Qui vi presentiamo un protocollo per la produzione di distale occlusione dell'arteria cerebrale media permanente anziani ratti femmina con occlusione simultanea delle arterie carotidi a generare grandi infarti corticali e deficit sostenuti. Mostriamo conferma della dimensione della lesione utilizzando la risonanza magnetica strutturale a 24 ore e 8 settimane dopo l'ictus.
Articolo metodologico
Esecuzione permanente distale Medio cerebrale con arteria carotide comune di occlusione in ratti anziani per studiare corticale Ischemia con disabilità sostenuta
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ictus si verifica in genere nelle persone anziane con una gamma di comorbidità tra cui carotidea (o altro arteriosa) aterosclerosi, ipertensione, obesità e diabete. Di conseguenza, al momento di valutare le terapie per l'ictus negli animali, è importante scegliere un modello con eccellente validità faccia. rappresenta ictus ischemico per il 80% di tutti gli ictus, e la maggioranza di questi si verificano nel territorio dell'arteria cerebrale media (MCA), spesso inducendo infarti che colpiscono la corteccia sensomotoria, causando plegia persistente o paresi sul lato controlaterale del corpo. Dimostriamo in questo video di un metodo per la produzione di ictus ischemico nei ratti anziani, che causa sostenuta della disabilità sensomotoria e sostanziali infarti corticali. In particolare, induciamo occlusione permanente distale dell'arteria cerebrale media (MCAO) negli anziani femmine di ratto utilizzando una pinza diatermia per occludere un breve segmento di questa arteria. L'arteria carotide sul lato omolaterale alla lesione allora permanently occluso e la carotide controlaterale è stata transitoriamente occluso per 60 min. Misuriamo la dimensione dell'infarto utilizzando la risonanza magnetica pesata in T2 strutturale (MRI) a 24 ore e 8 settimane dopo l'ictus. In questo studio, il volume dell'infarto medio è stato di 4,5% ± 2,0% (deviazione standard) dell'emisfero ipsilaterale a 24 ore (corretto per il rigonfiamento del cervello utilizzando l'equazione di Gerriet, n = 5). Questo modello è fattibile e clinicamente rilevante in quanto consente l'induzione di deficit motorio-sensitivi sostenuti, che è importante per chiarire i meccanismi fisiopatologici e nuovi trattamenti.
Introduzione
L'ictus è attualmente la terza causa più comune di morte nel mondo e la principale causa di disabilità 1. Ictus ischemico, che comprende l'80% di tutti gli ictus, si traduce spesso in infarti nella corteccia causando la perdita della sensazione (per esempio, propriocezione), in funzione motoria e attenzione al lato colpito 2-4. L'arteria cerebrale media (MCA) è il più grande dei vasi che attira alimentazione dal circolo di Willis e nasce dalla carotide interna 5. L'MCA è il vaso cerebrale, più comunemente colpite in ictus ischemico, con colpi in questo territorio che rappresentano il 65% di tutti gli ictus ischemici 6,7. L'MCA fornisce entrambe le regioni corticali e sottocorticali e anomalie neurologiche causate da ictus MCA variano a seconda della posizione esatta del dell'occlusione 7. occlusioni prossimale MCA interessano il territorio in profondità attraverso le arterie lenticulostriatal e causano grandi infarti che comprende sia CortiCAL e le regioni subcorticali. Al contrario, occlusioni più distali che privano regioni corticali esclusivamente del flusso sanguigno tendono a produrre piccoli infarti corticali.
In grandi studi di popolazione, lesioni ictus umani vanno dal 5-14% dei dell'emisfero ipsilaterale 8,9; rappresenta ictus maligno per il 10% degli ictus e dà luogo a infarti più grandi, che richiedono un hemicraniectomy per ridurre la pressione intracranica, e pazienti con lesioni più piccole hanno maggiori probabilità di sopravvivere 10. Dimostriamo un modello riproducibile che produce lesioni che occupano una percentuale simile dell'emisfero altrettanti colpi umani.
L'ictus è una malattia eterogenea; 75% degli ictus ischemici sono indotti da una infarti lacunari (da ostruzione dei piccoli vasi intracranici); ictus cardioembolico; o grande aterosclerosi delle arterie, che rappresenta il 30% degli ictus. aterosclerosi sintomatica è più frequentemente osservata nel punto comune carteria arotid (CCA) si dirama in arterie carotidi interne ed esterne 11.
modelli pre-clinici di ictus dovrebbe essere il più simile alla condizione umana come possibile simulare la sua fisiopatologia e dovrebbe incorporare i fattori di rischio di ictus. 92% di ictus ischemico si verifica in persone di età superiore ai 65 anni, e di altri fattori di rischio sono l'obesità, l'ipertensione, l'aterosclerosi e, come discusso in precedenza 12. Per rappresentare meglio questi fattori di rischio, si consiglia di utilizzare un modello che può condividere alcune delle caratteristiche fisiopatologiche della condizione naturale. In questo protocollo, abbiamo incluso l'età avanzata e il flusso sanguigno ostruito attraverso le arterie carotidi.
Il modello classico di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) è il modello filamento intraluminale di prossimale occlusione MCA, che riduce il flusso di sangue nel anteriore e arterie cerebrali medie. tempi brevi di occlusione che utilizzano questo modello si concentra lEsion alla regione sottocorticale, mentre i tempi di occlusione più lunghi possono causare grandi lesioni reclutamento di aree di entrambe le aree corticali e sottocorticali, risultando in un tasso di mortalità più elevato nei ratti anziani. In confronto, il modello utilizzato dal nostro gruppo comprende l'esecuzione di una craniotomia e l'apertura della dura seguita da coagulazione del sangue e la distruzione di una piccola porzione del MCA mediante pinza cauterizzatori bipolari. Questo modello diatermia è adattato dalla carta 1981 con Tamura et al. 23 e l'uso del craniectomy può limitare aumento della pressione endocranica, che è una caratteristica del cranio chiuso, e si traduce in maggiore riproducibilità e un tasso di mortalità più basso nella nostra coorte chirurgia rispetto ad alcuni altri modelli 13. Per generare infarti riproducibili e sostenuta della disabilità che in modo permanente occludere il prossimale CCA e transitoriamente occludere il distale CCA come da Chen et al. 14 Usiamo la risonanza magnetica pesata in T2 non invasivo (MRI) Per valutare l'entità e la posizione di infarto cerebrale, e il grado di edema cerebrale nella corteccia sensomotoria.
Protocollo
Questo protocollo è stato approvato dalle linee guida istituzionali stabiliti dal King College di Londra, ed è stata effettuata in conformità con le linee guida del Regno Unito del Ministero degli Animali (e procedure scientifiche) Act del 1986. Linee guida può variare tra le istituzioni; Si prega di garantire aderenza alle linee guida istituzionali prima di eseguire questa procedura. Al fine di mantenere la tecnica asettica quando si tocca attrezzature, autoclave un grosso pezzo di foglio di alluminio e utilizzare questo per avvolgere intorno apparecchiature gestisce, come sulla macchina del microscopio e l'anestesia. pellicola sterile (l'involucro di plastica) può essere utilizzato anche.
1. Preparazione
- Familiarizzare ratti con confezioni di liquido in gel (gel recupero veterinario) e Chow morbida per almeno 48 ore prima dell'intervento ictus. Come gli animali spesso trovano difficoltà a mangiare e bere dopo la procedura, introdurre gli animali a questi elementi prima di un intervento chirurgico, per ridurre al minimo neofobia. Casa ratti anziani con blo masticare legnoCKS per ridurre l'incidenza di denti troppo cresciuto (vedere paragrafo 6).
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima di iniziare le procedure chirurgiche in autoclave (minimo 121 ° C, 15 psi, per 15 min). Sanificare tutte le superfici di lavoro, con 1% clorexidina in 70% etanolo e utilizzare teli chirurgici e mantenere tecnica asettica per la durata della procedura.
- Indurre lesioni sulla controlaterale emisfero la zampa preferita. Allocare lesioni a sinistra o l'emisfero destro a seconda zampa preferita di ogni ratto, determinato dalle linee di base pre-operatorie nel test della scala Montoya 15 (vedi figura 4). Per semplicità, nel descrivere questa procedura in questo manoscritto, la zampa sinistra è la zampa preferita, e interventi chirurgici vengono eseguiti sul emisfero destro. Utilizzare i ratti Lister con cappuccio o Long Evans per questi test comportamentali mentre imparano in fretta.
Nota: Il test della scala è stato progettato per misurare i cambiamenti in entrambi bene e lordo m qualificatoovements seguenti danni al sistema del motore. La scala consiste di sette passaggi su ciascun lato di una piattaforma centrale. Se l'apparecchiatura per il test di scala non è disponibile, il test del cilindro è una valida alternativa per i test manualità, ma nota che c'è solo un deficit transitorio in questo test in questo modello di ictus, e quindi sarà inadatto per misurare il recupero a lungo termine dopo trattamento.- Mettere tre palline di zucchero nel pozzo di ogni passo (21 pellet per lato). Posizionare ratti nell'apparato scale per 10 minuti e registrare il numero di pellet recuperati e il numero di pellet dislocate su ogni lato.
Nota: Per essere inclusi nel compito post-operatorio, i ratti devono recuperare un minimo di 75% pellet al basale.
- Mettere tre palline di zucchero nel pozzo di ogni passo (21 pellet per lato). Posizionare ratti nell'apparato scale per 10 minuti e registrare il numero di pellet recuperati e il numero di pellet dislocate su ogni lato.
2. Chirurgia
- Utilizzare anziani ratti femmine Lister-cappuccio a 16-18 mesi (250 a 400 g) e indurre l'anestesia con il 5% isoflurano in 1,5 L / min O 2. Dopo l'induzione dell'anestesia, ridurreil livello di isoflurano e mantenerlo ad una profondità adeguata ma minimizzato di chirurgia (per esempio, 1,5-2%). Consegnare l'anestesia per l'animale da una maschera, e utilizzare un sistema di evacuazione fumi per limitare l'esposizione del chirurgo di isoflurano.
- Eseguire tutte le procedure fino a, ma non inclusi craniotomia sugli animali finti, come questa procedura può produrre deficit comportamentali 16. Considerare gli obiettivi sperimentali nella progettazione di esperimenti MCAO, e decidere se un gruppo sham per controllare per craniotomia o non dovrebbe essere incluso.
- Somministrare il dolore sollievo pre o peri-operatorio (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Tagliato).
- Aggiungere 1 ml a 19 ml sterile salina allo 0,9% per rendere la soluzione madre e iniettare 0,6 ml per 300 g di ratto. L'uso di Carprieve è preferibile rispetto Carprofen perché il primo è stabile a RT.
- Accorciare il pelo sulla regione ventrale del collo e regione temporale sulla emisfero destro per esporre la pelle. Disinfettare i siti chirurgici ucantare tamponi etanolo. Assicurati di seguire le linee guida IACUC locali per la depilazione.
- Eseguire questo passo nel settore operativo per minimizzare la quantità di pelo al sito di incisione.
- Posizionare il ratto su una bacheca coperto con un telo sterile in posizione supina su una piastra elettrica. Applicare la crema di lidocaina alle regioni rasate della testa e del collo. Inserire una sonda rettale per monitorare e mantenere la temperatura dell'animale tra 36,5-37,5 ° C con un sistema omeotermi.
- Mettere pomata sottoposto al Lacrilune sugli occhi per evitare l'essiccazione. Dare ratto un'iniezione di soluzione di solfato di atropina (0,05 ml di una soluzione di 600 mg / ml, per via sottocutanea) per ridurre le secrezioni tracheali.
Nota: I ricercatori dovrebbero prendere in considerazione la misurazione delle variabili fisiologiche come gas nel sangue e la pressione.
- Mettere pomata sottoposto al Lacrilune sugli occhi per evitare l'essiccazione. Dare ratto un'iniezione di soluzione di solfato di atropina (0,05 ml di una soluzione di 600 mg / ml, per via sottocutanea) per ridurre le secrezioni tracheali.
- Prima di iniziare l'intervento chirurgico, controllare il ritiro hindpaw colpo e lampeggia riflessi per confermare anestesia totale.
- Sotto un micro dissezioneambito, fare una due centimetri linea mediana centrale un'incisione sul collo esposto utilizzando un bisturi. Spostare le ghiandole salivari delicatamente laterali alla trachea su entrambi i lati.
- Loop non assorbibile sutura di seta intorno alla pelle che sovrasta l'arteria carotide comune su un lato. Delicatamente tirare via la pelle dal sito utilizzando la sutura di seta e bastone questi giù per il corkboard con del nastro chirurgico per rivelare l'arteria carotide comune. Attenzione Blunt sezionare le arterie libere da fascia e nervi vagali utilizzando una pinza sottile circostante.
- Fare attenzione a non danneggiare il muscolo o nervi vaghi durante questa fase, in quanto ciò potrebbe compromettere l'alimentazione, deglutizione e respirazione.
- Una volta che l'arteria carotide comune è esposto, usare suture di seta non riassorbibile (5/0) per isolare la carotide, prima che separa la carotide dal nervo vago da inverso sezionando con una pinza sottile e facendo attenzione a non entrare in contatto con il nervo. Una volta che la nave è stata loop (ma non legato) con la sutura, tscimmiottare le estremità della sutura insieme con del nastro chirurgico per evitare che questo passo è annullata. Rimuovere i punti di sutura che frenano la pelle sovrastante.
- Ripetere l'operazione per l'altro lato (sezioni 2,7-2,8)
- Inserire una garza sterile imbevuta di soluzione salina nella ferita per mantenere tessuti umidi durante il resto della chirurgia. Liberamente suturare la pelle e inserire un ulteriore garza imbevuta di soluzione salina sopra la zona per impedire ulteriore disidratazione.
- Posizionare ratti in posizione laterale ed effettuare una incisione nella pelle nel punto centrale tra l'orbita destra e il canale uditivo esterno. Ritrarre la pelle con un massimo di cinque divaricatori gancio 3 mm elastiche appuntati al corkboard e poi Blunt sezionare il muscolo temporale per rivelare il cranio.
- Posizionare il pollice ruota-adjusted gravità-driven flebo salina al di sopra del sito aperto (portata circa 2 ml / min) e istituire un sistema di aspirazione per rimuovere i detriti delle ossa e per cancellare sanguinamento minore dal sito esposto per tutta questa fase della chirurgia ( Settaioni 2.13-2.16).
- Inserire l'erogatore salina nel punto più alto del cranio vicino all'orecchio, e l'ugello di aspirazione nel punto più basso. Regolare la ruota durante sanguinamenti di fornire più salina nella zona per migliorare la visualizzazione della sorgente di qualsiasi spurgo per cauterizzazione del vaso, riducendo la quantità di tempo gli animali sono sotto anestesia.
Figura 1. set chirurgica up della distale cerebrale media modello occlusione permanente. Le attrezzature utilizzate nel set up per la craniotomia ratto è indicato per l'emisfero destro, e inserto, il posizionamento dell'aspiratore e Flebo salina intorno al sito craniectomia. Anche mostrato sono le caratteristiche principali del sistema vascolare; l'arteria cerebrale media (rosso) e inferiore vena cerebrale (blu) sono presenti, e l'area ombreggiata indica dove avviene la coagulazione dell'arteria.La conferma dell'occlusione viene eseguita tagliando il MCA di sotto della vena cerebrale inferiore. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Eseguire una craniotomia sulla regione esposta (circa 5 mm x 5 mm) utilizzando un trapano dentale con una grossa 1,6 millimetri diamante rivestito trapano bave a circa 8,000 rpm, garantendo l'applicazione di circolare e di pressione laterale e pressione non ribasso mentre la foratura sulla superficie esposta . Una volta che l'osso è abbastanza sottile che sembra completamente trasparente, rimuovere con pinze.
- Utilizzare un gancio durale fatta in casa, fatta piegando una punta di una pinza sottile circa 180 ° per formare un arco, per aprire con cautela la dura madre, essere cauti per evitare i grandi vasi sanguigni di superficie, quanto delicate e facili alla rottura.
Nota: L'area esposta del cervello rivelerà l'arteria cerebrale media (MCA); il segmento desideratoMisure di circa 2 mm di lunghezza (vedi figura 1, riquadro). - Coagulare il MCA da dove la vena cerebrale inferiore attraversa, fino al punto di biforcazione dell'arteria e poi lungo i rami caudali del MCA utilizzando un paio di pinze per diatermia fino completamente occlusa 17. Utilizzare angolati pinze gioielliere diatermia con punte appuntite 0,25 mm.
- Quando occludendo l'arteria, alterare flusso se necessario il salina per mantenere questa zona fredda, impedendo la pinza di coagulazione di aderire al vaso sanguigno. Quando occluso, il vaso sanguigno appare nero e nessun segno di flusso di sangue dovrebbe essere presente; il flusso di sangue può essere visto in vasi parzialmente occlusi.
- Tagliare il MCA, a questo punto per confermare completa occlusione. Utilizzando le forbici microvascolari, tagliati sotto dove la vena cerebrale inferiore attraversa il MCA.
- Coprire l'area esposta con un tampone di garza imbevuta di soluzione salina prima di passare alla fase successiva.
- Girare il ratto di nuovo ad un posi supinazione e riaprire la sutura vagamente legato sul collo di ri-esporre le arterie carotidi. Legare l'arteria carotide sullo stesso lato come occlusa MCA (destra) permanentemente legando un nodo nella sutura di seta intorno carotide, mentre l'arteria carotide sinistra è occlusa transitoriamente usando una clip un'arteria acciaio 13 mm con 125 pressione g per 60 min. Liberamente suturare l'incisione nel collo durante questo periodo e inserire una soluzione salina sterile imbevuta garza sulla parte superiore per prevenire la disidratazione.
- Si noti che il lato destro dell'animale sarà sul lato sinistro del chirurgo, dato il posizionamento in posizione supina.
- Per gli animali sham, aprire la parte ventrale del collo e regioni temporali e separare i muscoli per individuare le arterie carotidi comuni, ma non occlude. Sono animali sham sottoporsi a procedure fino a, ma non inclusi craniotomia, in quanto questa procedura può produrre deficit comportamentali 16. Per mantenere accecamento di altre tmembri EAM (ad esempio, durante i test comportamentali in seguito), eseguire incisioni e suture.
Figura 2. Tandem carotide occlusione seguente occlusione dell'arteria cerebrale media. Il diritto arteria carotide comune (CCA) è permanentemente occlusa legando una sutura di seta (5/0) attorno al vaso sanguigno (sul lato sinistro dell'immagine). Il CCA sinistra (a destra) è occluso per 1 ora utilizzando un morsetto microvascolare. Questi interventi sono stati effettuati facendo attenzione a non entrare in contatto con il nervo vago su ogni lato (bianco). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
- Suturare l'incisione nella regione temporale durante la 1 ora di sinistra occlusione della carotide comune.
- Dare ratti 20 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea (5 ml a due siti su ogni fianco) per mantenere l'idratazione (vedi6.2).
- Quando 60 minuti è passato, rimuovere la clip. Applicare salina topica al muscolo circostante, e chiudere l'incisione nel collo utilizzando sottocutaneo cucitura continua di suture assorbibili (4/0).
3. post operatoria
- Posizionare il topo in un incubatore a 31 ° di recuperare da anestesia per un massimo di 4 ore.
Nota: I ricercatori possono preferire l'uso di altre temperature e durate in base alla pratica locale. - Ripetere carprieve (0,25 mg / kg), per alleviare il dolore a 24 ore. Dato che tutti gli animali ricevono la stessa dose di Carprieve, questo fattore è controllato per sistematicamente. Qualsiasi effetto neuroprotettivo di Carprieve è probabile che sia trascurabile.
- Dare iniezioni saline al giorno per evitare la disidratazione per almeno i primi tre giorni. Partendo dal presupposto che un topo richiede 65 ml di liquido per kg di peso corporeo (ogni 24 ore), in modo che ogni 300 g di ratto riceve ~ 22 ml liquidi al giorno.
4. Condi conferma di Infarct
- Per misurare il volume dell'infarto utilizzare MRI strutturale.
Nota: Un metodo alternativo potrebbe essere quella di utilizzare colorazione istologica, come tetrazolio cloruro (TTC), che è stato precedentemente correlato dati MRI strutturali 18. Tuttavia, questo può essere utilizzato solo nel punto di fine dello studio, e non longitudinalmente.- Ventiquattro ore dopo l'induzione di MCAO, anestetizzare ratti con isoflurano (5% per l'induzione, 1-1,5% per la manutenzione) in 0,9 L / min medico Aria e 1 L / min O 2, sicuro in una gabbia quadratura bobina di risonanza magnetica (diametro 43 mm) e il luogo in uno scanner foro orizzontale 7 Tesla.
- Ottenere scansioni T2 pesate con un fast-sequenza spin echo: echo tempo (TE) 60 msec, tempo di ripetizione (TR) 4,000 msec, campo visivo (FOV) 40 x 40 mm, matrice di acquisizione 128 x 128, l'acquisizione di 40 x 0,5 mm fette spesse di circa 8 min. Successivamente, convertire 40 fette in fette spesse 20 x 1 mm utilizzando il resampling funzione nel software di imaging medico.
- Ottenere volumi lesione in un pacchetto di visualizzazione di immagini mediche misurando l'area in sezione trasversale di infarto in 20 volumi. Ottenere il volume totale moltiplicando la somma di queste zone per lo spessore (1 mm). Calcolare il gruppo di volume medio e la deviazione standard. Per la percentuale calcoli del volume della lesione, di acquisire anche i volumi degli emisferi ipsilesionale e controlesionale.
- Per correggere per edema cerebrale a causa di edema, regolare questi valori utilizzando formule GERRIETS '18. Includere solo le fette che contengono la corteccia e non contengono il cervelletto o bulbi olfattivi secondo un atlante topo standard da 19 a evitare un eccesso di correzione, in quanto questo può generare volumi lesione negativi.
- Acquisire T2 pesate di nuovo 8 settimane dopo l'intervento ictus.
5. Esempi di calcolo dimensione per gli studi futuri Valutare Neuroprotezione e comportamentale di recupero
- Eseguire calcoli dimensione del campione per stimare la dimensione del campione minima che sarebbe richiesto nei futuri esperimenti neuroprotettivi ipotetici utilizzando due gruppi (controllo vs. Trattamento) per identificare gli effetti del trattamento di tre diverse grandezze (riduzione del 25%, riduzione del 50%, riduzione del 75%) con i priori algoritmi implementati in un software di analisi di potenza 20.
Nota: per consentire ai lettori di fare calcoli simili con i propri dati, ci sono le immagini dal software di analisi di potere liberamente disponibili (vedi Rappresentante dei risultati). Utilizzare i seguenti parametri: accettabile percentuale di falsi positivi (cioè, tipo I soglia di errore; α) ≤0.05, e il potere (che è uguale a 1-β) ≥0.80 (ad esempio, potenza superiore a 80%). Vedi sotto per le spiegazioni e una discussione 21.
6. Anziani benessere degli animali dopo chirurgia ictus
- Rendere disponibile ulteriore morbido chow unND gel reidratazione confezioni che i ratti sono stati abituati a prima dell'intervento chirurgico, oltre a bottiglie d'acqua con punte estese per facilitare raggiungendo. Inoltre, avere un pad recupero assorbibile nelle gabbie, invece di biancheria da letto sciolti (ad esempio, evitare di trucioli di legno) per le prime 24 ore, e di fornire biancheria da letto extra nidificazione. Non usare il cibo purea (ad esempio, alimenti per l'infanzia), come i ratti con disfagia possono soffocare.
- Pesare animali al giorno per 7 giorni per monitorare il recupero. La perdita di peso è una indicazione primaria di disidratazione e di stress. La perdita di peso nei primi giorni dopo l'intervento riflette principalmente la disidratazione (piuttosto che la perdita di peso corporeo a causa di alimentazione ridotta).
- Quando un topo di invecchiamento mostra la perdita di peso non correlato alla chirurgia, sostituire il peso corporeo perso con un peso equivalente di liquidi e controllare i denti superiori e inferiori. Dove i denti sono ricoperte, anestetizzare il ratto con isoflurano (come nella sezione 2.1), e posto in posizione supina
- Posizionare un 1 ml siringa dietro il TEETH per proteggere i tessuti molli. Tagliare con una sega circolare a mano (ad esempio, del diametro di circa 3 cm) ad alta velocità di rotazione, ma con movimenti lenti mano ferma (ad esempio, 3 tagli sec). Lasciare i denti del ratto di raffreddarsi tra i tagli. Assicurarsi che la sega rotante è montato sul mandrino in modo che faccia denti del sega nella direzione di rotazione. Vale la pena di tenere confezionati singolarmente, sterilizzati seghe rotanti pronto per tali eventualità.
Nota: crescita eccessiva può verificarsi in ratti anziani anche quando mantenuto su una dieta a pellet duro. Si raccomanda che i denti vengono controllati nei ratti anziani regolarmente.
- Posizionare un 1 ml siringa dietro il TEETH per proteggere i tessuti molli. Tagliare con una sega circolare a mano (ad esempio, del diametro di circa 3 cm) ad alta velocità di rotazione, ma con movimenti lenti mano ferma (ad esempio, 3 tagli sec). Lasciare i denti del ratto di raffreddarsi tra i tagli. Assicurarsi che la sega rotante è montato sul mandrino in modo che faccia denti del sega nella direzione di rotazione. Vale la pena di tenere confezionati singolarmente, sterilizzati seghe rotanti pronto per tali eventualità.
- Quando un topo anziano mostra la perdita di peso e piloerezione estranei a un intervento chirurgico, discutere le opzioni di trattamento con un veterinario. Considerate umanamente uccidendo l'animale. MRI di tali animali può mostrare un tumore ipofisario (spesso negli anziani ratti femmina), che è inutilizzabile e fatale.
Risultati
MCAO permanente è stata indotta eseguendo craniotomia, seguita da coagulazione e la distruzione dell'arteria cerebrale media per diatermia combinata con occlusione permanente del ipsilesionale arteria carotide comune e 60 min occlusione della controlesionale arteria carotide comune. Uno schema della configurazione dell'apparecchio e occlusa MCA è mostrato nella Figura 1, e delle arterie carotidi in Figura 2 (sopra).
Corsa risultato è stato valutato 24 ore e 8 settimane dopo l'ictus misurando il volume dell'infarto su 40 x 0,5 mm fette (da fine rostrale del bulbo olfattivo alla fine rostrale del midollo spinale) con la regione di interesse toolkit in un pacchetto di visualizzazione di immagini mediche. Una risonanza magnetica strutturale T2 rappresentante ponderata viene mostrato per lo stesso animale a 24 ore e 8 settimane (Figura 3a). Il volume dell'infarto fu identificato dalle aree del cervello di ratto che mostra un segnale iperintenso; come il peso T2le immagini mostrano ED acqua o plasma come area bianco brillante. E 'noto che vi è un incremento dell'edema cerebrale e rigonfiamento dopo ictus, e questo può essere misurato da una scansione T2 ponderata che è stata correlata alle misurazioni istologiche del volume dell'infarto 18. Tuttavia, l'edema presente presto dopo l'ictus (ad esempio, a 24 ore) può portare ad una sovrastima del volume della lesione finale (ad esempio, a 8 settimane) e quindi siamo anche presenti i volumi infarto media aggiustata utilizzando formule di Gerriet. Figura 3B mostra i dati medi da la prima (non aggiustato) volume delle lesioni in 24 ore da 62,8 millimetri 3 (± 25,4 millimetri 3 SD, grafico in alto); questo occupa il 9,8% dell'emisfero interessata (± 4,2% SD, grafico centrale). Quando corretto per rigonfiamento del cervello utilizzando formule GERRIETS 'questo valore si riduce al 4,5% (± 2,0% SD, grafico in basso).
Gravità dell'ictus è stata anche misurata con il test della scala Montoya 15. In breve, unnimals sono stati pre-addestrati per recuperare palline di zucchero per 4 settimane prima di un intervento chirurgico MCAO ictus, e testati per 8 settimane dopo l'ictus (Figura 4) per confermare un deficit sostenuta. I ratti sono stati posti nell'apparato scale per 10 minuti ed è stato registrato il numero di palline recuperate (su 21 pellet) e visualizzati in percentuale (gruppo significa ± errori standard). Una analisi di regressione è stata effettuata per adattarsi alla linea ai dati.
La Figura 5 mostra il calcolo dimensione del campione utilizzando dati del volume dell'infarto (per i potenziali effetti delle terapie candidati), analizzato utilizzando un algoritmo software di analisi di potenza per un t-test utilizzando "Differenza tra due mezzi indipendenti (due gruppi)" e con il (non corretta ) medie e deviazioni standard dalla figura 3B. Le informazioni in Figura 5 e Tabella 1 mostrano che 12 ratti sarebbe necessario per gruppo per rilevare una terapia che riduce infVolume ARCT del 50% a 24 ore, mentre la figura 6 mostra un "diagramma XY" del potere ottenuti utilizzando un numero variabile di animali. La tabella 1 riassume i calcoli della dimensione del campione per tutti i punti temporali.
Figura 3. T2-weighted MRI strutturale è usato per misurare le dimensioni dell'infarto e gonfiore del cervello dopo l'ictus. (A) Una immagine di risonanza magnetica pesata in T2 della stessa cervello di ratto 24 ore e 8 settimane dopo l'induzione di ictus. L'area bianca rappresenta la lesione, ma contiene anche alcuni edema vasogenico che risolve da 8 settimane. Volumi (B) infarto sono stati misurati utilizzando un immagine medica confezione schermo regione di interesse Toolkit, e sono tracciati su un grafico che rappresenta la media ± SD per i 3 punti di tempo utilizzati (n = 6). volume delle lesioni grezzo (non corretto per il cervello gonfiore dovuto a Edema), la percentuale di lesione dell'emisfero colpito (non corretta per il gonfiore), e la percentuale di lesioni dell'emisfero corretto per il rigonfiamento del cervello utilizzando formule GERRIETS 'sono mostrati qui. SD è stato utilizzato invece di SEM, al fine di eseguire calcoli dimensione del campione (vedi Figura 5). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Il test della scala mostra menomazioni a cogliere e il recupero di pellet. In questo modello corsa c'era molto poco recupero spontaneo. Ictus nei ratti anziani compromette persistentemente destrezza, dimostrato da test settimanale utilizzando il "test della scala" di pellet raggiungere. Nel riquadro: Una foto di un ratto eseguire il test comportamentale. Il grafico mostra la media (± supportoard errore) Numero di pellet recuperati (su 21, espresso in percentuale) a settimana dalla zampa interessata. n = 5. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. calcoli delle dimensioni del campione per determinare numeri di gruppo di ratti necessari per rilevare un effetto terapeutico desiderato. Questa schermata, presa dal software di analisi di potere, mostra che 12 ratti per gruppo sarebbero tenuti a rilevare una terapia che ha ridotto il volume dell'infarto del 50% a 24 ore. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Potenza ottenuta utilizzando vari numero totale di animali. Un "complotto XY per un intervallo di valori" dal software di analisi di potenza mostra la potenza che si otterrebbe per esperimenti utilizzando vari numeri (totale) di ratti anziani, dati i parametri mostrato nella Figura 5. la tabella 1 riassume tutti i nostri risultati. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Tempo dopo ictus: | Numero di ratti per gruppo richiesto per rilevare una riduzione del volume della lesione di: | ||
| 75% | 50% | 25% | |
| 24 ore | 6 | 12 | 42 |
| 8 settimane | 4 | 5 | 17 |
Tabella 1. I calcoli di dimensioni del campione per gruppo di ipotetici esperimenti futuri. Calcolato utilizzando il software di analisi dell'alimentazione (vedere figure 5 e 6). Tabella mostra il numero di ratti per gruppo richiesto per un esperimento a due gruppi per rilevare un, 50% e 75% riduzione del 25% in volume delle lesioni in ciascuno dei punti temporali in questo studio.
Discussione
MCAO nei roditori è una tecnica spesso usata per modellare ictus umana. Questo modello dispone di un paio di dettagli da notare nel protocollo. In primo luogo, è essenziale per mantenere la temperatura corporea degli animali durante l'esperimento come questo influenza le dimensioni dell'infarto e il numero di mortalità in uno studio. Può essere possibile interrompere isoflurano durante l'occlusione transitoria del diritto CCA e mantenere ratti in un ambiente silenzioso riscaldato per aumentare la sopravvivenza riducendo l'esposizione a isoflurano. I ricercatori dovrebbero considerare se un periodo più breve anestesia supera lo stress dell'induzione supplementare. Il sistema vascolare (ad esempio, MCA ramificazione) dei ratti varia all'interno e tra coorti di animali 22. E 'importante tenere a mente quando si inizia un nuovo studio. Tempi diversi occlusione CCA possono essere valutati (per esempio, 30, 45, 60 e 90 min). In questo studio è utilizzato un tempo di occlusione di 60 min. In altri studi abbiamo trovato che il 45min occlusioni provocano una dimensione dell'infarto corticale simile ma con prove aneddotiche di tassi di sopravvivenza migliori. Di conseguenza, hanno i chirurghi iniziano con un breve tempo di occlusione (ad esempio, 30 minuti) per vedere se adeguati volumi di lesione (e / o deficit comportamentali richiesti) si ottengono e solo allora di aumentare i tempi di occlusione, se necessario. i deficit comportamentali non sono sostenuti in ratti adulti rispetto ai ratti anziani con occlusione volte identici.
MRI può essere utilizzata per giudicare se (dopo un determinato tempo di occlusione) volumi lesioni sono appropriate per gli obiettivi di studio. Una piccola lesione sarebbe estendersi meno di dieci 0,5 mm fette coronali (su 40). Una dimensione della lesione medio sarebbe estendersi tra dieci e venti fette coronali. Una grande lesione sarebbe estendersi tra i venti ei trenta fette coronali. Una grande lesione sarebbe estendersi più di trenta dei quaranta fette. Nella nostra esperienza, i ratti con lesioni molto grandi (più di trenta fette) e / o prova di Acros ernias la linea mediana di solito hanno prognosi infausta: i tempi di occlusione più brevi potrebbero essere presi in considerazione. RM è anche utile per valutare la localizzazione dell'infarto: alcuni sono più caudalmente trovano e alcuni sono più rostralmente trovano.
Prestare particolare attenzione quando separa il nervo vago da entrambe le arterie carotidi comuni. Rales (raspatura) può verificarsi dopo l'intervento chirurgico ictus e questo potrebbe essere causa di danni ai nervi in alcuni animali, anche se la causa è attualmente poco chiaro: nella nostra esperienza, la prognosi è molto povera per questi animali e di solito è consigliato per ucciderli umanamente.
Le permanenti diatermia MCAO risultati del modello di infarti corticali riproducibili e tassi di sopravvivenza post-operatorie accettabili nei ratti anziani. La tecnica, tuttavia, richiedono un intervento chirurgico invasivo sotto uno stereomicroscopio. E 'importante mantenere una tecnica asettica, se gli animali sono a recuperare bene da un intervento chirurgico. Bisogna fare attenzione a non danneggiare la MCA, esponendo e coagulare l'arteria,e danni alla superficie corticale deve essere minimizzata altrimenti l'area esposta della corteccia può formare parte della zona infartuata. Si raccomanda di ottenere quanta più esperienza possibile stabilire la procedura e di raggiungere infarti coerenti e determinare i tempi di occlusione prima di uno studio viene eseguita per testare terapie candidati, per esempio. Gli sperimentatori dovrebbero mischiare le eventuali trattamenti all'interno di sessioni di chirurgia ( "blocco randomizzazione"), ove possibile. Vale la pena notare che questo modello non comporta MCA riperfusione (a meno transitoria MCA legatura si utilizza invece la diatermia). La mortalità può essere alto nei ratti anziani con queste grandi infarti corticali ma dovrebbe essere possibile ridurre la mortalità usando tempi più brevi occlusione e minimizzando l'esposizione alla anestesia generale ove possibile (ad esempio, durante l'occlusione). L'uso di 70% N 2 O ed il 30% O 2 come un vettore può consentire livelli inferiori di isoflurano da utilizzare: questa esposizione ridotta a isofluRane può provocare tassi di sopravvivenza più elevati.
Un altro punto da considerare è che l'aterosclerosi è un processo graduale, che, in questo protocollo abbiamo simulare con occlusione acuta CCA. Tuttavia, la sostanziale riduzione del flusso di sangue e deficit sostenuti simulare occlusioni tandem che si verificano in molti pazienti con ictus. Permanente distale MCAO senza tandem CCA occlusione nei ratti non riesce a indurre colpi riproducibile 14: Inoltre, senza tandem CCA occlusione, abbiamo trovato un notevole recupero spontaneo si verifica che preclude la valutazione del comportamento a lungo termine delle terapie ictus più di 8 settimane. Al contrario, mostriamo che distale MCAO con tandem CCA occlusione induce deficit a lungo termine nei ratti anziani.
In conclusione, questa procedura nei ratti provoca colpi che sono simili per dimensioni e posizione a quelli visti nella condizione umana, con disabilità sostenuta che si può usare per consentire la sperimentazione di nuovi trattamenti e delucidazione dei remeccanismi di coppia dopo ictus ischemico.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Prof. I Mhairi Macrae e la Dott.ssa Debbie Dewar, Università di Glasgow, che hanno gentilmente ospitato CW e DD per la formazione in questa procedura. La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio Europeo della Ricerca nell'ambito del Settimo Programma Quadro dell'Unione Europea (FP/2007-2013) / ERC Grant Agreement n. 309731 a LM. Questo lavoro è stato anche supportato da una "Serendipity Grant" da parte di The Dunhill Medical Trust a LM [numero di sovvenzione: SA21/0512].
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Carprofene | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | dare 0,25 mg/kg |
| Atropina Solfato | AmTech | RXATRINJ-100 | |
| Tamponi imbevuti di alcol | UHS | 20021 | |
| Crema di lidocaina (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Applicare una goccia delle dimensioni di un pisello sul collo rasato e sulle regioni temporali |
| Sistema di coperte omeotermiche | Harvard Instruments | 507222F | |
| Pinze | Strumenti per le scienze fini | 11019-12 | |
| Isoflurano | Abbott | B506 | |
| Suture di seta | Apparato Harvard | 723288 | |
| Sistema di cauterizzazione | Eschmann | ||
| 0,25 mm Pinze per cauterizzazione da gioielliere | Eschmann | 8330349 | |
| pinze Dumont fini | Strumenti per le scienze fini | 11251-10 | |
| gocciolamento salino azionato con il pollice | |||
| Sistema di aspirazione Vacusafe | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
| Macine in acciaio diamantate grossolane da 1,6 mm | K801 104 016 | ||
| 15000-03 | |||
| Forbici microvascolari | World Precision Instruments | 501790 | |
| 4-0 Suture Vicryl | Ethicon | ||
| Clip vascolare e applicatore | |||
| Microscopio operatorio | compatto Zeiss | ||
| Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Lame per bisturi in acciaio al carbonio n. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| aghi da 25 g Siringhe | Terumo | NN-2525R | |
| (1 ml e 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Soluzione salina (cloruro di sodio 0,9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton fioc | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilizzare prima dell'uso |
| garza | sterilizzare prima dell'uso | ||
| Pacchetto di imaging medico (Jim) | Xinapse | Software gratuito | |
| Software di mappatura parametrica statistica (SPM8) | UCL | Software gratuito | |
| per l'analisi della potenza (G*Power) | Universitä t Dü | Software libero |
Riferimenti
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