Articolo metodologico

Utilizzando Analisi confocale di

DOI:

10.3791/53162

⸱

14 dicembre 2015

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1Department of Biomedical Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 2Institute of Genetic Medicine, Newcastle University, 3Department of Cardiovascular Science, The Bateson Centre, University of Sheffield, 4School of Biochemistry, University of Bristol, 5Biology Department, University of York

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen.

Abstract

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Questo protocollo descrive un metodo per visualizzare ligandi distribuiti attraverso un campo di cellule. La facilità di esprimere proteine ​​esogene, insieme con le grandi dimensioni delle loro cellule in embrioni precoci, fare Xenopus laevis un modello utile per la visualizzazione di ligandi GFP-tag. MRNA sintetici sono efficacemente tradotte dopo l'iniezione in fase iniziale di Xenopus embrioni, e le iniezioni possono essere mirati a una singola cella. Se combinato con un tracciante lignaggio come membrana legato RFP, la cella iniettato (ei suoi discendenti) che stanno producendo la proteina overexpressed possono facilmente essere seguite. Questo protocollo descrive un metodo per la produzione di fluorescenza etichettato Wnt e Shh ligandi da iniettare mRNA. I metodi coinvolgono la micro dissezione di espianti ectodermici (tappi di animali) e l'analisi del ligando diffusione in più campioni. Utilizzando confocale, informazioni sulla secrezione ligando e diffusione su un campo di cellule può essere ottenuta. Le analisi statistiche delle immagini confocale forniscono dati quantitativi sulla forma di gradienti ligando. Questi metodi possono essere utili per i ricercatori che vogliono testare gli effetti dei fattori che possono regolare la forma di gradienti morphogen.

Introduzione

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Durante lo sviluppo embrionale precoce, le cellule sono progressivamente impegnati a seguire linee specifiche di differenziazione: questo significa un gruppo di totipotente (o pluripotenti) cellule diventano gradualmente limitarsi a verificare popolazioni di cellule progenitrici decisi a dare origine a un tipo di cellula. Segnalazione cellula-cellula è centrale per la regolamentazione specifica stirpe durante lo sviluppo embrionale. La manipolazione di questi segnali dovrà dirigere le cellule staminali verso particolari sorti per sostenere cure mediche innovative.

Un numero relativamente piccolo di vie di segnalazione sono ribadito durante lo sviluppo, tra cui percorsi di rispondere alla superfamiglia TGF (nodals e BMP) 1-2, FGFs 3, 4 Wnt, e Hedgehogs 5. Queste proteine ​​secrete legano recettori presenti sulla membrana cellulare per attivare trasduzione del segnale modificando così l'espressione genica e / o il comportamento cellulare. La stretta regolazione di segno cellulareAlling è essenziale per la specifica linea cellulare e lo sviluppo normale. Mentre il cross-talk tra questi percorsi è importante per determinare il destino delle cellule, un singolo ligando può sé suscitare risposte diverse a diverse concentrazioni. Gradienti morfogeno sono stati descritti più di 100 anni fa come una teoria per spiegare come i diversi tipi di cellule possono derivare da un campo di celle 6. Segnalazione molecole prodotte da un gruppo di cellule si diffonda in un determinato intervallo, diminuendo in concentrazione con una maggiore distanza dalla sorgente. Cellule esposte al segnale risponderà alla concentrazione locale nella loro posizione nel campo delle celle, con le cellule nelle posizioni distinte risposta diverso a diversi livelli di segnale. La prova dell'esistenza di morphogens deriva da studi dei primi Drosophila embrione 7 e il disco dell'ala 8, così come l'arto vertebrato 9 e 10 del tubo neurale.

I metodi sono necessari alvestigate come gradienti morfogeno sono stabilite e di individuare altre molecole importanti nella regolazione questi gradienti. Eleganti esperimenti che utilizzano immunoistochimica di visualizzare le proteine ​​endogene in vivo nel contesto di differenti background genetici sono stati utilizzati per indagare gradienti morphogen 11-12. Tuttavia, i buoni anticorpi e mutanti specifici non sono sempre disponibili, così abbiamo descritto qui un protocollo con sovraespressione di ligandi fluorescenti Xenopus, per fornire un'alternativa, metodo semplice per analizzare come i prodotti genici esogeni possono influenzare la distribuzione di ligandi attraverso un campo di celle. Xenopus laevis fornisce un ottimo sistema di intraprendere questo tipo di esperimenti come i loro embrioni si sviluppano esternamente in modo che siano accessibili nelle prime fasi. Loro grandi dimensioni (1-1.5mm di diametro) semplifica microiniezione e manipolazione chirurgica e blastula stadi cellule sono facili da immagine in quanto sono ancora relativamente grande (circa 2081; m di diametro). Studi iperespressione di Xenopus sono semplici da fare: mRNA iniettate nel embrione precoce possono essere mirati a particolari cellule ed è efficace tradotti.

I costrutti Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP fluorescente con tag sono stati generati utilizzando pCS2 Wnt8a-HA 13, pCS2 Wnt11b-HA 14 e eGFP. Il peptide HA è importante includere non solo per fornire un ulteriore indicatore molecolare, ma anche perché è pensato per fungere da distanziatore che separa le proteine ​​Wnt e eGFP permettendo entrambi i prodotti genici di funzionare. Il costrutto utilizzato per la visualizzazione di Shh è stato precedentemente utilizzato per generare un topo transgenico che esprime una proteina di fusione shh-eGFP 15; questo è stato gentilmente fornito da Andy McMahon. È importante sottolineare che il tag GFP per tutti i costrutti è clonato 3 'alla sequenza del segnale in modo tale che viene mantenuta dopo l'elaborazione. È anche essenziale per garantire che la proteina finale comprende sequenze necessarie modifiche, come la addition di lipidi, come è il caso di Shh e Wnt ligands.The cDNAs stati subclonato nel vettore pCS2 + di espressione che è ottimizzato per il prodution di mRNA sintetico; esso include un promotore SP6 e il segnale di poliadenilazione (http://sitemaker.umich.edu/dlturner.vectors).

Il lavoro qui descritto fornisce un protocollo semplice per confrontare la secrezione e la diffusione di fluorescente tag Wnt e Shh contrassegnati leganti. Iniettando quantità definite di mRNA sintetico, il protocollo circumnaviga eventuali problemi connessi con l'espressione variabile da vettori diversi utilizzando diversi promotori. Questi metodi sono stati recentemente applicato per studiare gli effetti del solfato endosulfatase eparan Sulf1 su Shh-eGFP e Wnt8a / secrezione Wnt11b-HA-eGFP e diffusione in Xenopus 16-17.

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Protocollo

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Etica dichiarazione: Gli esperimenti sugli animali sono stati fatti sotto una licenza ufficio Interni britannico all'on e gli esperimenti effettuati è stato approvato dal l'Università di York comitato etico nel rispetto del ARRIVARE (Animale di ricerca: Segnalazione di esperimenti in vivo) le linee guida. (https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

1. Strategia per la generazione di fluorescenza Tagged Ligandi

Qui di seguito è un protocollo per esempio subcloning Wnt8a-HA e eGFP in pCS2, al fine di produrre il telaio in fusione di costruire Wnta-HA-eGFP:

  1. Impostare ed eseguire reazioni PCR per Wnt8a-HA e eGFP. Utilizzare le informazioni visualizzate in fondo Tabella1 e la reazione PCR e Esempio Esempio PCR condizioni mostrate in Tabella 2. Nota: Template DNA varierà a seconda del costrutto viene prodotto, in questo esempio, Wnt8a-HA viene utilizzato come stampo di DNA.
  2. Pulire reazioni PCR utilizzando un kit di estrazione di gel, effettuare eluizione finale a 30μl di acqua di grado molecolare.
  3. Vedi 2 ml di prodotto di PCR su un gel di agarosio 1% preparato in TAE.
  4. Digest Wnt8a-HA e prodotti eGFP PCR e pCS2 utilizzando gli opportuni enzimi di restrizione (vedere Tabella 1), impostare le reazioni, come descritto nella tabella 2 (prodotto Esempio PCR digest).
  5. Incubare reazioni per 3 ore a 37 ° C e quindi memorizzare Wnt8a-HA e GFP PCR prodotti su ghiaccio.
  6. Aggiungere 1ml di vitello fosfatasi alcalina intestinale (CAIP) per pCS2 digest e incubare per 6 minuti a 37 ° C.
  7. Inattivare calore CAIP incubando per 15 minuti a 65 ° C.
  8. Eseguire pCS2 e PCR digerisce su un 1% gel di agarosio ultrapura preparato in TAE.
  9. Estratto Gel e ripulire pCS2 e prodotti di PCR utilizzando un kit di estrazione del gel, eseguire eluizione finale di 30μl di acqua di grado molecolare.
  10. Impostare legatura come descritto nella tabella 2 (Esempio T4 legatura) e incubare a 12 ° C per 16 ore.

2. mRNA Sintesi: Generazione TEmplate

  1. Produrre modelli con enzimi di restrizione dei seguenti plasmidi (tutti nel vettore di espressione pCS2): membrana Cerulean (memCerulean), membrana RFP (memRFP), Shh-GFP, Wnt8a / Wnt11b-HA-eGFP.
    1. Istituito restrizione digerisce come descritto nella tabella 2 (esempio modello di digerire).
    2. Miscelare delicatamente e incubare le reazioni per 2 ore a 37 ° C.
  2. Eseguire 2,5 ml di plasmide digerito su un gel di agarosio 1% (TAE) per verificare che la reazione sia tagliato a completamento.
  3. Ripulire le digerisce utilizzando un kit di estrazione di gel, effettuare eluizione finale in 50 ml di acqua grado molecolare.

3. mRNA Sintesi: In Vitro Trascrizione

  1. Sintetizzare mRNA funzionali utilizzando il kit di trascrizione SP6 mRNA. Montare le reazioni in 1,5 ml DNAse / RNase microprovette gratuito.
  2. Impostare reazioni mRNA trascrizione come descritto nella tabella 2 (sintesi Esempio mRNA).
  3. Mescolare lareazioni delicatamente con una pipetta e incubare a 37 ° C per 4 ore.
  4. Vedi 1 ml di reazione su un gel di agarosio al 2% (TAE).
  5. Aggiungere 1 ml di DNAsi alla reazione, mescolare delicatamente con un P20 e incubare la reazione per altri 15 minuti a 37 ° C.
  6. Aggiungere 340 ml di acqua ultrapura, 40 ml di acetato di ammonio e 400 ml di fenolo-cloroformio per la reazione. Agitare le reazioni per 30 sec.
  7. Gira la mRNA per 5 minuti, 14000 g, 4 ° C.
  8. Pipettare il top (acquosa) strato da ogni reazione di spostarlo a un nuovo 1,5 ml a vite provetta tappo microcentrifuga.
  9. Aggiungere un uguale volume di cloroformio per ciascuna delle reazioni decantate. Agitare i campioni per 30 sec.
  10. Gira la mRNA per 5 minuti, 14000 g, 4 ° C
  11. Pipettare lo strato superiore acquoso da ogni reazione di spostarlo a un nuovo 1,5 ml tappo a vite provetta.
  12. Aggiungere un volume uguale di isopropanolo a ciascuna delle reazioni e precipitare il mRNA a -80 ° C per 30 min.
  13. Spin ciascuna delle reazioni per 15 min a 14.000 xg, a 4 ° C per sedimentare il mRNA
  14. Rimuovere il surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet mRNA
  15. Aggiungere 200 ml di etanolo al 70% per ciascuna delle reazioni, mescolare le reazioni e poi girare per 10 minuti a 14.000 xg, a 4 ° C.
  16. Rimuovere l'etanolo facendo attenzione a non disturbare il mRNA, asciugare il pellet a temperatura ambiente utilizzando un essiccatore sotto vuoto o velocità-vac.
  17. Risospendere il mRNA in 10-20 ml di acqua di grado molecolare. Spin brevemente e conservare i campioni in ghiaccio. Nota: riscaldare il campione a 80 ° C per 1 min può aiutare sciogliere.
  18. Eseguire 1ml di mRNA su un gel di agarosio al 2% (TAE) e analizzare 1,2 microlitri su uno spettrofotometro per ottenere una lettura accurata della concentrazione.
    PUNTO CRITICO: è necessaria una concentrazione di 400 ng / ml di mRNA sintetico per eseguire i seguenti esperimenti.
    PUNTO CRITICO: Se il rapporto è 260/280al di fuori del range di 2,00-2,20, o la quantità totale di mRNA supera 12 mg, effettuare una precipitazione di cloruro di litio.
  19. Conservare mRNA in 1 aliquote microlitri a -80 ° C. Utilizzare aliquote e poi buttare via; non ricongelare mRNA.

4. Generazione di Xenopus laevis embrioni

  1. Prime Xenopus laevis femmine per via sottocutanea con 50 unità di ormone gonadotropina corionica umana (hCG), Chorulon una settimana prima dell'esperimento.
  2. Indurre Xenopus laevis femmine la notte prima dell'esperimento iniettando 250 unità di HCG e li incubazione al buio, O / N a 19 ° C.
  3. Sezionare testicoli di eutanasia rana maschili e conservare in 1xNAM a 4 ° C. Nota: Uomo rana è eutanasia da anestesia terminale secondo Allegato 1 degli animali (Procedure Scientifiche) Act 1986 (https://www.nc3rs.org.uk/euthanasia).
  4. Massaggio femminile Xenopus laevis per indurre l'ovulazione, raccogliere il lauova id in un piatto Petri rotondo 55 mm di diametro.
  5. Produrre una sospensione di spermatozoi schiacciando ¼ di testicolo Xenopus laevis in 1 ml di acqua deionizzata.
  6. Spazzola Xenopus ovociti con la sospensione di spermatozoi schiacciato con una pipetta Pasteur e pipetta lampadina PUNTO CRITICO:. Eseguire reazioni di fertilizzazione a circa 04:30, il giorno dell'esperimento.
  7. Embrioni Cultura a 21 ° C in NAM / 10 (si veda la tabella 3 per soluzioni) in 55 mm capsule di Petri rivestite con 1% di agarosio diluito in acqua (acqua).
  8. Embrioni De-gelatina dopo 45 min usando cisteina / HCL (Tabella 3). Nota: A 21 ° C, embrioni raggiungere la fase 2 cella dopo 90 minuti e fendere ogni 20 min dopo.

5. microinjecting Xenopus embrioni

  1. Utilizzando 1 x 90 mm capillari in vetro e una Narishige PC-10 a doppio stadio micropipetta di vetro estrattore, tirare micropipette per preparazioni iniettabili. Regolare le impostazioni empiricamente per ottenere una punta sottile (meno di un micron Diameter).
  2. Attaccare una micropipetta (ago) per un microinjector gas (per esempio, la Harvard Appartaus PLI-100 PICO-INIETTORE) per fornire ripetutamente volumi precisi di liquido applicando una pressione regolata per un periodo di tempo impostato digitalmente. Regolare la pressione pneumatica per offrire un volume di 1,25 a 10 nanolitres come determinato utilizzando un reticolo o di calibrazione diapositiva.
  3. Coat una capsula di Petri 55 mm con 5 ml di 1% agarosio (acqua). Tagliare un quadrato 35-35 mm di agarosio fuori dal piatto, questo fornirà una superficie stabile per microinject embrioni.
  4. Trasferimento degli embrioni in NAM / 3 + Ficoll (Tabella 3) e spostare di piatto iniezione.
  5. Iniettare gli embrioni nell'emisfero animale una volta raggiunta la fase necessaria per l'esperimento.
    1. Per analizzare la distribuzione di ligandi GFP contrassegnate sulla superficie cellulare, iniettare gli embrioni bi lateralmente in due stadi cellule, 10NL per cella. Diluizioni Esempio mRNA sottoindicato per Wnt8a-HA-eGFP. PUNTO CRITICO: Assicurarsi che tutti i mRNA le concentrazioni starte a 400 ng / ml.
      Nota: La quantità di mRNA da iniettare deve essere determinato empiricamente testando concentrazioni e trovando la quantità minima necessaria per visualizzare il ligando fluorescente. Western blotting utilizzando un anticorpo anti-HA è un passo essenziale per determinare che gli mRNA sono tradotti a livelli simili al fine di consentire il confronto di due differenti ligandi fluorescenti contrassegnate; abbiamo fatto questo per Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP in Fellgett et al., 2015.
      Nota: Nel valutare l'effetto di un iniettata mRNA (come una codifica per un regolatore candidato), un controllo tipico è quello di iniettare un RNA non attivo, come LacZ, in embrioni di pari livello per controllare eventuali effetti aggiuntivi trascrizioni nell'embrione.
      1. Diluire memRFP mRNA 1 a 4 (1ml + 3_l dH 2 O) con acqua di grado molecolare per ridurre la concentrazione di 100 ng / ml.
      2. Diluire Wnt8a-HA-eGFP mRNA 1 a 4 (1ml + 3_l dH2 O) con acqua ultrapura per ridurre la concentrazione di 100 ng / ml.
      3. Mescolare memRFP mRNA in un rapporto 1: 1 con Wnt8a-HA-eGFP mRNA.
      4. Mescolare mRNA da 5.5.1.3 in un rapporto 1: 1 con uno dei due controlli mRNA LacZ o un modulatore come Sulf1.
      5. Iniettare embrioni bilateralmente allo stadio di 2 cellule con 10NL di mRNA per cella (totale 20nl). Nota: Ciò si traduce in 250 pg di m em RFP, 250 pg di Wnt8a-HA- e GFP, 500 pg di Wnt11b-HA- e GFP e 2 ng di LacZ o Sulf1 mRNA essere iniettato in ciascuna cella.
    2. Per analizzare la diffusione di GFP tag ligandi, iniettare mRNA codificanti per ligando-GFP insieme con un indicatore lignaggio, come memRFP allo stadio di 16-32 cellule, 1,25 nl per cella.
    3. Per analizzare gli effetti di qualsiasi potenziale modulatore ligando diffusione, co-iniettare mRNA codificante per il modulatore insieme al ligando e lineage tracciante. In alternativa, iniettare le cellule vicine: una con mRNA codificanti per la ligan GFP-taggedd e un tracciante lineage (memRFP) e l'altra con mRNA codificanti per il modulatore ed un differente tracciante lineage (memCerulean).
  6. Trasferimento degli embrioni ad un C incubatore 12,5 ° e la cultura fino al giorno successivo, Nieuwkoop e Faber (NF) fase 8.

6. ablazione Animal Cap espianti

  1. Trasferimento degli embrioni per un 55 mm piastre di Petri rivestite di 5 ml di 1% agarosio (acqua). Riempire il piatto con NAM / 2 (Tabella 3).
  2. Prendere tappi animale circolari utilizzando aghi tungsteno PUNTO CRITICO:. Prendere le large cap in questa fase, questi saranno guarire meglio e più facili da immagine, mantenere le protezioni di controllo per garantire la verifica alcuna estensione convergenti.
  3. Trasferimento espianti animali per 55 mm piastre di Petri rivestite con 1% di agarosio (acqua) ed embrioni di cultura a 21 ° C per 4 ore PUNTO CRITICO:. L'incubazione 4 ore è necessario per consentire proteine ​​fluorescenti a maturare.
  4. Genera diapositive rilievo da attaccare giù due strati di isolamento di PVCn nastro sul vetrini da microscopio. Tagliare a 14 mm di 10 mm rettangolo di fuori del nastro per lasciare una camera per il montaggio di tappi animali PUNTO CRITICO:. Appiattire due strati di nastro a fondo sul vetrino prima di tagliare il rettangolo.
  5. Dispensare 2 gocce separate di NAM / 2 (Tabella 3) nella diapositiva sollievo, circa il 30 microlitri per goccia.
  6. Trasferimento espianti animali per le diapositive di soccorso con una punta P20 tagliare e orientare in modo che il lato apicale rivolta verso l'alto. Nota: Ogni diapositiva può contenere 10-15 tappi animali PUNTO CRITICO:. A questo punto i tappi animali avrebbero dovuto parzialmente guarito, questo significa che sono meno delicati e possono essere orientati con pinze.
  7. Abbassare delicatamente una scivolata copertura in vetro sul vetrino di soccorso e permettere la polizza di copertura ad asciugare per 20 min PUNTO CRITICO: La dimensione della protezione animale è fondamentale;. garantire il tappo è abbastanza grande che quando il vetrino di vetro si abbassa sul vetrino sollievo comprime lo strato apicale delle cellule cap animale abbastanza per produce una superficie piana per l'immagine. Se i tappi degli animali sono ancora troppo piccoli poi ridurre il nastro in PVC ad un livello.
  8. Sigillare il vetrino utilizzando smalto PUNTO CRITICO:. Non usare troppo smalto per sigillare le diapositive di soccorso, perché se il nastro in PVC diventa troppo umido si rialzerà e rovinare la diapositiva.
  9. Scivoli rilievo a secco per 20 minuti al buio e sono pronti per l'immagine, in genere le protezioni animali rimarranno sano per 4-6 ore una volta sigillato nella diapositiva.

7. Imaging

Nota: Imaging è stata effettuata utilizzando un microscopio confocale invertito. Modalità Lambda è stata scelta per l'imaging come questo ha permesso più fluorofori con le firme da usare sovrapposti, e rimosso il problema di movimento potenziale campione tra le scansioni.

  1. Trova espianti con un obiettivo a basso ingrandimento poi passare a 63x / 1,4 obiettivo olio per una maggiore l'imaging risoluzione.
  2. Accendere i laser necessarie; per questo esempio il 405laser è stato utilizzato per eccitare memCerulean, il laser 488 è stato usato per eccitare GFP e il laser 561 per eccitare memRFP utilizzando 405 e 488/561 specchi dicroici.
  3. Usare la modalità lambda (Nello Zen 2011, la modalità lambda selezionare - 32 bidoni).
  4. Selezionare il 405nm, 488 nm e 561nm lasers.To consentire un più ampio campo di vista, diminuire l'immagine (a 0.6x).
  5. Impostare le dimensioni della cornice per le dimensioni dell'immagine desiderata (1024 x 1024 con dimensioni dei pixel di 220 nm è stato utilizzato per questo insieme di dati).
  6. Impostare una media di solito 4 a 8 per aumentare il rapporto segnale-rumore.
  7. Ottimizzare la (unità 1 arioso secondo il laser 561nm è stato utilizzato per questo insieme di dati) foro stenopeico.
  8. Ottimizzare le potenze laser PUNTO CRITICO:. Bilanciare i 405nm, 488 nm e 561nm laser tali che tutti i fluorofori possono essere rilevati utilizzando la matrice 32 rilevatore, riducendo al minimo la quantità di tensione e guadagno richiesto.
  9. Raccogliere l'essere luce emessa da memCerulean, GFP e memRFP. Per questo la luce del lavoro è stato raccolto ogni ~10nm da 415-720nm, sebbene gli intervalli di raccolta più grandi sono anche possibile (ad esempio., Ogni ~ 20 nm).

Analisi 8. Immagine

  1. Studio degli effetti di modulatori sull'espressione superficie cellulare dei ligandi GFP-tagged
    NOTA: Le seguenti operazioni sono una guida dettagliata di come l'analisi è stata effettuata nel nostro laboratorio. L'utente finale può decidere di semplificare il processo scrivendo uno script ImageJ o FIJI per eliminare alcuni dei passaggi manuali.
    PUNTO CRITICO: è importante campioni dell'utente finale Gli spettri di eventuali fluorofori utilizzati nelle stesse condizioni che l'esperimento finale viene eseguita per perf orm unmixing spettrale efficace delle molteplici fluorofori usati nell'esperimento finale.
    Due tipi principali di analisi vengono eseguite in questa sezione:
    1. Calcolare il numero totale di Wnt-HA-eGFP pixel co-localizzazione con la membrana cellulare.
      1. Unmix il verde,canali rosso e ceruleo utilizzando spettri campionati da singole iniezioni di questi fluorofori nel software ZEN. Salvare queste immagini come documenti LSM separati per l'uso in tutti i passaggi seguenti.
      2. Aperto LSM file direttamente nel software di editing delle immagini. Nota: Le seguenti istruzioni sono per FIJI immagine J.
      3. Salvare le immagini LSM come documenti di sequenza di immagini, questa divide automaticamente le immagini nei canali separati.
      4. Salvare la sequenza di immagini nella stessa cartella come gli script per il software di analisi script che verranno utilizzati per analizzare i dati (vedere file di codice supplementari per lo script vero e proprio). Nota: Le seguenti istruzioni sono per Matlab.
      5. Aprire il software di analisi sceneggiatura e aprire la directory in cui sono scritti gli script.
      6. Immettere il nome del file in analisi Location, il software prenderà il nome del file ed eseguire l'analisi.
        Nota: I nomi dei file leggeranno ImageA0000 e ImageA0001 per ogni image. Il software di analisi di script utilizzerà il immagine segnato 0001 come maschera e analizzare la percentuale di pixel nell'immagine 0000 che co-localizzare con questa maschera.
      7. Prendete il numero percentuale di co-localizzazione (annotato come membrana cellulare popolate) e copiare questo a un foglio di calcolo. Nota: Le seguenti istruzioni sono per Excel.
      8. Tracciare il numero percentuale di co-localizzazione su un grafico a barre o come valore assoluto o relativo.
    2. Analizzando il numero, le dimensioni e la forma di Wnt-HA-eGFP puncta.
      1. Aperto LSM non mescolato i file direttamente nel software di editing delle immagini. Nota: le seguenti istruzioni sono relative FIJI immagine J.
      2. Dividi ogni immagine nei suoi canali separati (Immagine> Colore> canali Split).
      3. Soglia sia il canale marcatore membrana Wnt-HA-eGFP e (Immagine> Regola> Auto-soglia) PUNTO CRITICO:. Prova una serie di soglie per vedere quale produce un'immagine rappresentativa, senza sovraesporreil canale.
      4. Convertire il canale marcatore membrana per una maschera (Processo> Binary> Crea maschera).
      5. Invertire questa maschera (Modifica> Inverti).
      6. Convertire il puncta Wnt-HA-eGFP ad una maschera come sopra.
      7. Sottrarre la maschera marcatore membrana dalla maschera ligando-GFP (Processo> calcolatrice Immagine> Maschera Wnt nella top box, la maschera di membrana in scatola in basso).
      8. Utilizzare la funzione di analizzare particelle. Da qui, selezionare i parametri richiesti e analizzare i dati (particelle Analyse> Analyse).
      9. Copiare il numero di particelle, dimensione media della particella e dati circolarità in un foglio di calcolo e quindi tracciare i grafici di questi dati. Nota: Per questa analisi, le particelle solo tra 0.1-10μm 2 dimensioni sono stati analizzati, senza restrizioni sono stati immessi sul circolarità delle particelle. Questa istruzione è per Excel.
  2. Analizzando la gamma di legante diffusione
    1. Aprire tutte le immagini non mescolate a im confocaleinvecchiamento software e quindi esportare i file in un formato TIF, come dati grezzi e come immagine RGB Nota:.. Questa istruzione è per Zen lite 2011 PUNTO CRITICO: Includere una barra di scala su almeno una delle immagini in modo che la distanza possa essere calcolato durante l'analisi.
    2. Aprire le immagini da analizzare in software di analisi dell'immagine. Nota: Le seguenti istruzioni sono per Photoshop 8.2.3) Fare clic destro sullo sfondo dell'immagine e selezionare 'livello da sfondo', per creare un nuovo livello..
    3. Impostare i canali marcatori di membrana a 0, in modo che solo il canale ligando-GFP è visibile (Livello> Nuovo livello di regolazione> Miscelatore canale) PUNTO CRITICO:. Fissare il nuovo livello di regolazione all'immagine analizzato, la possibilità di agganciare il nuovo livello di questa immagine è disponibile come una casella di spunta dopo aver fatto clic sull'opzione canale del mixer.
    4. Aprire una nuova area di lavoro. Impostare la risoluzione a 300 pixel per pollice e la modalità colore al colore RGB (File>Nuovo> Appunti).
    5. Copia tutte le immagini oggetto di analisi nel un'unica area di lavoro (Cliccare sull'immagine ed è ritagliato canale del mixer da holding di controllo quindi tenere il controllo e Alt e trascinare l'immagine nell'area di lavoro).
    6. Orientate tutte le immagini in modo che la lunghezza massima di diffusione per ogni immagine può essere misurata lungo l'asse orizzontale, con le cellule che esprimono Wnt-HA-eGFP orientato verso sinistra.
    7. Salvare lo spazio di lavoro come TIF e quindi aprire questo nel software di analisi delle immagini. Nota: Le seguenti istruzioni sono per FIJI immagine J.
    8. Aprire la finestra di gestione ROI (Analyse> Strumenti> Gestione ROI).
    9. Disegnare un rettangolo sulla prima immagine, è possibile specificare la dimensione esatta del rettangolo (strumento di selezione rettangolo e disegnare qualsiasi rettangolo> Modifica> Selezione> Specifica). Nota: Una dimensione di 650 x 100 pixel lunghezza x larghezza è stato utilizzato in questo studio.
    10. Posizionare il rettangolo sul bordo del dominio esprimere Wnt-HA-eGFP. Posizionare il rettangolo sopra la regione con la distanza massima di Wnt-HA-eGFP diffusione. PUNTO CRITICO: Anche senza il marcatore di membrana delle regioni esprimono Wnt-HA- e GFP dovrebbe essere visibile a causa di fluorescenza di fondo; se non poi consultare le immagini RAW.
    11. Spostare la casella 10 pM a destra. Determinare il numero di micrometri misurando la lunghezza della barra della scala compresa in una delle immagini (Disegnare una linea tracciando la barra di scala> Analisi> scala impostato). Nota: Ciò fornisce un valore per 10 uM in pixel.
    12. Aggiungere la casella al gestore ROI premendo il pulsante Aggiungi nella finestra di gestione del ROI.
    13. Spostare rettangolo per l'immagine successiva da misurare facendo clic di nuovo sullo strumento Rettangolo per spostare il rettangolo. Ripetere i passaggi 8.2.10-11.
    14. Una volta che tutti i pannelli sono stati misurati, selezionare multiplo dal menu direttore ROI (direttore ROI> Altro> multiplo> List).
      Nota: i dati rappresentano Wnt pixel intensity (Y) con l'aumentare della distanza lungo l'asse orizzontale (X, misurata in pixel). Il valore per Y è l'intensità media del segnale di ligando-GFP nel punto X e la media è calcolata da tutti i pixel sull'asse Y per ciascun valore X. Di conseguenza, il più alto della scatola, più pixel saranno analizzati per la produzione di questo media. Una piccola scatola (in asse Y) sarà più rumorose; una scatola di alto avrà molto bassa intensità media dei pixel.
    15. Copiare i dati dalla scatola multiplo in un foglio di calcolo e ri-label di conseguenza. Nota: Le seguenti istruzioni sono per Excel.
    16. Scartare la prima 10-20μm di dati da ogni analisi come questo rappresenta fluorescenza di fondo da cellule che esprimono GFP-ligando e distorce i grafici.
    17. Aprire analisi e grafici software scientifico e creare un nuovo notebook. Nota: Le seguenti istruzioni sono per SigmaPlot 13.
    18. Etichettare il numero di colonne per i dati facendo doppio clic sui numeri orizzontali on il foglio di lavoro e di etichettatura loro distanza in micron, Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP.
    19. Copiare i dati dal foglio di calcolo in pertinenti colonne l'analisi e la rappresentazione grafica del software scientifico.
    20. Creare un grafico a dispersione (Create grafico> Scatter> dispersione multipla> Selezionare X molti Y> Selezionare la colonna a distanza per X> Seleziona Wnt8a-HA-eGFP e Wnt11b-HA-eGFP per i valori Y> Fine).
    21. Eseguire l'analisi di regressione della curva Wnt8a-HA-eGFP cliccando con il tasto sinistro su un punto Wnt8a-HA-eGFP sul grafico a dispersione. Tutti i punti dovrebbero evidenziare. Clicca su Analisi> regressione guidata.
    22. Selezionare la categoria equazione della curva (decadimento esponenziale) e il nome equazione (singolo, 3 parametri), quindi premere il prossimo.
    23. Selezionare i valori X e Y a cui deve essere montato la curva (se i dati sono stati evidenziati in precedenza, questo dovrebbe essere fatto automaticamente), quindi premere il prossimo.
    24. Continuare la procedura guidata fino a quando l'opzione Uscita NumericoPagina s, garantire 'creare rapporto' sia spuntata premere Avanti. Nota: I parametri per la curva adattata verranno visualizzati in rapporto 1 *.
    25. Nella pagina delle opzioni grafico garantire 'aggiungere equazione per rappresentare graficamente il titolo' sia spuntata, quindi premere finitura. Nota: La procedura guidata avrà creato Report 1 * e Grafico 1 * schede nella parte superiore del libro nota. Inoltre vi sono stati aggiunti la curva al grafico prodotto in (8.2.20).
    26. Ripetere i passaggi 8.2.21-8.2.25 per adattarsi una curva per Wnt11b-HA-eGFP PUNTO CRITICO:. Cercare di montaggio più categorie di equazione e nomi equazioni ai dati. Nota: La curva con la misura migliore dovrebbe produrre il più alto valore di R 2 con il più basso somma residua dei quadrati.

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Risultati

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Analisi confocale di espianti protezione animale che esprimono proteine ​​fluorescenti tag fornisce un sistema efficace per la visualizzazione di distribuzione ligando in diverse condizioni sperimentali. In un esempio, la distribuzione di GFP etichettato Shh è mostrato (Figura 1). Nella fase 2 cellule, embrioni di Xenopus vengono iniettate in entrambe le cellule con una o con mRNA di controllo o con mRNA codificante per Sulf1, un enzima che modifica superficie cellulare eparan solfato e influen...

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Discussione

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Una parte essenziale di questo protocollo genera ligandi biologicamente attivi che vengono normalmente trattati, secreti, e in grado di suscitare una risposta nella cellula ricevente, pur avendo una porzione fluorescente allegata. E 'fondamentale per stabilire che il prodotto del gene fluorescente-tag è biologicamente attivo utilizzando un dosaggio adeguato. Per Shh-GFP, la capacità di attivare l'espressione di PTC1 stato confermato 16. Wnt8a ha notevolmente potente capacità di indurre un ass...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato finanziato da un BBSRC concedere a parlamentare europeo (BB / H010297 / 1), una quota borsa di studio BBSRC a SAR, e una borsa di studio MRC in SWF.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarosioMelfordMB 1200
Acetato di ammonioAmbionda Megascript SP6 Kit AM 1330
BicarbonatoVWR InternationalRC-091
Nitrato di calcioSigmaC13961
Tappo analogo (m7G(5'))Applied BiosystemsAM 8050
CloroformioSigmaC 2432
L-Cisteina cloridrato monoidratoSigmaC7880
dNTPInvitrogen18427-013
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)SigmaO3690
EtanoloVWR International20821.33
Ficoll 400SigmaF 4375
Fiji image J softwareDownload gratuito http://fiji.sc/Fiji
GentamicinaMelfordG 0124
Acido acetico glacialeFisher ScientificA/0400/PB17
Vetrini coprioggetti, n. 1.5Forniture per laboratorio scientifico22X22-SGJ3015. 22X50-SGJ3030 
Estrattore di aghi in vetroNarishigeNarishige PC -10
Aghi per trazione in vetroDrummond Scientific3-000-203-G / X
Gonadotropina cronica umana (HCG)Intervet
IsopropanoloFisher ScientificP / 7500 / PB17
Cloruro di litio (LiCl)SigmaL-7026
LSM710 e Software Zen (2008-2010)Carl Zeiss
Matlab softwareMathworkshttp://uk.mathworks.com/
Acqua di grado molecolare Fisher ScientificBP 2819-10
Smalto per unghie StivaliCodice a barre 3600530 373048
SpettrofotometroLab.tech InternationalND-1000 / ND8000
Piastra di Petri (55 mm)VWR International391-0865
Fenolo-cloroformioSigmaP3803
Software PhotoshopAdobehttp://www.photoshop.com/products
DNA polimerasi ad alta fedeltà e tamponi BiolabsM0530S  Tampone - M0531S
Cloruro di potassio (KCl)Fisher ScientificP/4280/53
Nastro isolante in PVCOnecallSH5006MPK
Kit di estrazione del gel QiagenS28704
Enzimi di restrizione tamponiRocheSuRE/CUT Set di tamponi 11082 035 001
DNAse senza RNAsiPromegaME10A
Lame posteriori in acciaio a bordo singoloPersonna66-0403-0000
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher Scientific27810.364
SP6 kit di trascrizioneAmbionAM1330
VetriniThermo FisherSHE 2505
Tris baseInvitrogen15504-020
Aghi di tungstenofatti in casa
Zen lite softwareCarl ZeissDownload gratuito  http://www.zeiss.co.uk/microscopy/en_gb/downloads/zen.html

Riferimenti

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