Solid Lipid nanoparticelle (linfonodi sentinella) Applicazioni per intracellulare targeting

Sommario

In questo studio, è stato descritto un metodo per sintetizzare popolazioni ultra-piccole di nanoparticelle biocompatibili, nonché diversi metodi in vitro con cui valutare le loro interazioni cellulari.

Abstract

I veicoli di consegna basati su nanoparticelle hanno mostrato grandi promesse per le applicazioni di targeting intracellulare, fornendo un meccanismo per alterare specificamente la segnalazione cellulare e l'espressione genica. In una precedente indagine, è stata dimostrata la sintesi di nanoparticelle lipidiche solide ultra-piccole (SLN) per applicazioni topiche di somministrazione di farmaci e di rilevamento di biomarcatori. Le SLN sono un esempio ben studiato di un sistema di somministrazione di nanoparticelle che è emerso come un promettente veicolo di somministrazione di farmaci. In questo studio, le SLN sono state caricate con un colorante fluorescente e utilizzate come modello per studiare le interazioni particella-cellula. Il metodo della temperatura di inversione di fase (PIT) è stato utilizzato per la sintesi di popolazioni ultra-piccole di nanoparticelle biocompatibili. È stato utilizzato un test di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilfeniltetrazolio bromuro (MTT) al fine di stabilire livelli di dosaggio appropriati prima degli studi di interazione nanoparticella-cellula. Inoltre, i fibroblasti dermici umani primari e le cellule dendritiche di topo sono stati esposti a SLN caricati con colorante nel tempo e le interazioni rispetto alla tossicità e all'assorbimento delle particelle sono state caratterizzate utilizzando la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso. Questo studio ha dimostrato che gli SLN ultra-piccoli, come sistema di rilascio di nanoparticelle, sono adatti per il targeting intracellulare di diversi tipi di cellule.

Introduzione

Veicoli di consegna basata nanoparticelle hanno mostrato una grande promessa per le applicazioni destinate intracellulari, fornendo un meccanismo per alterare specificamente segnalazione cellulare e l'espressione genica. Questi veicoli possono essere caricati con farmaci, proteine ​​e acidi nucleici progettati per influenzare la risposta cellulare e ottenere un effetto desiderato nei tessuti bersaglio. Molti tipi di nanovettori sono stati esplorati per beneficio terapeutico e diagnostica compresi lipidi, polimeri, silicio e materiali magnetici. Questi sistemi sono interessanti per la loro potenziale per la consegna della droga localizzato, aumento della concentrazione terapeutica nei tessuti bersaglio, e la riduzione della tossicità sistemica.

Nanoparticelle lipidiche solide (linfonodi sentinella) sono un esempio ben studiato di un sistema di erogazione di nanoparticelle che è emerso come un veicolo di consegna promettente farmaco negli ultimi anni. Linfonodi sentinella possono essere facilmente formulati per molteplici applicazioni tra cui bio-sensing ^1, cosmetici ^2, e tconsegna herapeutic ^3-7. La loro utilità deriva dal fatto che essi sono costituiti interamente da riassorbibili, lipidi non tossici, con conseguente maggiore biocompatibilità. Durante la sintesi, farmaci lipofili possono essere incorporati in veicoli SLN, aumentando così la solubilità e l'idoneità farmaco per somministrazione parenterale. Veicoli SLN anche aiutare a stabilizzare terapeutica incapsulati, riducendo la loro degradazione e di liquidazione, e massimizzando azione terapeutica. Questi veicoli sono particolarmente adatti per lunga durata d'azione, le preparazioni a rilascio controllato per la loro stabilità alle ^3,4,8,9 temperatura corporea. È importante sottolineare che l'incapsulamento dei farmaci in nanoparticelle lipidiche altera i profili farmacocinetici intrinseche delle molecole di droga. Ciò fornisce un vantaggio potenziale permettendo il rilascio controllato di farmaci con un ristretto indice terapeutico. Il tasso di rilascio di terapie SLN-incorporato può essere sintonizzato sulla base del tasso di degradazione dei lipidi o il tasso di diffusione della droga nelmatrice lipidica.

Linfonodi sentinella sono spesso progettati ad accumularsi nei tessuti bersaglio specifici. Ad esempio, le loro dimensioni (tipicamente maggiore di 10 nm) potenzia ritenzione nella circolazione, dove la vascolarizzazione del tessuto tumorale leaky facilita la deposizione. Inoltre, la via di somministrazione particella ha dimostrato di alterare biodistribuzione con la possibilità di indirizzare specifiche strutture fisiologiche quali linfonodi ^10,11. Dopo la deposizione nei tessuti bersaglio, ottenendo adeguate interazioni cellulari ed eventuale internalizzazione delle nanoparticelle è difficile a causa della capacità delle membrane cellulari per controllare selettivamente il flusso di ioni e molecole dentro e fuori della cella ^12. Per facilitare assorbimento cellulare, è possibile modificare nanovettori con leganti specifici inclusi peptidi, piccole molecole, e anticorpi monoclonali ^13,14. Diversi meccanismi compresi sia penetrazione passivo e trasporto attivo di nanoparticelleattraverso la membrana cellulare precedentemente descritte ^3,12,15. In generale, è stato dimostrato che le interazioni cellula-nanoparticelle sono influenzati dalle proprietà fisico-chimiche delle nanoparticelle tra cui le dimensioni, la forma, carica superficiale e chimica di superficie, oltre ai parametri specifici delle cellule, quali tipo di cellula o cella fase del ciclo ^12.

Una precedente inchiesta ha dimostrato la sintesi di sub-10 nm linfonodi sentinella per uso topico ¹⁶ e biomarcatori applicazioni di rilevamento ¹ con il metodo del ¹⁷ temperatura di inversione di fase (PIT). Questo è un metodo di sintesi in cui delicato ² la composizione rimane costante mentre la temperatura viene gradualmente cambiata. Continua agitazione della soluzione riscaldata, mentre si raffredda a risultati RT in una nanoemulsione. Questo processo determina la sintesi di linfonodi sentinella con granulometria inferiore ¹ di quella precedentemente riportata utilizzando vari metodi per la sintesi di lipidi nanoparticles ^17-22. La scala di dimensioni risulta, a meno di 20 nm, offre un vantaggio per le applicazioni di targeting intracellulare a causa di una maggiore superficie e il potenziale di interazioni cellulari avanzati.

Uno schema di linfonodi sentinella, destinata a fornire un colorante fluorescente o terapeutico, è mostrata in Figura 1. I linfonodi sentinella costituiti da un lipide interni (ad esempio, alcano lineare) permettendo l'incorporazione di composti lipofili (ad esempio, coloranti o terapeutici) e un esterno tensioattivo (tensioattivo non ionico ad esempio, lineare) circondato da acqua. In questo studio, linfonodi sentinella sono stati caricati con un colorante fluorescente e usati come modello per studiare le interazioni delle particelle-cellula. Fibroblasti dermici umani primari e le cellule dendritiche di topo sono state esposte per tingere-caricato SLN nel tempo al fine di caratterizzare le interazioni in termini di tossicità e l'assorbimento delle particelle. Un test 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium bromuro (MTT) era Utilized al fine di stabilire adeguati livelli di dosaggio. Microscopia a fluorescenza e citometria a flusso sono stati due metodi utilizzati per esaminare l'assorbimento delle particelle in vitro.

Figura 1. Schema del linfonodo sentinella che mostra i principali componenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocollo

1. Il trattamento di linfonodi sentinella

1. Sintesi di linfonodi sentinella
   Nota: Utilizzare il metodo PIT ^1,17,20 per preparare i sub-20 nm linfonodi sentinella ^1.
   1. Utilizzare una tecnica asettica, bioreagents o reagenti di colture cellulari di qualità e materiali sterili (cioè, pipette, spatole, fiale, ecc.)
   2. Utilizzare un armadio biosicurezza per la sintesi dei linfonodi sentinella (Figura 2).
   3. Combinare 0,6 mg di colorante fluorescente (Nilo Red (NIR), concentrazione NiR è di circa 0,3 mg / ml) e 0,10 g di Heneicosane (Lipid, 5 peso / peso% concentrazione di lipidi) in una fiala (15 ml), co-fonde a 90 ° C, e mescolate.
   4. Aggiungere 0,11 g di poliossietilene (10) oleil etere (tensioattivo, 5.5 wt / wt% concentrazione di tensioattivo). Co-melt la miscela risultante a 90 ° C e mescolare.
   5. Aggiungere 1,79 g di acqua sterile alla miscela, riscaldare a 90 ° C, e mescolare fino ad avere una nanoemulsione trasparente.
      Nota: In continua agitazione e raffreddamento controllato, SLNs vengono creati. Queste condizioni provocano un'inversione della emulsione acqua-in-olio ad una emulsione olio-in-acqua. Molecole lipofile quali NiR partizione per le gocce lipidiche.
   6. Preparare una nanoemulsione in parallelo senza aggiungere il colorante fluorescente, per servire come campione di controllo. Combinare 0,10 g di Heneicosane e 0,11 g di poliossietilene (10) oleil etere in un flacone (15 ml) co-fuso a 90 ° C, e mescolate.
      1. Aggiungere 1,79 g di acqua sterile alla miscela, riscaldare a 90 ° C, e mescolare fino ad avere una nanoemulsione trasparente.
   7. Ulteriori sterilizzare ogni nanoemulsione utilizzando una sterile 0,2 micron filtro.
   
   Figura 2. Schema di sintesi di linfonodi sentinella. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
2. Dimensione delle particelle e Polydispersity
   1. Utilizzare light scattering dinamico (DLS) per misurare la dimensione delle particelle e polidispersità dei linfonodi sentinella ¹ utilizzando una cuvetta di vetro e uno strumento progettato per misurare la dimensione delle particelle.
   2. Prima le misure dei campioni, misurare le dimensioni delle particelle di due standard noti seguendo il protocollo del produttore per la preparazione e la misura standard.
   3. Riempire la provetta di vetro con 1,5 ml di soluzione standard e misurare la soluzione standard con le stesse condizioni di misura come i campioni.
      Nota: passo precedente è stato ripetuto per ogni standard.
   4. Misurare i campioni così come predisposto. Per ciascuna, utilizzare i seguenti parametri sperimentali: un tempo di esecuzione di 100 sec, indice di rifrazione di acqua (1.33), viscosità dell'acqua a 20 ° C (1.002 mPa · sec).
      Nota: Questa tecnica utilizza frequenza spostata luce per misurare le dimensioni delle nanoparticelle.
   5. Riportare il diametro delle particelle media e polidispersità di partidistribuzione delle dimensioni cle.
3. Punto di fusione e di calore latente di fusione
   1. Utilizzare un calorimetro a scansione differenziale (DSC) equipaggiato con un autocampionatore e la sorgente di raffreddamento azoto liquido per studiare il comportamento termico dei linfonodi sentinella ^1.
   2. Pipettare i linfonodi sentinella come preparati in una vaschetta di alluminio 40 microlitri con una massa di circa 25 mg e sigillare ermeticamente la padella con una pressa piegatore universale per minimizzare la perdita di umidità durante la scansione DSC.
   3. Misurare ogni nanoemulsione da 5 a 80 ° C.
   4. Riportano il punto di fusione e il calore latente di fusione DSC dal terreno, dove la valle rappresenta il punto di fusione e l'integrale della area sotto la curva nel grafico DSC diviso per la quantità di materiale rappresenta il calore latente di fusione.

2. linfonodi sentinella Interazione con fibroblasti e cellule dendritiche

1. Cultura di primari fibroblasti umani
   1. Cultura primario fi umanofibroblasti secondo le istruzioni del produttore in mezzo liquido per la coltura di fibroblasti dermici umani (media 106), integrati con il kit supplemento bassa crescita nel siero (LSGS). Mantenere celle in atmosfera umidificata a 37 ° C, 5% CO ₂ e subcultura raggiungimento 80% di confluenza.
   2. Per entrambi MTT e analisi di immagini, alveoli in una piastra a 96 pozzetti, ad una densità di 2 x 10 ⁴ cellule per pozzetto, e lasciar equilibrare a 37 ° CO / N prima dell'esposizione SLN.
   3. Al tempo zero, diluire linfonodi sentinella in terreno completo come indicato (figura 4), ​​rispetto alla concentrazione di lipidi, e aggiungere 10 ml per pozzetto a ciascun replicarsi bene nella piastra a 96 pozzetti.
   4. Mantenere cellule a 37 ° C, 5% CO _2, durante il periodo di incubazione.
2. MTT Tossicità Assay
   1. Dopo 24 ore di incubazione con linfonodi sentinella, determinare la vitalità cellulare con il saggio MTT, secondo il protocollo del produttore.
   2. Lavare le cellule una volta e aggiungere mezzo fresco a ciascun pozzetto (100 l / pozzetto). Uccidi pozzetti di controllo incubando in una soluzione di metanolo al 70% per 10 minuti prima di sostituire con terreno fresco.
   3. Aggiungere il reagente MTT (10 ml per pozzetto) in ciascun pozzetto della micropiastra e incubare O / N a 37 ° C.
   4. Dopo O / N incubazione, solubilizzare cristalli formazina intracellulari con la soluzione detergente fornito (100 pl per pozzetto) secondo il protocollo del produttore.
   5. Dopo 3 ore di incubazione a RT, ottenere valori di assorbanza alla lunghezza d'onda di misura di 570 nm con un lettore di micropiastre.
      Reagente MTT utilizzato deve essere inferiore a 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, bromuro di 5-difenil-tetrazolio: Note.
3. Microscopia a fluorescenza
   1. In punti temporali specifici dopo somministrazione di fibroblasti con SLN, lavare i fibroblasti due volte con sterile tampone fosfato salino (PBS) e fissare per 10 minuti con il freddo il 70% di metanolo.
   2. Dopo 10 min, Sostituire il metanolo con PBS e catturare le immagini utilizzando un microscopio invertito, con una banda passante (BP) 690/50 nm set di filtri.
4. Cultura di cellule di topo midollo osseo dendritiche
   1. Indurre le cellule derivate dal midollo osseo di topo dendritiche (BMDC) come precedentemente descritto ^23,24. In breve, le sospensioni piastra singola cellula del C57BL / 10 midollo osseo a 100 mm piastre di Petri a 2 x 10 ⁶ / piastra con il fattore ricombinante murino granulociti-macrofagi stimolante le colonie (GM-CSF, 300 U / ml) e ricombinante murino IL-4 (cellule B fattore, 200 U / ml stimolante). Modificare i media ogni 3 giorni.
   2. Il giorno 7, aggiungere linfonodi sentinella NiR caricati ai piatti ad una concentrazione finale di 0,5 e 5,0 mg / ml di lipidi e mantenere le cellule a 37 ° C, 5% CO _{2 incubatore} per la durata di esposizione desiderato.
   3. Raccogliere cellule dalle stoviglie aspirando tutti i media nel piatto, raccogliendola in un tubo da 50 ml, seguito da lavaggio accurato della piastra (per rimuovere annuncio liberamentecellule Herent) con 5 ml di tampone fosfato salino (PBS) contenente 4 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Raccogliere la sospensione cellulare ottenuta nello stesso tubo 50 ml.
5. La valutazione di linfonodi sentinella incorporazione tramite Citometria a Flusso
   1. Determinare la concentrazione della sospensione cellulare ottenuta al punto 2.4.3 e distribuire 3x10 ⁵ cellule in un fondo rotondo tubo FACS 12 mm x 75 mm.
   2. Lavare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS e quindi i tubi centrifugazione per 5 minuti a 400 xg, ad una temperatura di 4 ° C.
   3. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet con 100 ml di PBS / 2 mM EDTA / 0,1% di albumina sierica bovina (BSA) (tampone colorazione) contenenti anticorpo monoclonale anti-CD11c-FITC (0,25 mg / ml finale). Incubare per 30 min in ghiaccio al buio.
   4. Lavare le cellule con 1 ml di PBS e centrifugare le provette per 5 minuti a 400 xg, ad una temperatura di 4 ° C.
   5. Scartare il surnatante e risospendere ognipellet con 400 ml di buffer di colorazione. Le cellule sono ora pronti per l'acquisizione dei campioni con un citometro a flusso (eventualmente dotato di laser blu e rosso).
   6. Utilizzando il software di analisi di citometria a flusso, valutare il livello di incorporazione di linfonodi sentinella da DC dal gating sulla popolazione di CD11c + cellule (FITC positivo) e confrontando l'intensità di linfonodi sentinella-associati fluorescenza (misurata nei canali PerCP-Cy5.5 o APC).

Risultati

Il metodo è stato utilizzato PIT per sintetizzare i linfonodi sentinella e la temperatura di inversione di fase è stato determinato utilizzando un bagno di acqua. I campioni erano riscaldata lentamente e delicatamente agitata finché la soluzione appariva chiaro. La temperatura inversione di fase per i linfonodi sentinella effettuate utilizzando lipidi heneicosane è di 45 ° C. La tabella 1 riassume la dimensione delle particelle, polidispersità, punto di fusione e calore latente di fusione per i linfonod...

Discussione

In questo studio, la sintesi di linfonodi sentinella e loro applicabilità per le applicazioni destinate intracellulari sono state esplorate. Queste nanoparticelle biocompatibili hanno mostrato risultati promettenti come veicoli di consegna per più applicazioni, tra cui la somministrazione di farmaci, silenziamento genico, e le tecnologie di vaccini ^25-30. Ultra-piccoli linfonodi sentinella sono stati sintetizzati utilizzando un processo facile, e sono state esplorate le loro interazioni con le cellule della p...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bioreagente rosso del Nilo (NiR)	Sigma	19123	, adatto per fluorescenza, ≥ 98,0%
Heneicosane	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Poliossietilene (10) etere oleilico
Acqua	Sigma	W3500	Filtrato sterile, BioReagente, adatto per colture cellulari
Filtro per siringa 0,2 µ m Supor Membrane Low Protein Binding Life Sciences		PN4612	Non-Pyrogenic
Nanotrac Ultra	Numero di serie	Microtrac
Strumento Calorimetro a scansione differenziale Strumento	Mettlet-Toledo
Fibroblasti umani primari	Life Technologies	C-004-5C	Neonatale (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	Un terreno liquido sterile per la coltura di fibroblasti dermici umani.
crescita sierica bassa (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	Tutti i componenti del kit completo LSGS
MTT per il saggio della proliferazione cellulare	Trevigen	4890-025-K	Kit sensibile per la misurazione della proliferazione cellulare basato sulla riduzione del sale di tetrazolio, 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio bromuro (MTT)
Safire2 lettore di micropiastre	Tecan	----	Strumento
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma	P5493	Per la biologia molecolare
Urina ricombinante GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti e visualizzato mediante colorazione d'argento.
IL-4 murina ricombinante	Peprotech	214-14	>97%, mediante SDS-PAGE in condizioni riducenti e visualizzato mediante colorazione d'argento.