In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology

Sommario

La microreologia di tracciamento delle particelle studia la viscoelasticità dei materiali. Qui, la tecnica viene utilizzata per determinare la viscoelasticità, la conformità allo scorrimento e i ruoli di reticolazione efficace di diversi componenti della matrice di un biofilm batterico. La matrice è costituita da sostanze polimeriche secrete dai batteri e i suoi componenti determinano la struttura del biofilm e le proprietà meccaniche.

Abstract

Le cellule batteriche sono in grado di formare comunità di biofilm attaccate alla superficie note come biofilm racchiudendosi in sostanze polimeriche extracellulari (EPS). L'EPS funge da impalcatura fisica e protettiva che ospita le cellule batteriche ed è costituito da una varietà di materiali che include proteine, esopolisaccaridi e DNA. La composizione dell'EPS può cambiare, il che rimodella le proprietà meccaniche del biofilm per sviluppare ulteriormente o supportare strutture di biofilm alternative, come gli streamer, in risposta a stimoli ambientali. Nonostante ciò, ci sono poche descrizioni quantitative su come i componenti dell'EPS contribuiscano alle proprietà meccaniche e alla funzione dei biofilm. La reologia, lo studio del flusso della materia, è di particolare rilevanza per i biofilm poiché molti biofilm crescono in condizioni di flusso e sono costantemente esposti a sollecitazioni di taglio. Fornisce inoltre misurazioni e informazioni sulla diffusione del biofilm su una superficie. Qui, la microreologia a tracciamento delle particelle viene utilizzata per esaminare la viscoelasticità e i ruoli di reticolazione efficace di diversi componenti della matrice in varie parti del biofilm durante lo sviluppo. Questo approccio consente ai ricercatori di misurare le proprietà meccaniche dei biofilm su microscala, il che potrebbe fornire informazioni utili per il controllo e l'ingegnerizzazione dei biofilm.

Introduzione

La maggior parte delle cellule batteriche sono in grado di utilizzare sia (sessili) le modalità superficiali allegato di crescita ¹ planctonici (senza vita) e. Nella modalità superficie divisoria di crescita, le cellule batteriche secernono e si racchiudono in grandi quantità di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) per formare biofilm. L'EPS consiste principalmente di proteine, DNA extracellulare esopolisaccaride, ed è essenziale per la formazione di biofilm ^2. Serve come un'impalcatura fisico da cui i batteri possono utilizzare per differenziare spazialmente e protegge i batteri da condizioni ambientali nocive e le risposte di accoglienza. Diversi componenti di EPS hanno ruoli distinti nella formazione di biofilm ³ ei cambiamenti nell'espressione di componenti EPS può drammaticamente rimodellare strutture biofilm ^4. Componenti EPS possono anche funzionare come molecole di segnalazione ^5, e studi recenti hanno dimostrato alcuni componenti EPS interagiscono con le cellule microbiche per guidare le loro diff migrazione e biofilmerenziazione ^6-8.

La ricerca sulla EPS è notevolmente avanzato sulla base delle analisi morfologiche del biofilm prodotti da mutanti difettosi in un componente specifico dei EPS ^9,10. Inoltre, l'EPS è generalmente caratterizzato alla macro-scala (caratterizzazione bulk) ^11. Morfologica analizza però può mancare dettaglio quantitativa e la caratterizzazione di massa, che restituisce i valori medi, perde dettaglio che esiste all'interno della eterogeneità del biofilm. Vi è ora una tendenza crescente per avanzare al caratterizzazione in tempo reale delle proprietà meccaniche di EPS in microscala. Questo protocollo dimostra come particella-tracking microrheology è in grado di determinare gli effetti spazio-temporali delle componenti della matrice Pel e esopolisaccaridi Psl sulla viscoelasticità ed efficace reticolazione di Pseudomonas aeruginosa biofilm ^4.

Microrheology passiva è un rh semplice e poco costosoMetodo eology che offre il massimo throughput di campionamento microrheological spaziale di un materiale ad oggi ^12,13. In microrheology passiva, sfere sonda vengono inseriti nel campione e il loro moto browniano, guidato da energie termiche (k _B T) è seguita da microscopio video. Diverse le particelle possono essere monitorati contemporaneamente, e le coordinate dipendenti dal tempo delle particelle seguono un random walk convenzionale. Pertanto, in media, le particelle rimangono nella stessa posizione. Tuttavia, la deviazione standard degli spostamenti o spostamento quadratico medio (MSD) delle particelle, non è zero. Poiché scorrono fluidi viscosi, la particella MSD in un fluido viscoso cresce linearmente con il tempo progredisce. Al contrario, la reticolazione polimerica trovato in viscoelastica o sostanze elastiche aiutare loro di resistere flusso, e particelle diventa limitato nel loro spostamento, portando a plateau nella curva MSD (Figura 1A). Questa osservazione segue la relazione MSDαt ^{α, dove α è l'esponente diffusiva che è rapporto tra contributi elastici e viscosi della sostanza correlata. Per le particelle si muovono in fluidi viscosi alfa = 1, a sostanze viscoelastiche 0 <α <1, e in sostanze elastiche α = 0. L'MSD può essere utilizzato anche per calcolare l'osservanza creep, che è la tendenza del materiale a deformarsi in modo permanente su tempo e stima quanto facilmente un diffonde materiali.}

La chimica dimensioni, la densità e la superficie della particella sono fondamentali per la corretta applicazione delle esperimento microrheological e sono scelti in relazione al sistema studiato (in questo caso i polimeri della matrice biofilm, vedere Figura 1B). In primo luogo, la particella misura la reologia della sostanza con strutture che sono molto più piccola della particella stessa. Se le strutture della sostanza sono di dimensioni simili alla particella, il moto del particolo è perturbata dalla forma e l'orientamento delle singole strutture. Tuttavia, se le strutture circostanti particella sono molto più piccoli, questo effetto è piccola e media, presentando un ambiente omogeneo alla particella (Figura 1B). In secondo luogo, la densità della particella dovrebbe essere simile al mezzo (1,05 g ml ^-1 per mezzi acquosi) in modo che sia evitata la sedimentazione e forze inerziali sono trascurabili. La maggior parte delle particelle con grate di polistirene soddisfano i criteri di cui sopra. Idealmente, la particella non interagisce con i polimeri della matrice biofilm l'interpretazione reologico MSD particella è valido solo se il movimento è casuale, guidata da energia termica e la collisione con strutture sostanza. Ciò può essere osservato controllando se la particella sonda tende a legarsi o rimbalzare la superficie di un biofilm pre-adulto. Tuttavia, nonostante la mancanza di attrazione per il biofilm, le particelle devono essere in grado di essere incorporati nella matrice.Inoltre, l'eterogeneità fisiochimica del biofilm, particelle differenti che sono più adatti come sonde in diverse regioni del biofilm. Così, le particelle di diverse dimensioni e chimica di superficie dovrebbero essere applicati al biofilm.

Come tale, la particella MSD è in grado di fornire utili informazioni su come i diversi componenti contribuiscono alla reologia e la diffusione del biofilm. Inoltre, l'uso di diverse sonde permette di ricavare informazioni sul eterogeneità fisiochimica spaziale del biofilm. Questo metodo può essere utilizzato per testare l'effetto trattamento antimicrobico sulle proprietà meccaniche del biofilm, oppure applicato a biofilm specie miste per studiare come le proprietà meccaniche del biofilm sono cambiati dall'introduzione di un'altra specie. Particle DMS può essere utile anche per la caratterizzazione di biofilm dispersione. Tali studi potrebbero essere utili per la nostra comprensione di biofilm, migliorando potenzialmente trattamenti biofilm unnd ingegnerizzazione di biofilm per le attività utili.

Protocollo

1. biofilm Coltivazione

1. Preparazione di ceppi batterici
   1. 1 giorno prima coltivazione biofilm, preparare colture batteriche planctonici inoculando 2 ml di adeguato mezzo di crescita di coltura batterica congelato. Utilizzare Luria Broth-mezzo (10 g ^L -1 NaCl, 10 g di estratto di lievito ^L -1 e 10 g ^L -1 triptone) per mucoide P. aeruginosa e le sue Δ pel e Δ PSL mutanti difettosi. Incubare una notte a 200 rpm condizioni scuotendo 37 ° C e. Diluire culture durante la notte ad una _OD 600 di 0,40 usando uno spettrofotometro.
   2. Assemblare configurazione cella di flusso, che è stato descritto in precedenza ^14, preferibilmente su una stazione mobile o carrello che può essere portato nella camera microscopio imaging la cella di flusso senza smontaggio.
   3. Preparare terreno di coltura sterile in 2 L o 5 bottiglie L per ogni cella di flusso. Utilizzare minimo medio M9 (48 mm Na ₂ HPO _4, 22 mmKH ₂ PO ₄ 19 mM NH ₄ Cl, 9 mM NaCl, 2 mM MgSO _4, e 0,1 mM CaCl ₂₎ integrato con 0,04% di glucosio (peso / volume) e 0,2% (peso / volume) Casamino acidi) per P. aeruginosa flusso biofilm cellulari.
   4. Microsfere Aliquota fluorescenti in provette da microcentrifuga e spin down in H _{2 O} sterile per 5 min in centrifugare a 9,391.2 g. Rimuovere il surnatante e risospendere in 1 ml di mezzo di crescita per rimuovere sodio azide (disinfettante) prima di aggiungere al mezzo di coltura in 2 L o 5 bottiglie L medie.
      NOTA: I formati differenti di microsfere sono disponibili in diverse concentrazioni e devono essere diluiti di conseguenza per le istruzioni. Ad esempio, disperdere 120 ml di 1,0 micron microsfere di diametro, 15 ml di 0,5 micron microsfere diametro e 0,96 ml di 0,2 micron di diametro microsfere in 2 litri di terreno di crescita per dare 2,18 × 10 ⁶ microsfere ml ^-1 per ogni dimensione delle particelle.
   5. Fissare medio bottiglia upstrisma di cella di flusso e consentire terreno di coltura di fluire attraverso tutta l'installazione. Interrompere il flusso e iniettare culture durante la notte nelle camere diluito cella di flusso. Consentire batteri per attaccare al substrato coprioggetto per 1 ora prima di continuare il flusso di terreno di coltura ad una portata di circa 5,5 x 10 ^-3 m sec ^-1, o 8 rpm con una pompa peristaltica.
      NOTA: I biofilm di solito sono cresciuti a temperatura ambiente (25 ° C) per 3-7 giorni.
   6. In alternativa, per la messa a cultura statica, diluire culture durante la notte a 100 volte in provette da microcentrifuga con l'aggiunta di 10 ml di cultura durante la notte per 1 ml di terreno di coltura con particelle. Aumentare la concentrazione di particelle nel mezzo di crescita per la cultura statica di circa 500 volte rispetto a quella utilizzata per biofilm di flusso (ad esempio lavare e risospendere 600 ml di 1,0 micron sfere di diametro in 10 ml di terreno di coltura) come biofilm cella di flusso sono costantemente rifornito con particelle ma le culture non sono statiche.
      1. Aggiungere 2001; l di cultura durante la notte diluito con particelle alle camere di 8 scivoli pure. Incubare a 37 ° C in condizioni statiche. Biofilm sono generalmente coltivate per 1 giorno. Sostituire crescita media spesi quotidianamente con terreno di coltura fresco con particelle se biofilm viene coltivato per più di 1 giorno.

2. Microscopia

1. Il giorno 3 e 5, spegnere flusso dalla pompa peristaltica e portare configurazione cella di flusso nella camera microscopia. Tubo morsetto vicino all'entrata e all'uscita delle camere cella di flusso per prevenire drift (un errore sistematico causa da cambiamenti nell'ambiente) dal flusso. Posizionare la cella di flusso sul palco del microscopio di un microscopio in posizione verticale.
   NOTA: utilizzare un microscopio invertito per l'imaging di pozzetti.
2. Utilizzare microscopia a fluorescenza con obiettivo 40x olio per prendere i video di moto microsfere incorporate nel biofilm in varie località (microcolonie e strati indifferenziate piatto) e in diversi giorni (giorno 3 e 5) perindagini temporali e spaziali. Prendere brevi video con una maggiore frequenza di fotogrammi per indagare gli eventi che si verificano all'interno scale temporali brevi (ad esempio 1,5-3 numero minimo di video su frame rate di 25-50 fotogrammi al secondo per la dinamica veloce), e più a lungo video con frame rate inferiore per indagare gli eventi nel tempo più lungo scale (per esempio 15-30 min video su frame rate di 2,5-5 fotogrammi / sec per le dinamiche più lente).
   NOTA: Un video contiene tipicamente 5-10 particelle, ed è tipicamente 1,0-2,5 GB di dimensione del file. Microcolonie più grandi possono contenere più particelle. Prendere 5-10 video per ogni categoria (per esempio 5-10 video di diversi microcolonie e di luoghi diversi strati indifferenziate piatti). Il biofilm ha un'architettura eterogenea che può essere costituito da microcolonie, canali, spazi vuoti e strati indifferenziate piane.
3. Salvare i video in formato appropriato che possono essere letti da Fiji / ImageJ (ad esempio CZI, tif).
4. Controllare i video per la deriva scorrendo vid finitoeo e osservando che le particelle non si muovono nella stessa direzione simultaneamente. Drift può essere causato dal movimento z-fase, correnti nella cella di flusso, squilibrio di tavolo antivibrante, la pressione dell'aria o variazioni di temperatura. Correggere minore alla deriva con tecniche di post-elaborazione di solito forniti con il software microscopio. Eliminare tutti i video in cui la deriva non possono essere corretti. Registrare i seguenti parametri, che sono tenuti nel corso delle particelle Monitoraggio Analisi: Risoluzione (px / um), numero di fotogrammi, Durata.
5. Rimuovere cella di flusso da palco microscopio e riavviare pompa peristaltica per continuare a coltivare il biofilm.

3. Analisi delle particelle Monitoraggio

1. Ottenere traiettorie delle particelle utilizzando il plug-in TrackMate in software open source (ImageJ). Scarica Fiji a http://fiji.sc/Fiji. Aprire il video con le Figi e sotto il menu Plugins, selezionare Monitoraggio e TrackMate.
2. Controllare o regolare le impostazioni in the suggerendo finestra impostazioni di calibrazione iniziali per abbinare i parametri video come registrato al punto 2.4.
3. Rileva particelle TrackMate utilizzando ImageJ.
   1. Seleziona 'LoG detector', ingresso diametro delle particelle e valore di soglia (ad esempio, 1000). Scorrere il video, mentre cliccando sul pulsante 'Anteprima' per verificare che i cerchi viola seguono le particelle di tutto il video. Regolare i valori di diametro e di soglia, se necessario: aumentare il valore di soglia, se cerchi viola figurare, nello spazio vuoto. Ridurre il valore di soglia, se vengono rilevati particelle non abbastanza. Fare clic sul pulsante accanto a completare il rilevamento delle particelle.
   2. Fare clic sul pulsante accanto quando sono presentati con la possibilità di aggiungere o rimuovere le particelle individuate nell'ambito di 'soglia iniziale', 'Selezionare una vista' e 'selezionare un filtro' finestre di continuare senza regolazione se il riconoscimento iniziale di particelle è stato soddisfacente.
   3. Seleziona 'LAP inseguitore Semplice' nel optisulla barra di 'Selezionare un metodo tracker' finestra come le particelle si muovono raramente fuori fuoco in biofilm e sono facilmente monitorati. Utilizzare i valori di distanza massima suggerita o basso di collegamento e gap-chiusura, e fare clic su Avanti.
   4. Controllare che il monitoraggio delle particelle è soddisfacente scorrendo il video per vedere che le particelle seguono le tracce disegnate da TrackMate, e che non ci siano tracce indesiderate o mancanti. Passa le varie fasi di filtraggio. Passare alla finestra finale 'Seleziona un'azione'. Seleziona 'brani Esporta file XML' dal menu a discesa e fare clic su 'Esegui'. Scegliere una cartella in cui salvare le tracce.
      NOTA: Ci sono vari programmi disponibili nel pubblico dominio per l'analisi delle traiettorie delle particelle e l'uso di microrheology. msdanalyzer e TrackArt sono esempi di programmi di analisi di particelle di monitoraggio che vengono eseguite in ambiente Matlab.
4. Preparare Matlab per importare le traiettorie delle particelle nei file xml selezionando nel menu diMatlab File> Imposta percorso ... e Aggiungi cartella disponibili gli script con il pacchetto Fiji.
5. Per analizzare le traiettorie delle particelle con msdanalyzer, scaricare il collegamento al file zip o il file tar.gz at http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories .
   1. Estrarre la cartellamsdanalyzer ¹⁵ e rilasciarlo in una cartella che appartiene al percorso Matlab (ad esempio C: Documents and Settings Documenti Matlab). Avviare Matlab e avviare l'analizzatore digitando:
      ma = msdanalyzer (2, 'um', 'sec')
      dove um e sec sono le unità spazio-temporali fisici nel video.
      1. Importare le traiettorie delle particelle digitando:
         [tracce, md] = importTrackMateTracks ('NomeFile.xml', 'clipZ',, 'Scalet')
         MA = ma.addAll (tracce);
         dove 'clipZ' rimuove la dimensione z un video in 2D, e 'Scalet'.
      2. Tracciare le traiettorie Onto grafico utilizzando:
         ma.plotTracks;
         ma.labelPlotTracks;
      3. Calcolare le DMS delle particelle mediante:
         ma = ma.computeMSD;
         ma.msd
      4. Tracciare i DMS di ogni particella:
         figura
         ma.plotMSD
      5. Combinare traiettorie delle particelle provenienti da altri video dello stesso categery (particelle ad esempio incorporato in wild-type microcolonie al giorno 3) ripetendo 3.5.1.1 a 3.5.1.4).
      6. Tracciare la media insieme o la media su tutte le curve:
         ma.plotMeanMSD
         Cambiare la Y e asse x da lineare a scala logaritmica. In tempi di latenza lunghi, le curve diventano MSD rumorosa a causa di statistiche insufficienti a tempi più lunghi. Le curve MSD possono anche aumentare vertiginosamente a causa di errore dinamico. Queste regioni della curva può essere rimosso utilizzando lo strumento pennelloper selezionare la fine della curva e selezionando 'spazzolatura'> 'Rimuovi spettinati' nel menu Strumenti.
   2. Scarica Ezyfit a http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/ e aggiungere Ezyfit a una cartella che appartiene al percorso Matlab (ad esempio C: Documents and Settings Documenti Matlab). Installare il menu Ezyfit digitando in Matlab lavoro efmenu installazione. Riavviare MATLAB con menù Ezyfit nella finestra di figura. Montare le curve MSD alla legge potere selezionando nel menu Ezyfit 'Mostra Fit'> 'Power'> 'a * x ^ n' erano n è la stima esponente α diffusiva.
      NOTA: msdanalyzer richiede il Curve Fitting Toolbox in Matlab per il montaggio di curve MSD. Ezyfit è un'alternativa e software gratuito in grado di eseguire curve fitting.
   3. Cancella traiettorie delle particelle in corso e DMS per calcolare nuovi DMS particelle in altre posizioni o tempo:
      chiaro
   4. Dopo il calcolo di varie curve medie MSD di particelle in media (controllo) e microcolonie e aree indifferenziate di vari ceppi, copiare e incollare le curve in un grafico per il confronto. Rigidità del campione e reticolazione aumento con valori più bassi MSD. Curve piatte hanno α inferiori e del campione è più elastica di curve più ripide con una maggiore α.
   5. Selezionare la curva e andare in "Strumenti" a guardare le statistiche di dati, come ad esempio la mediana e la gamma. L'MSD del tallone è proporzionale alla conformità creep, J (t) del materiale in cui il tallone è integrato secondo la relazione,
      
      dove J = compliance creep, d = diametro delle particelle, k _B = costante Boltzmann, T = temperatura e t = tempo.

Risultati

Le proprietà viscoelastiche locali del biofilm nelle diverse regioni del biofilm, che comprendeva i vuoti (media sopra il biofilm), pianure (strato piatto indifferenziata di cellule) e microcolonie (vedi etichette in Figura 2A) sono stati studiati. Le variazioni temporali delle proprietà viscoelastiche del biofilm durante la maturazione da 3 a 5 giorni sono stati determinati. La MSD delle particelle nei vuoti è stato utilizzato come controllo e paragonabile al MSD di particelle in media pura. Al contrar...

Discussione

Microrheology è uno strumento utile per misure reologiche locali in sistemi eterogenei, come biofilm microbici. Si tratta di una tecnica non distruttiva, consentendo il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti reologici all'interno dello stesso campione biologico su più punti di tempo. In questo protocollo,-particella monitoraggio microrheology è stato applicato alla Pel e mutanti esopolisaccaridi Psl per indagare come influenzano l'elasticità ed efficace reticolazione della matrice biofilm. PSL favorisce lo ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Fluorsfere	Invitrogen	F-8821	1.0 μ m microsfere fluorescenti rosse (580/605) con modifica carbossilata
Zeiss Axio Imager M1	Carl Zeiss	Microscopio epifluorescente
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80	Cole-Parmer	EW-07523-80	Pompa peristaltica
Camere a celle di flusso Università	tecnica della Danimarca
Tubo in silicone	Dow Corning		diametro esterno 3 mm, 1  mm diametro interno
Connettori in plastica polipropilene trasparente	Cole Parmer	06365-83	1/16 pollici (1.588 millimetri)
		per leganti	Per bloccare i tubi
Vetrini coprioggetti	Thermo Scientific™ Nunc&commercio;	50 x 24 mm
Siringa 3 ml	Terumo
27   Ago G	Terumo
2   L Bottiglie di stoccaggio/supporti	VWR®
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