Le cellule Caco-2 possono servire come modello in vitro per studiare il trasporto degli enterociti dei lipidi e dei farmaci/vitamine liposolubili. Il sistema di membrane permeabili separa il compartimento apicale da quello basolaterale, mentre il sistema di espressione del lentivirus offre un metodo efficace di sovraespressione genica. L'isolamento delle lipoproteine è confermato dalla TEM.
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Articolo metodologico
Utilizzando cellule Caco-2 allo Studio Lipid Trasporto dall'intestino
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli studi sull'assorbimento dei grassi alimentari sono generalmente condotti utilizzando un modello animale dotato di una cannula linfatica. Sebbene questo modello animale sia ampiamente accettato come modello in vivo di assorbimento dei grassi nella dieta, le tecniche chirurgiche coinvolte sono impegnative e costose. La manipolazione genetica del modello animale è anche costosa e richiede tempo. Il modello alternativo in vitro è probabilmente più conveniente, fa risparmiare tempo e meno impegnativo. È importante sottolineare che il modello in vitro consente agli investigatori di esaminare gli enterociti come un sistema isolato, riducendo la complessità inerente all'intero modello di organismo. Questo articolo descrive come le cellule di carcinoma del colon umano (Caco-2) possano fungere da modello in vitro per studiare il trasporto degli enterociti dei lipidi e dei farmaci liposolubili e delle vitamine. Spiega il corretto mantenimento delle cellule Caco-2 e la preparazione della loro miscela lipidica; E discute ulteriormente la preziosa opzione di utilizzare il sistema a membrana permeabile. Poiché le cellule Caco-2 differenziate sono polarizzate, il vantaggio principale dell'utilizzo del sistema a membrana permeabile è che separa il compartimento apicale da quello basolaterale. Di conseguenza, la miscela lipidica può essere aggiunta al compartimento apicale mentre le lipoproteine possono essere raccolte dal compartimento basolaterale. Inoltre, viene discussa l'efficacia del sistema di espressione del lentivirus nell'upregolazione dell'espressione genica nelle cellule Caco-2. Infine, questo articolo descrive come confermare il successo dell'isolamento delle lipoproteine intestinali mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
Introduzione
Studi di assorbimento intestinale dei grassi alimentari e farmaci e vitamine liposolubili possono essere condotti in vivo, utilizzando un modello di fistola linfatica 1-4. Tuttavia, le tecniche chirurgiche coinvolte non sono solo una sfida, ma anche costoso. Sebbene in vivo approcci basati sull'analisi fecale possono essere utilizzati, sono utilizzati principalmente per determinare la percentuale di assorbimento dal tratto gastrointestinale 2,5. Il modello in vitro descritto in questo documento è più conveniente, e le tecniche coinvolte sono forse meno impegnativo. Studi modificazione genetica sono anche più economici e quando sono condotti utilizzando questo modello in vitro in termini di tempo di meno.
Poiché i materiali liposolubili che sono presi da enterociti sono confezionati in lipoproteine 6,7, l'efficacia di questo modello in vitro per produrre lipoproteine è cruciale. Le due intestina principalel lipoproteine sono chilomicroni e molto lipoproteine a bassa densità (VLDL). Chilomicroni, definiti come lipoproteine a 80 nm o più di diametro, sono prodotti rigorosamente dal piccolo intestino quando sono abbondantemente presenti nel lume gastrointestinale lipidi. Dal momento che sono i più grandi lipoproteine, chilomicroni sono plausibilmente i trasportatori lipidici più efficienti. Questo modello in vitro, che è capace di produrre chilomicroni 8, può essere usato per studiare l'assorbimento grassi, liposolubile vitamina assorbimento da parte dell'intestino e biodisponibilità orale lipofilo. La presenza di molecole liposolubili, vitamine o farmaci nella frazione lipoproteina è un indicatore della loro assorbimento da parte dell'intestino tenue. Come discusso in precedenza, questo modello può essere utilizzato per migliorare la biodisponibilità orale farmaco lipofila 6.
Questo documento descrive come cellule Caco-2 dovrebbero essere mantenute in membrana permeabile o regolari piastre di coltura dei tessuti, come le mi lipidixture per stimolare la produzione di lipoproteine dovrebbe essere preparato, come il sistema di espressione lentivirus può essere impiegato per realizzare sovraespressione efficace, e come dovrebbe essere analizzato lipoproteine isolate.
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Protocollo
1. Manutenzione delle cellule Caco-2
- Utilizzando regolari piastre di coltura tissutale
- Scongelare le cellule Caco-2 da una fiala congelata ponendo la provetta in un bagno d'acqua a 37 °, e subito aggiungerli a un piatto di coltura di tessuto al 10 cm contenente 10 ml di terreni di crescita (siero bovino fetale pre-riscaldato 15% (FBS ) in Dulbecco modificato (DMEM)).
- Quando le cellule Caco-2 hanno raggiunto 50-70% di confluenza, dividerle 1: 6 incubando le cellule con 3 ml di 0,05% tripsina / 0.53 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a 37 ° C fino a quando sono staccati (15 min) . Per evitare aggregazione cellulare, mescolare le cellule più volte delicatamente pipettando. Aggiungere 0,5 ml di cellule trypsinized ad un piatto di coltura di tessuto al 10 cm contenente 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato.
- Agitare delicatamente i piatti più volte in avanti e indietro, seguito da una direzione verso sinistra e verso destra. Evitare vorticoso i piattiin quanto può provocare una dispersione delle cellule disuguale.
- Porre le capsule su una superficie piana in un incubatore a 37 ° in dotazione con il 5% di CO 2. Superfici inclinate possono anche provocare una dispersione cellulare disuguale.
- Modificare i media di crescita di un giorno dopo l'avvio l'incubazione.
- Monitorare le cellule e registrare la giornata raggiungono confluenza. Ci vorrà circa 1 settimana per le cellule di raggiungere confluenza dal giorno in cui sono divisi.
- Modificare i mezzi di crescita due volte la settimana prima che le cellule raggiungono confluenza. Una volta che le cellule hanno raggiunto confluenza, modificare i mezzi di crescita ogni altro giorno. Dopo che le cellule sono 7 giorni post-confluenti, modificare i mezzi di crescita giornaliera.
Nota: Le cellule sono pronte per esperimenti quando sono 13 giorni post-confluenti (Figura 1). Dal momento che le cellule diventeranno meno efficace nel produrre lipoproteine, usare le cellule che si trovano tra i 13 ei 17 giorni dopo confluenti 8. Andare al punto 3 su come condurre l'esperimento.
- Scongelare le cellule Caco-2 da una fiala congelata ponendo la provetta in un bagno d'acqua a 37 °, e subito aggiungerli a un piatto di coltura di tessuto al 10 cm contenente 10 ml di terreni di crescita (siero bovino fetale pre-riscaldato 15% (FBS ) in Dulbecco modificato (DMEM)).
- Utilizzando il sistema di membrana permeabile
- Seme le cellule Caco-2 nel foglietto membrana permeabile come descritto al punto 1.1.1.1. sopra. Evitare l'uso di cellule da un flaconcino congelato perché la loro crescita cellulare è normalmente più lento (periodo di recupero). Brevemente, aggiungere 0,5 ml delle cellule trypsinized alla camera apicale (scomparto superiore) contenente 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato. Inoltre, aggiungere 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato alla camera basolaterale (scomparto inferiore).
Nota: per le migliori prassi, aggiungere i media di crescita alla camera apicale e poi alla camera basolaterale. Durante la rimozione dei vecchi media, rimuovere il supporto basolaterale prima che i media apicali. Evitare colpendo la membrana di policarbonato in quanto potrebbe rompere la membrana. - Grazie alla visibilità delle cellule poveri attraverso la membrana in policarbonato, seminare le cellule Caco-2 in un piatto di coltura tissutale regolare con densità simile, e utilizzare questo piatto per giudicare la confluenza delle cellule.
- Segui steps 1.1.2-1.1.6 sopra.
- Seme le cellule Caco-2 nel foglietto membrana permeabile come descritto al punto 1.1.1.1. sopra. Evitare l'uso di cellule da un flaconcino congelato perché la loro crescita cellulare è normalmente più lento (periodo di recupero). Brevemente, aggiungere 0,5 ml delle cellule trypsinized alla camera apicale (scomparto superiore) contenente 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato. Inoltre, aggiungere 10 ml di terreni di crescita pre-riscaldato alla camera basolaterale (scomparto inferiore).
2. Gene Overexpression
- Utilizzando l'approccio trasfezione regolare
- Seme le cellule Caco-2 su un piatto di coltura di tessuti, come descritto nella 1.1.1.1.-1.1.4 sopra.
Nota: Quando le cellule sono circa il 40-50% confluenti, sono pronti per essere transfettate. - Aggiungere 67 ml di reagente trasfezione a 472 l di media siero ridotti in una provetta. Evitare il contatto del reagente di trasfezione diluito con la parete del tubo.
- Aggiungere 23 mg di pLL3.7 rafforzata proteina fluorescente verde (eGFP) 9 in / ridotto miscela Mezzi di siero di reagenti di trasfezione.
- Incubare la miscela per 20 minuti a RT.
- Sostituire mezzi di crescita delle cellule Caco-2 'con 8 ml di 10% FBS in DMEM.
- Aggiungere il composto DNA / reagente trasfezione / ridotto supporto siero goccia a goccia al piatto.
- Agitare delicatamente i piatti più volte in un avanti e badirezione ckward seguita da una direzione verso sinistra e verso destra.
- Porre la capsula nel C incubatore 37 °.
- Sostituire il supporto nel piatto con 10 ml di terreni di crescita giorno dopo l'avvio l'incubazione.
- Monitorare l'espressione genica.
- Monitorare l'espressione genica senza 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) colorazione. Utilizzando un microscopio a fluorescenza, determinare la percentuale di cellule che sono verde. La percentuale rappresenta l'efficienza di trasfezione.
- Monitorare l'espressione genica con colorazione DAPI.
- Lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) tre volte.
- Fissare le cellule aggiungendo 10 ml di formaldeide al 4% in PBS (10 min di incubazione a RT).
- Lavare le cellule con PBS per tre volte.
- Incubare le cellule al buio per 15 minuti a RT con 8 ml di PBS contenente 1: 500 DAPI, 1% BSA, 0,01% digitonina.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte.
- Ucantare un microscopio a fluorescenza, determinare il numero di cellule che sono verde / blu rispetto a quelli che sono blu (Figura 2 pannello superiore). La percentuale calcolata rappresenta l'efficienza di trasfezione.
- Seme le cellule Caco-2 su un piatto di coltura di tessuti, come descritto nella 1.1.1.1.-1.1.4 sopra.
- Utilizzando il sistema sovraespressione lentivirus 10
- Seme umano rene embrionale (HEK) le cellule 293T in un 15 centimetri piatto di coltura tissutale (10% FBS in DMEM come loro mezzi di crescita).
Nota: Quando le cellule sono circa il 60-70% confluenti, sono pronti per essere transfettate. - Aggiungere 162 ml di reagente trasfezione di 1.133 l di media siero ridotti in una provetta 11. Evitare il contatto del reagente di trasfezione diluito con la parete del tubo.
- Aggiungere 24 mg di pLL3.7 eGFP (o un altro costrutto), 15,6 mg di elemento risposta Rev (RRE), 6.0 mg di REV, e 8,4 mg di vescicolare glicoproteina virus della stomatite (VSVG) nel reagente trasfezione / reduced miscela Mezzi di siero.
- Incubare la miscela per 20 minuti a RT.
- Sostituire il supporto di crescita con 16 ml di 10% FBS in DMEM.
- Aggiungere il composto DNA / reagente trasfezione / ridotto supporto siero goccia a goccia al piatto.
- Agitare delicatamente i piatti più volte in avanti e indietro, seguito da una direzione verso sinistra e verso destra. E 'normale vedere alcune delle cellule HEK293T distaccati a questo punto.
- Porre la capsula in incubatrice.
- Dopo 24 ore di incubazione, sostituire il supporto nel piatto con 25 ml di terreni di crescita.
- Il giorno seguente, raccogliere i mezzi di crescita contenente il lentivirus (prima raccolta).
- Ripetere il punto 2.2.10 per raccogliere più lentivirus (la seconda raccolta).
- PISCINA La prima e la seconda raccolta, e rimuovere detriti cellulari mediante centrifugazione (2500 xg per 5 min).
- Filtrare la collezione con un filtro a perdere per bottiglia (0,45 micron pori), econcentrare il virus mediante centrifugazione dalla collezione 31.400 xg per 2 ore a temperatura ambiente (JA-20 rotore). Contrassegnare il fondo della provetta in cui si trova il pellet. Decantare il surnatante, e lasciare la provetta capovolta a temperatura ambiente per circa 15 min.
- Risospendere il pellet contenente il virus con 100 ml di PBS 1X. Evitare bolle.
- Conservare il virus concentrato a -80 ° C. Evitare cicli di congelamento-scongelamento.
- Determinare la quantità ottimale di virus necessari per trasdurre cellule Caco-2 mediante titolazione. Per risparmiare sui costi, utilizzare una piastra da 24 pozzetti (0,3 ml di crescita media / pozzo) invece di un piatto di coltura di tessuti 10 centimetri per la titolazione.
- Aggiungere quantità crescenti del virus concentrati (0, 1, 2, 5, 10, 25, e 50 ml / pozzetto) supplementato con polibrene (concentrazione finale = 5 mg / ml) al 40-70% confluenti cellule Caco-2. Agitare la piastra da 24 pozzetti dolcemente, come descritto al punto 1.1.2.
- Monitorare la loro espressione genica (Fase 2.1.10.) (Figura 2 bottom4 pannelli).
- Dal momento che l'espressione del transgene è generalmente sostenuta, di mantenere le cellule trasdotte per futuri esperimenti e monitorare continuamente la loro espressione genica (Step 2.1.10.).
- Seme umano rene embrionale (HEK) le cellule 293T in un 15 centimetri piatto di coltura tissutale (10% FBS in DMEM come loro mezzi di crescita).
3. stimolare la secrezione Lipoprotein
- Utilizzando la normale piatto di coltura tissutale
- Preparare una miscela di lipidi 100X mescolando 50 mg di acido oleico, 40 mg di lecitina, e 48 mg di sodio taurocolato. Portare il volume a 900 ml con PBS (sufficiente per 8 piatti). Vortex la miscela lipidica vigorosamente.
- Aggiungere 900 ml di miscela lipidica 100X in 89,1 ml di terreni di crescita. Mescolare e filtrare i media lipidi contenenti. Le concentrazioni finali (1X) di acido oleico, lecitina e sodio taurocolato sono 2,0 mM, 1,36 mM e 1,0 mM, rispettivamente.
- Aggiungere 10 ml di media-lipidico contenente alle cellule.
- Incubare le cellule con i media lipidi contenenti per 4 ore a 37° C incubatore.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte.
- Aggiungere 10 ml di mezzi di crescita per le cellule a raccogliere la secrezione delle lipoproteine.
- Incubare per 2 ore in un incubatore a 37 °.
- Raccogliere la media-lipoproteine contenenti.
- Utilizzando il sistema di membrana permeabile
- Seguire i passaggi 3.1.1-3.1.2 per preparare la miscela lipidica.
- Aggiungere 10 ml di media-lipidico contenente alla camera apicale e 10 ml di mezzi di crescita alla camera basolaterale.
- Incubare per 4 ore in un incubatore a 37 °. Raccogliere la media-lipoproteine contenenti nella camera basolaterale.
4. Lipoprotein Isolation (Figura 3)
- Rimuovere i detriti cellulari dal supporto lipoproteine contenenti mediante centrifugazione (2000 xg per 5 min).
- Decantare i mezzi di comunicazione in un tubo da 50 ml.
- Aggiungere 5,95 g di cloruro di sodio ai media.
- Se la sample sarà analizzata dal TEM, aggiungere 1 inibitore della proteasi cocktail della tavoletta per garantire l'integrità delle lipoproteine.
- Portare il volume a 23 ml con acqua (1,2 g / ml NaCl soluzione densità).
- Sciogliere completamente soluti.
- Decantare tutta la soluzione in un tubo di policarbonato ultracentrifuga.
- Sovrapporre delicatamente la soluzione densità di 1,2 g / ml con 0,5 ml di acqua (1,0 g / ml densità).
- Bilanciare il tubo in peso e non in volume.
- Caricare delicatamente i tubi nel rotore T865.
- Spin i campioni nel ultracentrifuga a 429.460 xg per 24 ore a 4 ° C.
- Immediatamente isolare la parte superiore di 0,5 ml di soluzione delicatamente pipettando. Mantenere il tubo più fermi possibile.
Analisi 5. TEM
- Preparare 5 ml di 2% di acido fosfotungstico (w / v) e regolare il pH a 6,0.
- Filtrare l'acido fosfotungstico 2% con un filtro a siringa (dimensione dei pori: 0,2 um).
- Goccia 20 ml di campione lipoproteina su un piatto sterile.
- Goccia 20 ml di 2% di acido fosfotungstico filtrato accanto al campione sullo stesso piatto.
- Cadere delicatamente una griglia EM con il lato opaco appoggiata sul campione.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 min.
- Battere delicatamente il lato della griglia EM su una carta da filtro per rimuovere il campione dalla griglia.
- Rilasciare delicatamente la griglia EM con il lato opaco appoggiato sul acido fosfotungstico 2%.
- Incubare a temperatura ambiente per 1 min.
- Battere delicatamente il lato della griglia EM su una carta da filtro per rimuovere l'acido fosfotungstico dalla rete.
- Utilizzando un TEM, catturare le immagini delle lipoproteine (Figura 4).
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Risultati
Figura 1 visualizza normali 13 giorni post-confluenti cellule Caco-2. La comparsa di strutture a forma di cupola e gocce lipidiche intracellulari sono caratteristici di differenziate cellule Caco-2. Quando le cellule Caco-2 non sono dispersi ugualmente durante la semina, si ciuffo e invadere in alcune zone del piatto; e ci saranno alcune aree nel piatto, senza tutte le cellule. Vorticoso e mettendo il piatto su una superficie inclinata deve essere evitata. E 'anche importante notare che il post-conf...
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Discussione
In questo documento, i due sistemi che possono essere utilizzati per mantenere cellule Caco-2 sono descritte, cioè, il piatto di coltura tissutale regolare e la membrana permeabile. I vantaggi di utilizzare il sistema di membrana permeabile includono la separazione del apicale e basolaterale compartimenti, e la capacità di incubare la miscela lipidica e raccogliere la secrezione lipoproteina simultaneamente. Tuttavia, gli inserti membrana permeabile sono costosi, e la loro membrana di policarbonato non consentono una bu...
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Seed Grant Award del California Northstate University College of Pharmacy (a AMN). Gli autori desiderano ringraziare il California Northstate University College of Pharmacy per aver coperto il costo di pubblicazione di questo articolo e George Talbott per il suo aiuto nella revisione di questo manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | VWR | 16750-112 | Preriscaldare il terreno di coltura in una singola piastra di coltura tissutale prima di aggiungere le cellule |
| FBS | Fisher | 3600511 | Non inattiviamo il nostro siero |
| Tripsina | VWR | 45000-660 | Le cellule possono essere lavate con PBS prima del trattamento con tripsina... |
| Sistema a membrana permeabile | Fisher | 7200173 | Piastra da 10 cm, dimensione dei pori 3 mm, membrana in policarbonato |
| Piastra da 10 cm | Fisher | 08-772-E | Piastra per coltura tissutale |
| Piastra da 15 cm | Fisher | 08-772-24 | Piastra per coltura tissutale |
| Piastra da 24 pozzetti | Fisher | 12565163 | Piastra per coltura tissutale |
| Reagente di trasfezione a base di lipidi | Fisher | PRE2691 | Può essere sostituito con un altro reagente di trasfezione |
| Terreno di coltura sierologico ridotto | Invitrogen | 11058021 | Per la trasfezione |
| pLL3.7 eGFP | Addgene | 11795 | https://www.addgene.org/11795/ |
| Filtro per flaconi | Fisher | 9761120 | 0,45 mm poro |
| Polybrene | Fisher | NC9840454 | 10 mg/ml |
| Acido oleico | Sigma | 01383-5G | Prevenire il ciclo di gelo-scongelamento |
| Lecitina | Fisher | IC10214625 | Lecitina d'uovo |
| Taurocolato di sodio | Fisher | NC9620276 | Prodotto fuori produzione; numero di catalogo alternativo: 50-121-7956 |
| Compressa cocktail di inibitori della proteasi (senza EDTA) | Fisher | 5892791001 | Utilizzato principalmente per campioni che necessitano di analisi TEM |
| Provetta per ultracentrifuga in policarbonato | Fisher | NC9696153 | Riutilizzandolo più volte si collasserà la provetta |
| Coperchio per provetta per ultracentrifuga | Fisher | NC9796914 | È necessario uno strumento per rimuovere il tubo/coperchio dal rotore |
| Siringa | Fisher | 50-949-261 | Filtro siringa monouso |
| Fisher | 09-719C | Dimensione dei pori = 0,2 mm; nylon | |
| Acido fosfotungstico | Fisher | AC208310250 | Per la preparazione di acido fosfotungstico al 2%, pH 6,0 |
| Pinzetta | Fisher | 50-238-62 | Extra fine e punte forti |
| Formvar/griglia in carbonio | Fisher | 50-260-34 | Formvar/film in carbonio griglia quadrata 400 Rame |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
