La microreologia di tracciamento delle particelle studia la viscoelasticità dei materiali. Qui, la tecnica viene utilizzata per determinare la viscoelasticità, la conformità allo scorrimento e i ruoli di reticolazione efficace di diversi componenti della matrice di un biofilm batterico. La matrice è costituita da sostanze polimeriche secrete dai batteri e i suoi componenti determinano la struttura del biofilm e le proprietà meccaniche.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
In Situ mappatura delle proprietà meccaniche del biofilm da-Particle tracciamento Microrheology
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule batteriche sono in grado di formare comunità di biofilm attaccate alla superficie note come biofilm racchiudendosi in sostanze polimeriche extracellulari (EPS). L'EPS funge da impalcatura fisica e protettiva che ospita le cellule batteriche ed è costituito da una varietà di materiali che include proteine, esopolisaccaridi e DNA. La composizione dell'EPS può cambiare, il che rimodella le proprietà meccaniche del biofilm per sviluppare ulteriormente o supportare strutture di biofilm alternative, come gli streamer, in risposta a stimoli ambientali. Nonostante ciò, ci sono poche descrizioni quantitative su come i componenti dell'EPS contribuiscano alle proprietà meccaniche e alla funzione dei biofilm. La reologia, lo studio del flusso della materia, è di particolare rilevanza per i biofilm poiché molti biofilm crescono in condizioni di flusso e sono costantemente esposti a sollecitazioni di taglio. Fornisce inoltre misurazioni e informazioni sulla diffusione del biofilm su una superficie. Qui, la microreologia a tracciamento delle particelle viene utilizzata per esaminare la viscoelasticità e i ruoli di reticolazione efficace di diversi componenti della matrice in varie parti del biofilm durante lo sviluppo. Questo approccio consente ai ricercatori di misurare le proprietà meccaniche dei biofilm su microscala, il che potrebbe fornire informazioni utili per il controllo e l'ingegnerizzazione dei biofilm.
Introduzione
La maggior parte delle cellule batteriche sono in grado di utilizzare sia (sessili) le modalità superficiali allegato di crescita 1 planctonici (senza vita) e. Nella modalità superficie divisoria di crescita, le cellule batteriche secernono e si racchiudono in grandi quantità di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) per formare biofilm. L'EPS consiste principalmente di proteine, DNA extracellulare esopolisaccaride, ed è essenziale per la formazione di biofilm 2. Serve come un'impalcatura fisico da cui i batteri possono utilizzare per differenziare spazialmente e protegge i batteri da condizioni ambientali nocive e le risposte di acco....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. biofilm Coltivazione
- Preparazione di ceppi batterici
- 1 giorno prima coltivazione biofilm, preparare colture batteriche planctonici inoculando 2 ml di adeguato mezzo di crescita di coltura batterica congelato. Utilizzare Luria Broth-mezzo (10 g L -1 NaCl, 10 g di estratto di lievito L -1 e 10 g L -1 triptone) per mucoide P. aeruginosa e le sue Δ pel e Δ PSL mutanti difettosi. Incubare una notte a 200 rpm condizioni scuotendo 37 ° C e. Diluire culture durante la notte ad una OD 600 di 0,40 usando uno spettrofotometro.
- Assemblare configurazione cella di flusso, che è ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Le proprietà viscoelastiche locali del biofilm nelle diverse regioni del biofilm, che comprendeva i vuoti (media sopra il biofilm), pianure (strato piatto indifferenziata di cellule) e microcolonie (vedi etichette in Figura 2A) sono stati studiati. Le variazioni temporali delle proprietà viscoelastiche del biofilm durante la maturazione da 3 a 5 giorni sono stati determinati. La MSD delle particelle nei vuoti è stato utilizzato come controllo e paragonabile al MSD di particelle in media pura. Al contrar.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Microrheology è uno strumento utile per misure reologiche locali in sistemi eterogenei, come biofilm microbici. Si tratta di una tecnica non distruttiva, consentendo il monitoraggio in tempo reale dei cambiamenti reologici all'interno dello stesso campione biologico su più punti di tempo. In questo protocollo,-particella monitoraggio microrheology è stato applicato alla Pel e mutanti esopolisaccaridi Psl per indagare come influenzano l'elasticità ed efficace reticolazione della matrice biofilm. PSL favorisce lo .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è sostenuta dalla Fondazione Nazionale delle Ricerche e il Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore sotto il suo Centro di Ricerca di Eccellenza programma, lo Start-up Grants (M4330002.C70) da Nanyang Technological University, e ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) da Ministero dell'Istruzione, Singapore. Gli autori ringraziano Joey Yam Kuok Hoong per la partecipazione alla manifestazione di questo protocollo.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fluorsfere | Invitrogen | F-8821 | 1.0 μ m microsfere fluorescenti rosse (580/605) con modifica carbossilata |
| Zeiss Axio Imager M1 | Carl Zeiss | Microscopio epifluorescente | |
| Masterflex L/S Digital Drive 07523-80 | Cole-Parmer | EW-07523-80 | Pompa peristaltica |
| Camere a celle di flusso Università | tecnica della Danimarca | ||
| Tubo in silicone | Dow Corning | diametro esterno 3 mm, 1 mm diametro interno | |
| Connettori in plastica polipropilene trasparente | Cole Parmer | 06365-83 | 1/16 pollici (1.588 millimetri) |
| per leganti | Per bloccare i tubi | ||
| Vetrini coprioggetti | Thermo Scientific™ Nunc&commercio; | 50 x 24 mm | |
| Siringa 3 ml | Terumo | ||
| 27 Ago G | Terumo | ||
| 2 L Bottiglie di stoccaggio/supporti | VWR® | ||
| Carrello | per contenere l'impostazione del biofilm |
Riferimenti
- Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Yang, L., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
