5 promotore viene dapprima rilevata solo due a due ore e mezzo dopo la fecondazione nella fase 100 ^cella 22 ed il cguscio d'uovo hitinous rischia di limitare l'ingresso di luciferina. Altri hanno trovato che le uova embrionate non hanno contribuito in modo significativo al metabolismo degli adulti gravido. ^{23 Tuttavia,} le condizioni che consentano una significativa produzione di prole sono da evitare. Se si preferisce, la scala cronologica sperimentale può essere spostato indietro: abbiamo già avviato l'esposizione a una tossina ambientale presso il tardo L3 fase larvale (36 ore) e svolto bioluminescenza e GFP misurazioni a 55 ore ² sfondi alternativa, genetiche che sono condizionalmente sterili. può essere usato per prevenire la produzione di progenie, ad esempio la fer-15 (b16) II; fem-1 (hc17) IV doppio mutante che può essere mantenuta a 15 ° C, ma è sterile a 25 ° C. ²⁴ L'uso di FUDR per indurre la sterilità non è raccomandata in quanto può di per sé influenzare il metabolismo dei nematodi. ²⁵ Il test potrebbe essere eseguita anche in ceppi con cuticole più permeabili, come parziale perdita di function bus-8 mutanti che sono multidrug-sensibili a causa di aumentare la permeabilità dei farmaci. ²⁶ Ciò faciliterà le esposizioni più brevi e le concentrazioni di composti minori. Le condizioni per l'aggiunta di luciferina di questi nematodi Potrebbe anche essere necessario regolare ovvero, 1% DMSO e 0,05% Triton-X100 nel buffer luminescenza non può essere richiesto di migliorare la disponibilità luciferina.

Il protocollo utilizza 1% DMSO come veicolo per la consegna composto. Anche se non letali, questa concentrazione di DMSO ha alcuni effetti biologici come abbiamo discusso in una precedente pubblicazione. ³ Molte delle librerie farmaco disponibile è redatto in 100% DMSO, a concentrazioni che saranno adatti per dosaggi cellulari dopo la diluizione del veicolo al 0,1%. Le concentrazioni più elevate composti sono tenuti a ottenere risposte in C. elegans rispetto alle cellule umane, in modo tale che spesso non è possibile condurre saggi a inferiore all'1% DMSO. Ancora una volta, l'uso di ceppi conpiù cuticole permeabili possono portare a test con concentrazioni più basse di veicolo. Le concentrazioni di DMSO superiore all'1% non sono raccomandati.

Un tempo impostato incubazione con luciferina prima lettura dovrebbe essere rispettata. Come precedentemente illustrato, luminescenza raggiunge i suoi livelli massimi nel secondo minuto dopo l'aggiunta luciferina, rimanendo relativamente stabile per i primi 5 minuti, seguito da una lenta diminuzione graduale luminescenza nel prossimo 30 min ^1. Risposte cinetica per una particolare sostanza chimica può essere effettuata durante la fase iniziale di 30 minuti dopo l'erogazione iniziale di luciferina.

Il protocollo prevede una fase di inedia dopo la raccolta delle uova per ottenere la sincronizzazione della popolazione di nematodi. Si consiglia la sincronizzazione delle popolazioni di prova nematode da diversi stadi di sviluppo si differenziano per livelli di ATP cellulare e possono rispondere in modo diverso ai composti di prova. Effettuando la fame in S completomedio rispetto a M9, i nematodi cova sono dotati di una fonte di carbonio (etanolo), in modo che le larve non sviluppano ma non sono completamente affamate. ^27,28 È stato anche dimostrato che arrestato L1 del sono innescato di risposta rapida e cibo normale crescita L1 viene raggiunta entro 3 ore dopo il cibo diventa disponibile. ²⁹ Tuttavia, la possibilità che la fase inedia può alterare il metabolismo di C. elegans non può essere escluso. ³⁰ Per questo motivo la lunghezza di fame non deve superare 24 ore (18 ore è sufficiente per la sincronizzazione). Alcuni laboratori possono avere la possibilità di utilizzare una Copas Biosorter per la sincronizzazione età scavalcando il passo inedia del tutto. Altri laboratori possono avere una preferenza per l'espansione della popolazione di nematodi su terreni solidi (piastre NGM con OP50) prima di sbiancamento (passo 3.1) e questo funziona bene anche. Usiamo S medio durante l'esposizione composto come mezzo standard per nematode coltura, however altri mezzi possono essere selezionati, per esempio K medio o EPA moderatamente acqua dura vengono spesso utilizzati per gli studi ecotossicologici. ^31,32

Il protocollo fornisce un mezzo per lo screening e per individuare i candidati per ulteriori test in termini di effetti sulla funzione mitocondriale. Nella fase di screening primario, è probabile che alcuni composti saranno state perse a causa di una sola concentrazione in fase di test, pertanto schermi di droga non devono essere considerate esaustive. Hits possono essere convalidati con l'uso di tecniche di valutazione diversi aspetti della funzione mitocondriale per il consumo ad esempio ossigeno, C. elegans Ceppi con GFP esprimere mitocondri, macchie di potenziale di membrana mitocondriale e / o misurazioni ROS. ^16,33,34 La maggior rilievo della metodologia è di avere un mezzo per lo screening gran numero di composti e / o le condizioni a livello organismal multicellulare, e soprattutto per poter usufruire di the trattabilità genetica di C. elegans per indagare meccanismi di azione. La tecnica può aiutare ad accelerare e trovare nuovi percorsi alla scoperta di composti e obiettivi interessanti. Si prevede che la combinazione del sensore con sfondi genetiche associate con la malattia umana per lo screening di librerie di composti in un contesto rilevante malattia avrà molto da offrire.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Orion II Microplate Luminometer	Berthold Detection Systems		con iniettore e il software Simplicity 4.2; trasferimento dei dati in Excel al termine della misurazione della piastra
FLx800 fluorimetro	Biotek		con software Gen5; trasferimento dei dati in Excel al termine della misurazione della piastra
Ks 130 piattaforma di agitazione di base	Ika	#0002980000
Innova 4349	New Brunswick Scientific		Agitatore per incubatore refrigerato
Eppendorf centrifuga 5804R	Eppendorf		con rotore eppendorf A-4-44  (per 50/15  Stripette
, Costar	Corning	#4489	Pipetta sierologica
Cellstar Provette da 50 ml	Greiner bio-one	#227661
Cellstar Provette da 15 ml	Greiner bio-one	#188261
Cellstar Piastre per coltura tissutale da 60 mm	Greiner bio-one	#628160
Superfrost Vetrini per microscopio	VWR	#631-0909
Spatola sterile	Corning	#3007; #3004	per pesare sostanze chimiche
0,22 mM Filtri Millex GP	Millipore	#SLGP033RS
Axygen Eppendorf provette 1,5 ml	Fisher Scientific	#MCT-150-R
Corning 96 piastra per saggi a 96 pozzetti	VWR	#3603	Piastra nera fondo trasparente con coperchio
Piastra per saggi a pozzetti Nunc 96	Fisher Scientific	#236105	Piastra bianca con coperchio
Reagente serbatoio 60 ml	Thermo Scientific Finnpipette	#9510027	utilizzato come trogolo per i nematodi nella sezione del protocollo 4.4.1
Scatola di stoccaggio/camera umida	Roche Diagnostics	#10 800 058 001	174 x 101 x 56,6 mm, utilizzato come camera umida con salviette di carta bagnate; 2 piastre da 96 pozzetti con coperchi possono entrare in una, la parte inferiore si trova sopra un coperchio per micropiastre
Candeggina: Soluzione di ipoclorito di sodio 4-4,99% Contenuto di cloro	Sigma Aldrich	#239305	Conservare in aliquote a 4  ° C,  sigillare con Parafilm per evitare la perdita di cloro e coprire in un foglio
D-luciferina, sale di potassio	Biotium Inc	# 10101-2	Le sonde molecolari possono essere utilizzate anche come fornitore; preparare uno stock di 20 mM in ddH2O, mantenere a -20 ° C in aliquote
[header]
Tween 20	Sigma Aldrich	# P9416
DMSO	CalBiochem	#317275	Purezza 99.99%
Triton X100	Alfa Aesar	#A16046	Diltute al 10% in ddH2O
Nistatina	CalBiochem	#475914
C. elegans ceppi bioluminescenti	I	PE254 e PE255	contengono array integrati feIs4 e feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] rispettivamente sui cromosomi V e X; selezionare per l'espressione omogenea e forte di luc::GFP mediante microscopia a fluorescenza (ad esempio raccogliere 15 vermi) di tanto in tanto.
E. coli OP50	CGC
Prodotti chimici generici	Sigma Aldrich/Fisher Scientific