Bacterial Artificial Chromosomes: uno strumento Genomica Funzionale per lo studio di positivo-strand virus RNA

Sommario

Qui, viene presentato un protocollo per la creazione di un cromosoma artificiale batterico infettivo contenente un cDNA a lunghezza intera dell'RNA genomico a filamento positivo del virus dell'encefalite giapponese. Questo protocollo può essere utilizzato per costruire un cDNA funzionale di altri virus a RNA a filamento positivo, rendendolo un potente strumento genomico per lo studio della biologia dei virus.

Abstract

La genetica inversa, un approccio per salvare il virus infettivo interamente da un cDNA clonato, ha rivoluzionato il campo dei virus a RNA a filamento positivo, i cui genomi hanno la stessa polarità dell'mRNA cellulare. Il sistema di genetica inversa basato su cDNA è un metodo seminale che consente la manipolazione diretta dell'RNA genomico virale, generando così virus ricombinanti per studi molecolari e genetici sia degli elementi dell'RNA virale che dei prodotti genici nella replicazione e nella patogenesi virale. Fornisce inoltre una preziosa piattaforma che consente lo sviluppo di vaccini geneticamente definiti e vettori virali per la consegna di geni estranei. Per molti virus a RNA a filamento positivo come il virus dell'encefalite giapponese (JEV), tuttavia, i cDNA clonati sono instabili, ponendo un grave ostacolo alla costruzione e alla propagazione del cDNA funzionale. Qui, il presente rapporto descrive le considerazioni strategiche nella creazione e nell'amplificazione di un cDNA JEV infettivo a lunghezza intera geneticamente stabile come cromosoma artificiale batterico (BAC) utilizzando le seguenti procedure sperimentali generali: isolamento dell'RNA virale, sintesi del cDNA, subclonaggio e modifica del cDNA, assemblaggio di un cDNA a lunghezza intera, linearizzazione del cDNA, in vitro Sintesi dell'RNA e recupero del virus. Questo protocollo fornisce una metodologia generale applicabile alla clonazione di cDNA a lunghezza intera per una serie di virus a RNA a filamento positivo, in particolare quelli con un genoma di >10 kb di lunghezza, in un vettore BAC, da cui gli RNA infettivi possono essere trascritti in vitro con una RNA polimerasi batteriofago.

Introduzione

Per virologi di RNA, l'avvento della tecnologia del DNA ricombinante alla fine del 1970 ha permesso di convertire i genomi di RNA virale in cloni di cDNA, che potrebbero poi essere propagati come plasmidi nei batteri per la manipolazione genetica dei virus RNA. ¹ Il primo virus RNA per essere molecolarmente clonato era batteriofago Qβ, un virus a RNA positivo filamento che infetta Escherichia coli. Un plasmide contenente una copia completa del cDNA dell'RNA genomico Qβ all'origine infettive fagi Qβ quando introdotto in E. coli. ² Poco dopo, questa tecnica è stata applicata a poliovirus, virus RNA positivo filamento di esseri umani e animali. Un plasmide recante un full-length cDNA dell'RNA genomico poliovirus è infettivo quando trasfettato in cellule di mammifero e in grado di produrre virioni infettivi ³ In questo approccio "DNA-lanciato", i cDNA clonati andrebbe trascritto intracellulare di avviare la replicazione dell'RNA virale.;Tuttavia, non è chiaro come si inizia la trascrizione e come le trascrizioni vengono elaborati nella sequenza corretta virale. Questa preoccupazione ha portato allo sviluppo di un'alternativa "RNA-lanciato" approccio, in cui una copia completa del cDNA dell'RNA genoma virale viene clonato sotto promotore riconosciuto da un E. coli o fago RNA polimerasi per la produzione di RNA sintetici in vitro con definito 5 'e 3' termini, che subiscono il ciclo completo di replicazione virale quando introdotto in cellule ospiti. ^4,5 Il primo successo con questo approccio è stato segnalato per brome mosaic virus , ^6,7 un virus RNA positivo filamento di piante. Da allora, l'approccio RNA lanciato è stato sviluppato per una vasta gamma di virus a RNA positivo filamento, tra cui calicivirus, alphaviruses, flavivirus, arteriviruses e coronavirus. ^1,4,5,8

Sia il DNA e RNA-lanciato sistemi genetica inversa, la costruzione di un Full lunghezza clone di cDNA è la chiave per generare DNA infettivo o RNA di virus a RNA positivo filamento, ma diventa una sfida considerevole tecnica come la dimensione degli aumenti genoma virale. ^9-17 In particolare, una grande genoma RNA di ~ 10 -32 kb presenta tre principali ostacoli alla clonazione di un cDNA funzionale full-length. ¹⁸ La prima difficoltà è la sintesi di un fedele cDNA copiano, poiché la fedeltà di RT-PCR è inversamente proporzionale alla lunghezza del RNA virale. Il secondo ostacolo è la presenza di sequenze potenzialmente tossici, poiché le molecole di RNA lunghi sono più probabile che contengono sequenze inaspettati capaci di rendere il frammento di cDNA in plasmidi instabili in E. coli. Il terzo e più importante problema è la disponibilità di un vettore adatto, dal momento che è difficile trovare un vettore di clonazione che può alloggiare un inserto di cDNA virale> 10 kb. Nel corso degli ultimi tre decenni, queste barriere sono state superate da alcuni progressi in enzimologia, la metodologia, und vectorology. ^1,4,5,8 Di questi, lo sviluppo più promettente e innovativo è la clonazione di grandi virus a RNA positivo filamento come infettive cromosomi batterici artificiali (BAC). Il vettore BAC è un plasmide a basso copia clonazione (1-2 copie / cella) in base alla E. coli plasmide f, con una dimensione media di DNA dell'inserto ~ 120-350 kb ^19-21 Un frammento di DNA viene inserito nel vettore BAC in modo simile alla clonazione nei vettori di clonazione generali.; le conseguenti cloni BAC sono stabili per molte generazioni a E. coli. ^22,23 ad oggi, la tecnologia BAC è stata utilizzata per creare cloni di cDNA infettivi per> 10 membri di tre positivo-strand famiglie di virus RNA, cioè flaviviridae, ^24-29 Arteriviridae, ^{30 e} Coronaviridae. ^{9,16,17 , 31,32}

Utilizzando virus dell'encefalite giapponese (JEV), come esempio, il presente lavoro riporta le procedure dettagliate che possono essereutilizzato per costruire un full-length BAC infettiva geneticamente stabile per una varietà di virus RNA positivo filamento. ICE è un flavivirus zoonotici ³³ che si trasmette nella natura tra gli uccelli, maiali e altri host vertebrati da zanzare vettori. ^34,35 Nell'uomo, l'infezione può causare il ICE spesso fatale malattia neurologica grave encefalite giapponese (JE), ³⁶ che si verifica in Asia e parti del Pacifico occidentale, ^37,38 con un'incidenza annuale stimata di ~ 50,000-175,000 casi clinici. ^39,40 Il genoma di ICE è un ~ 11 kb, a singolo filamento, positivo-senso molecola di RNA ed è composto da un unico open reading frame (ORF) affiancato da due regioni non codificanti (NCR) al 5 'e 3' termina. ^41,42 L'ORF codifica una poliproteina che viene scisso dagli host e proteasi virali per generare 10 singole proteine, designato C, PRM E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, e NS5 nella N in direzione C-terminale. ^34,43,44 inoltre, una esotto forma di Xtended NS1 (NS1 ') si esprime con -1 frameshifting ribosomiale ai codoni 8-9 di NS2A. ^45,46 Di queste 11 proteine, le tre proteine ​​strutturali (C, PRM, ed E) sono essenziali per la formazione di malattie infettive virioni, ^47,48 e le restanti otto proteine ​​non strutturali (NS1 a NS5, e NS1 ') sono fondamentali per la replicazione virale RNA, assemblea ^49-51 particella, ^52-56 e innata immunità evasione. ^57-59 Sia il 5' e 3 'NCR contengono conservati sequenze primarie e strutture forma RNA secondari e / o terziari, ^60-62 che sono importanti per modulare la replicazione RNA virale. ^63,64

Questo protocollo descrive gli strumenti, i metodi e le strategie per la generazione di un full-length BAC infettiva di ICE SA ₁₄ -14-2. ²⁸ Questo clone BAC funzionale contiene una copia completa del cDNA dell'RNA genomico ICE, ⁶⁵ che è comprendeva da un promotore per la polimerasi SP6 RNA a montedel virale 5'-end e un sito di restrizione Xba I unica valle del 3'-end virale per la trascrizione in vitro di dilavamento. Questa tecnologia BAC è applicabile alla costruzione di un clone molecolare di cDNA completamente funzionale per una vasta gamma di virus a RNA positivo-strand.

Protocollo

Nota: la figura 1 illustra una strategia per la costruzione di un full-length infettiva ICE cDNA come BAC ²⁸ tabella 1 fornisce un elenco degli oligonucleotidi utilizzati in questo protocollo ^28..

1. Estrarre l'RNA virale da particelle JEV in Cell Culture Supernatant

1. Inizia con il mezzo di coltura cellulare contenente ICE SA ₁₄ -14-2, un live virus vaccinale JE che richiede livello di biosicurezza 2 contenimento.
   Nota: Il titolo virale è di circa 1-3 × 10 ⁶ unità formanti placca / ml.
2. Prendete la formazione biosicurezza necessaria per tutte le pratiche standard microbiologici, apparecchiature di sicurezza e strutture di laboratorio prima di lavorare con ICE SA ₁₄ -14-2.
3. Purificare RNA virale da un'aliquota del medium di coltura cellulare contenente il virus usando una soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato ⁶⁶ (Figura 1A).
   1. Anno Dominid 600 ml di reagente monofasica a 200 ml di supernatante di coltura in una provetta 1,7 ml. Omogeneizzare la miscela mano-agitando la provetta vigorosamente per 30 secondi e incubando per 5 minuti a temperatura ambiente.
   2. Aggiungere 160 ml di cloroformio al campione omogeneizzato. Mescolare accuratamente a mano, agitando la provetta vigorosamente per 15 secondi e lasciarla riposare per 2-3 minuti a temperatura ambiente.
   3. Centrifugare il lisato totale a 13.400 xg per 15 min a 4 ° C, che si traduce in una separazione delle due fasi liquide, cioè una fase organica inferiore e una fase acquosa superiore. Trasferire la fase acquosa superiore (inferiore a 200 microlitri) contenente l'RNA ad una nuova provetta.
   4. Precipitare il RNA aggiungendo 1 ml di 5 mg / ml di glicogeno e 400 ml di isopropanolo al 100% e incubando per 10 minuti a RT.
   5. Centrifugare la miscela a 13.400 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 1 ml di etanolo al 75% da polso-vortex 04:57tempi e centrifugazione a 13.400 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   6. Asciugare il pellet di RNA per 10 minuti e si dissolvono in 40 ml di dH ₂ O. Conservare il RNA estratto a -80 ° C fino al momento dell'uso.

2. Sintetizzare una serie di quattro sovrapposizione cDNA Fragments (da F1 a F4) che abbracciano l'intera Viral Genomic RNA trascrizione inversa (RT) -PCR

1. Eseguire 20 microlitri reazione RT con una aliquota di 10 microlitri di RNA virale purificato come modello e una forma modificata del virus della leucemia murina Moloney trascrittasi inversa. ⁶⁷
   1. Impostare una miscela di 13 ml contenente 10 ml di RNA purificato, 1 ml 10 mM dNTP mix, 1 ml 4 pmol / primer ml e 1 ml dH ₂ O. Utilizzare il primer specifico per frammento per ogni reazione RT: 1RT per la F1, 2RT per F2, 3RT per F3 e F4 per 4RT.
   2. Incubare la miscela a 65 ° C per 5 min, posto in ghiaccio per 1 min, e quindi rapida rotazione per raccogliere il contenti sul fondo della provetta.
   3. Aggiungere 4 ml 5 × tampone RT, 1 ml 0.1 M DTT, 1 inibitore RNase ml 40 U / ml, e 1 ml 200 U / ml trascrittasi inversa. Mescolare pipettando su e giù tre a cinque volte.
   4. Sia la reazione procede a 50 ° C per 1 ora, quindi calore inattivare il campione a 70 ° C per 15 min. Conservare il cDNA sintetizzato primo filamento a -20 ° C fino al momento dell'uso.
2. Eseguire 100 microlitri reazione PCR con una aliquota di 5 microlitri del inattivato al calore di reazione RT come modello e un alta fedeltà DNA polimerasi termostabile ⁶⁸ (Figura 1B).
   1. Impostare un 100 microlitri reazione PCR in ghiaccio, contenente 5 ml di reazione RT, 20 microlitri 5 × tampone PCR, 4 microlitri 10 mM miscela dNTP, 5 ml 10 micron di primer in avanti, 5 ml 10 micron primer reverse, 1 ml 2 U / DNA polimerasi ml e 60 ml dH ₂ O. Utilizzare la coppia di primer specifici per ogni frammento reactio PCRn: 1F + 1R per la F1 (2573 bp), 2F + 2R per F2 (4171 bp), 3F + 3R per F3 (3922 bp) e 4F + 4R per F4 (1798 bp).
   2. Mescolare delicatamente tre a cinque volte dita lanciando provetta e centrifugare brevemente per raccogliere il contenuto sul fondo.
   3. Iniziare con un ciclo termico denaturazione iniziale di 30 sec a 98 ° C, seguita da 25-30 cicli con il seguente profilo PCR: 10 sec a 98 ° C, 30 sec a 60 ° C, e 1-2 min (30 s / kb) a 72 ° C. Conservare i prodotti di PCR a 4 ° C fino al momento dell'analisi.
3. Eseguire un'aliquota 2-5 pl di ciascuna reazione di PCR su un gel di agarosio 0,8% contenente 0,5 mg / ml di etidio bromuro (EtBr) (Figura 2).
   ATTENZIONE: EtBr è un potente mutageno e richiede camici, occhiali di sicurezza e guanti da indossare e la massima attenzione da osservare durante l'uso, lo stoccaggio e lo smaltimento.

3. subclone Ognuno dei quattro cDNA Fragments (da F1 a F4) in un vettore BAC per la creazione PBAC / F1 a PBAC / F4 bTecniche y clonazione molecolare

1. Digest il vettore e inserire DNA con due opportuni enzimi di restrizione, come segue:
   1. Eseguire una digestione sequenziale di PBAC / PRRSV / FL (vettore), ³⁰ un derivato del plasmide pBeloBAC11 (7507 bp, GenBank numero di accesso U51113), con Pme io e non io in un volume totale di 60 microlitri (contenente ~ 500 DNA ng , 10 U dell'enzima, tampone di digestione 1x, e 1 × BSA) a 37 ° C per 12-15 ore, da cui si ricava il frammento vettoriale 15426 bp.
   2. Eseguire la digestione sequenziale di ciascuna delle quattro ampliconi cDNA (inserto) con Sma I e Not I in un volume totale di 60 microlitri (contenenti ~ 1 ug di DNA, 20 U dell'enzima, 1 × tampone di digestione, e 1 × BSA) a 25 ° C (Sma I) o 37 ° C (Not I) per 12-15 ore, che produce i seguenti frammenti di inserimento della dimensione desiderata: F1 (2559 bp), F2 (4157 bp), F3 (3908 bp), e F4 (1784 bp).
2. Purificare ildesiderato vettore ed inserire frammenti di DNA mediante estrazione gel.
   1. Separare i prodotti doppiamente digeriti su un basso punto di fusione gel di agarosio 1% punto contenente 0,5 mg / ml EtBr. Tagliare una banda del frammento di DNA desiderato con una quantità minima di agarosio (di solito ~ 200 microlitri) sotto luce ultravioletta a onda lunga.
   2. Aggiungere un volume uguale di tampone TEM (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl e ₂₎ alla asportato agarosio in una microprovetta 1,7 ml. Incubare il campione a 72 ° C per 10-15 minuti, con vortex ogni 2-3 minuti fino a quando l'agarosio si è completamente sciolto.
   3. Aggiungere un uguale volume di pre-riscaldato fenolo tampone saturo, vortex vigorosamente per 1 min, e centrifugare a 13.400 g per 10 minuti a temperatura ambiente.
      Nota: La miscela si separa in una fase organica inferiore e una fase acquosa superiore. Trasferire la fase acquosa superiore contenente il DNA di una nuova provetta.
   4. Aggiungere un uguale volume di cloroformio: alcool isoamilico (24: 1), vortex per 1 min, e centrifugare a 13,400 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire la fase acquosa superiore ad una nuova provetta.
   5. Aggiungere 0,5 ml di 10 ug tRNA di lievito / microlitro, 1/10 volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Mantenere la miscela in ghiaccio per 20 min.
   6. Centrifugare la miscela a 13.400 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70% da impulsi vortex tre a cinque volte e centrifugazione a 13.400 xg per 10 min.
   7. Far asciugare il pellet di DNA per 10 min e scioglierli in 20 ml di tampone TE (10 mM Tris-Cl e 1 mM EDTA [pH 7,6]).
3. Legare il vettore desiderato e inserire frammenti di DNA utilizzando DNA ligasi T4.
   1. Impostare una reazione legatura 20 microlitri contenente 50-100 ng del DNA vettoriale, un eccesso molare ~ 3 volte del DNA dell'inserto, 400 T4 DNA ligasi U, e 1 × tampone legatura. Incubare la reazione legatura a 16 ° C per 12-15 ore.
      Nota: Includere un contr negativoolo reazione, cioè, vector solo senza l'inserto, in parallelo.
   2. Eseguire quattro legature distinte, ciascuna adesione 15426 bp Pme I- Non ho frammento di PBAC / PRRSV / FL con il 2559 bp (F1), 4157-bp (per F2), 3908-bp (per F3), o 1784-bp (F4) Sma I-Not I frammento di uno dei quattro ampliconi cDNA, per generare subcloni PBAC / F1 a PBAC / F4.
4. Trasforma il DNA legatura in E. coli DH10B con il metodo scossa -Heat CaCl _2.
   1. Prendete aliquote di 100 ml di CaCl ₂ -treated cellule DH10B competenti ⁶⁹ conservati a -80 ° C e scongelare su ghiaccio.
      Nota: Utilizzare 100 ml di cellule per trasformazione.
   2. Aggiungere una aliquota di 10 ml di reazione legatura DNA per 100 ml di cellule scongelati in una provetta 1,7 ml, mescolare delicatamente toccando il tubo, e tenere in ghiaccio per 30 min.
   3. Shock termico la miscela DNA-cella per 45 secondi in un 42 ° C waBagno ter, posto in ghiaccio per 2 minuti, quindi aggiungere 900 ml di brodo LB pre-riscaldato a RT.
   4. Incubare le cellule calore scioccato a 35 ° C per 1 ora, con agitazione a 225-250 rpm.
   5. Stendere 50 a 200 aliquote microlitri delle cellule in coltura su piastre di agar LB contenenti 10 mg / ml di cloramfenicolo (CML). Tenere le piastre a temperatura ambiente, a destra rivolto verso l'alto, fino a quando sono asciutti.
   6. Ruotare le piastre capovolto e incubare a 35 ° C per 15 h.
5. Recuperare il DNA BAC clonato dalle cellule ospiti con un metodo di purificazione basata su colonne (Figura 1C).
   1. Scegli da sei a otto colonie batteriche dalle piastre di agar LB-Cml e inoculazione in 3 ml di brodo 2xYT contenenti 10 mg / ml Cml. Incubare le colture a 35 ° C per 10 ore con agitazione vigorosa (225-250 rpm).
   2. Isolare ricombinante BAC DNA 1-1,5 ml delle colture batteriche con colonne di rotazione, come indicato dal produttore. ⁷⁰ Eluire il DNA estratto (typicamente 100-200 ng) in 20 ml di tampone TE.
   3. Eseguire due analitiche digestioni dell'enzima di restrizione dei BAC isolati per ~ 6 ore in un volume totale di 10 microlitri, di identificare la presenza del vettore con una corretta inserto utilizzando gli stessi enzimi utilizzati per la clonazione (vedi protocollo 3.1), e l'altra per verificare l'integrità dei BAC clonati con un enzima appropriato (ad esempio, Bgl II, Nco I o Pst I), generando un frammento di restrizione unico modello.
   4. Propagare le BAC clonati correttamente inoculando 500 ml di colture batteriche positive (da protocollo 3.5.1) in 500 ml di 2xYT-Cml medio e coltivando l'inoculo per 6 ore a 35 ° C agitando a 225-250 rpm. Purificare il DNA BAC (tipicamente 10-20 ug) dalla cultura 500 ml utilizzando colonne di filtro, come raccomandato dal produttore. ⁷¹
      Nota: I primi quattro sottocloni BAC, ciascuna contenente un frammento di cDNA di ICE RNA genomico, può rivelarsi di avere sue o più mutazioni indesiderate (s) rispetto alla sequenza di consenso del genoma virale ⁴² (che serve come sequenza di riferimento). Qualsiasi tale mutazione deve essere corretto dalla società PCR mutagenesi sito-diretta prima dell'assemblaggio di un full-length cDNA ICE. ²⁷

4. Creare un full-length ICE cDNA con il 5 'SP6 promotore e il 3' run-off del sito

1. Fai tre modifiche genetiche (vedi sotto Protocolli 4.1.1-4.1.3) nei cDNA clonati per consentire la trascrizione in vitro run-off di RNA genoma di lunghezza con l'autentico 5 'e 3' estremità del genoma virale.
   1. Introdurre un promotore SP6 immediatamente a monte all'estremità 5 'del genoma virale mediante overlap extension PCR (Figura 1D, PBAC / F1 ^SP6).
      1. Amplifica due frammenti di DNA sovrapposti via il primo standard di PCR di PBAC / F1 con le due coppie di primer SP6F + SP6R (formato del prodotto, 173 bp) e F1F + F1R (prodotto sbadi, 676 bp), ciascuno in una reazione di 50 microlitri contenente 1 ml DNA stampo (~ 200 pg / ml), 10 microlitri 5 × tampone PCR, 2 ml 10 dNTPs mM, 2,5 microlitri ciascuno dei 10 micron avanti e reverse primer, 0.5 pl 2 U / mL DNA polimerasi, ⁶⁸ e 31,5 ml dH ₂ O. Eseguire la PCR utilizzando il seguente profilo bicicletta: 98 ° C per 30 sec, e 25 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 20 sec.
      2. Gel-purificare i due frammenti di DNA PCR-amplificato dopo aver eseguito ognuno dei due prodotti di PCR su un gel bassofondente punto di agarosio 1,5%, come descritto nel protocollo 3.2.
      3. Fondere le due frammenti di DNA gel purificato tramite la seconda fusione PCR utilizzando il primer esterno SP6F + F1R (formato del prodotto, 821 bp) in una reazione 100 microlitri compreso 1 ml ciascuno dei due frammenti di DNA purificati (~ 100 pg / ml), 20 microlitri 5 × tampone PCR, 4 pl 10 mM dNTP, 5 ml ciascuno dei 10 micron avanti e reverse primer, 1 ml2 polimerasi U / mL DNA, ⁶⁸ e 63 ml dH ₂ O. Utilizzare il seguente profilo termico ciclismo: 98 ° C per 30 sec, e 25 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 30 sec.
      4. Gel-purificare l'amplicone PCR fusa da un basso punto di fusione gel di agarosio 1% point, come descritto nel protocollo 3.2.
      5. Eseguire la procedura di clonazione in cinque fasi descritte nei protocolli 3,1-3,5 per legare il 760 bp Pac I- Bsi WI frammento di gel purificato fuso PCR amplicone con il 9532 bp Pac I- Bsi WI frammento di PBAC / F1 per generare PBAC / F1 ^SP6.
   2. Rimuovere il preesistente, interna sito Xba I al nucleotide 9131 con l'introduzione di una mutazione puntiforme silenzioso (A ⁹¹³⁴ → T) tramite estensione sovrapposizione PCR (Figura 1D, PBAC / F3 ^KO).
      1. Amplifica due frammenti di DNA sovrapposti per il primo standard di PCR di PBAC / F3 con il due coppie di primer x1f + X1R(formato del prodotto, 746 bp) e x2F + X2R (formato del prodotto, 316 bp) in una reazione di 50 microlitri nelle condizioni sperimentali descritte nel protocollo 4.1.1.1.
      2. Gel-purificare i due frammenti di DNA PCR-amplificate dopo la separazione elettroforetica su 1,5% gel a basso punto di fusione agarosio, come descritto nel protocollo 3.2.
      3. Fondere le due frammenti di DNA gel purificato tramite la seconda fusione PCR utilizzando i primers ultraperiferiche x1f + X2R (formato del prodotto, 1033 bp) in una reazione 100 microlitri nelle condizioni sperimentali descritte nel protocollo 4.1.1.3.
      4. Gel-purificare della PCR fuso da un basso punto di fusione gel di punto di agarosio 1%, come indicato nel protocollo 3.2.
      5. Eseguire la procedura di clonazione in cinque fasi descritte nei protocolli 3.1-3.5 per legare il 949 bp Avr II- Non ho frammento di gel purificato fuso PCR amplicone con il 16245-BP non I- Bsi WI e 2141-bp Bsi W I - frammenti Avr II di PBAC / F3 per produrre PBAC / F3 ^KO.
   3. Ingegnere una nuova Xba artificiale I sito deflusso a valle della fine del 3 'del genoma virale dalla società PCR mutagenesi sito-diretta (Figura 1D, PBAC / F4 ^RO).
      1. Generare un frammento di DNA mediante PCR di PBAC / F4 con primer ROF + ROR (formato del prodotto, 324 bp) in una reazione 100 ml contenenti 1 ml DNA stampo (~ 200 pg / mL), 20 microlitri 5 × tampone PCR, 4 ml 10 dNTPs mM, 5 ml ciascuno di 10 micron in avanti e indietro primer, 1 ml 2 U / ml DNA polimerasi, ⁶⁸ e 64 ml dH ₂ O. Eseguire la PCR utilizzando il seguente profilo bicicletta: 98 ° C per 30 sec, e 25 cicli di 98 ° C per 10 sec, 60 ° C per 30 sec e 72 ° C per 15 sec.
      2. Gel-purificare il frammento di DNA PCR-amplificato da un basso punto di fusione gel di punto di agarosio 1%, come indicato nel protocollo 3.2.
      3. Eseguire la procedura di clonazione in cinque fasi descritte nei protocolli 3,1-3,5 per legare il 283 bp Sfi I-Not Io frammento di gel purificato dell'amplicone PCR con il 16933 bp Sfi I- Non ho frammento di PBAC / F4 per creare PBAC / F4 ^RO.
2. Assemblare una serie di quattro modificato, cDNA sovrapposte in un unico full-length SA ₁₄ -14-2 BAC (PBAC / SA ₁₄ -14-2) unendo a tre siti di restrizione naturale (BSR GI, Bam HI, e Ava io ) in modo sequenziale utilizzando cinque fasi clonazione procedure descritte nei protocolli 3.1-3.5 (Figura 1E): F1 ^SP6 → F1 F2 ^SP6 (sostituendo BSR G I- Not I frammento PBAC / F1 ^SP6 con quella PBAC / F2) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO (sostituendo il Bam H I- Not I frammento PBAC / F1 F2 ^SP6 con quella PBAC / F3 ^KO) → F1 ^SP6 F2F3 ^KO F4 ^RO (sostituendo il Ava I-Not I frammento PBAC / F1 F2 ^SP6F3 ^KO con quella di PBAC / F4 ^RO).

5. Preparare una elevata purezza Maxi-prep del Full-length SA ₁₄ -14-2 BAC

1. Crescere una singola colonia di E. coli DH10B portando PBAC / SA ₁₄ -14-2 a 3 ml di brodo 2xYT contenente 10 mg / ml Cml per 10 ore a 35 ° C con agitazione a 225-250 giri al minuto, e poi scalare inoculando 500 ml di 10 ore coltura batterica in 500 ml di 2xYT-Cml medie e coltivando l'inoculo per 6 ore a 35 ° C con agitazione vigorosa.
2. Centrifugare la coltura batterica in due bottiglie da 250 ml a 3.107 xg per 15 min a 4 ° C. Risospendere ogni pellet in 30 ml di soluzione GTE (glucosio 50 mM, 25 mM Tris-Cl, e EDTA 10 mM [pH 8,0]), e quindi aggiungere 500 ml di 60 mg / ml di lisozima. Incubare le due sospensioni di cellule in ghiaccio per 10 minuti.
3. Aggiungere 60 ml di soluzione Lysis appena fatto (0,2 N NaOH e 1% SDS) a ciascuna sospensione cellulare, mescolare bene fino a non toccare, e tenere i lisatia temperatura ambiente per 10 min.
4. Aggiungere 45 ml di soluzione di neutralizzazione (100 ml, composto da 60 ml 5 M di acetato di potassio, 11,5 ml di acido acetico glaciale, e 28,5 ml di _dH 2 O) per ogni bottiglia, mescolare accuratamente invertendo le bottiglie, e incubare lisati neutralizzate sul ghiaccio per 10 min.
5. Centrifuga lisati neutralizzati a 18.566 × g per 20 minuti a 4 ° C. Trasferire il surnatante di entrambe le bottiglie in due nuove bottiglie da 250 ml; aggiungere 0,6 volume di 100% isopropanolo a ciascuno, e tenerli in ghiaccio per 20 min.
6. Spin down precipitati a 18.566 g per 20 minuti a 4 ° C. Sciogliere ogni pellet in 5 ml di tampone TE, combinarli in un tubo da 50 ml (10 ml in totale), e precipitare l'RNA aggiungendo un volume uguale di 5 M cloruro di litio. Incubare la miscela in ghiaccio per 10 min.
7. Centrifugare il precipitato di RNA a 14.636 xg per 20 min a 4 ° C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 250 ml con il precipitato DNA aggiungendo 2 volumi di 100% di isopropanolo.Incubare la miscela in ghiaccio per 20 min.
8. Spin down del precipitato DNA a 18.566 g per 20 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet di DNA in 9,5 ml di tampone TE (pH 7,6), e aggiungere 10 g di cloruro di cesio (CsCl) e 390 ml di 10 mg / ml EtBr.
9. Caricare la soluzione di DNA-CsCl-EtBr in un tubo di polipropilene 16 x 76 mm sigillabile utilizzando una siringa dotata di un ago 18 G. Spin il gradiente di CsCl sigillato in un'ultracentrifuga a 401.700 xg per 16 ore a 20 ° C (Figura 3).
10. Raccogliere una banda di DNA plasmidico BAC dal gradiente di CsCl utilizzando un ago da 18 G per creare una presa d'aria nella parte superiore del gradiente e una siringa da 20 G ago attrezzato per recuperare il DNA BAC dal lato del gradiente.
11. Aggiungere 2,5 volumi di dH ₂ O-butanolo saturo per il campione di DNA BAC EtBr-macchiato e mescolare nel vortex. Centrifugare la miscela a 13.400 xg per 1 min e Trasferire la fase acquosa inferiore per un nuovo 1,7 ml microtube. Ripetere questa procedura per sei volte.
12. Precipitare il DNA BAC EtBr-aggiungendo 1/10 volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo 100% al DNA BAC butanolo estratti e incubando per 10 min in ghiaccio. Centrifugare precipitato a 13.400 g per 10 min, lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70%, e ri-pellet che per centrifugazione.
13. Far asciugare il pellet di DNA per 10 minuti e si dissolvono in 200 ml di tampone TE (pH 7,6).
    Nota: La figura 4 mostra una panoramica del sistema di genetica inversa per ICE SA ₁₄ -14-2.

6. Trascrivere RNA sintetici in vitro da un full-length DNA ICE BAC linearizzato

1. Eseguire un grande enzimi di restrizione di PBAC / SA ₁₄ -14-2 con Xba I in un volume totale di 100 microlitri (contenente 3 mg DNA, 60 U dell'enzima, 1 × tampone di digestione, e 1 × BSA) a 37 ° C per 12-15 ore. Esaminare un'aliquota 3 ml del dreazione igestion su un gel di agarosio 0,8% contenente 0,5 mg / ml EtBr.
2. Incubare la reazione di digestione ulteriormente con 25 U di mung bean nucleasi (MBN) a 30 ° C per 2 ore (Figura 4A).
3. Portare il volume del campione della MBN trattati Xba I-digerito fino a 300 ml con dH ₂ O. Aggiungere un volume uguale di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (25: 24: 1) al campione diluito, vortex vigorosamente per 1 min, centrifugare a 13.400 g per 10 min, e poi trasferire la fase acquosa superiore ad un nuovo 1,7 ml provetta. Aggiungere un uguale volume di cloroformio e ripetere la procedura di estrazione.
4. Recupero fenolo / cloroformio estratto, BAC linearizzato per precipitazione in etanolo: Aggiungere 1/10 volume di 3 M acetato di sodio e 2,5 volumi di etanolo al 100%, e incubare in ghiaccio per 20 min. Centrifugare precipitato a 13.400 g per 10 min, lavare il pellet di DNA con 1 ml di etanolo al 70%, e poi girare ridurla ricentrifugazione.
5. Aria asciugare la pelle del DNAt per 10 minuti e scioglierlo in 30 ml di dH ₂ O. Esaminate un'aliquota 1 microlitri della BAC recuperato su un gel di agarosio 0,8% con 0,5 mg / ml EtBr (Figura 5A).
6. Eseguire una trascrizione run-off del DNA linearizzato BAC in un volume totale di 25 microlitri (contenenti ~ 200 ng DNA stampo, 0,8 mm berretto analogico ^[m 7 G (5 ') ppp (5') A], 1 rNTPs mM, 40 U RNasi inibitore, 20 U SP6 RNA polimerasi, ⁷² e 1 × tampone trascrizione) a 37 ° C per 1 ora (Figura 4B). Include 0,5 mM ^[3 H] UTP per RNA quantificazione sulla base di ^[3 H] UTP incorporazione, come monitorato mediante adsorbimento su carta DE-81 filtro. ⁶⁹
7. Eseguire un un'aliquota 1-2 microlitri della reazione di trascrizione ballottaggio su un gel di agarosio 0,6% contenente 0,5 mg / ml di EtBr (Figura 5B).

7. Determinare RNA Infettività e Virus Yield

1. Coltivare cellule BHK-21 a 150 millimetri culture piatti con una densità di 3 x 10 ⁶ cellule / piatto per 24 ore a 37 ° C con 5% di CO _2.
   Nota: Mantenere le cellule BHK-21 in alfa mezzo essenziale minimo integrato con 10% di siero fetale bovino, glutammina 2 mM, vitamine, e la penicillina / streptomicina.
2. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 ml di soluzione fredda A (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8,1 mm Na ₂ HPO _4, e 1,5 mm KH ₂ PO _4). Staccare le cellule dalle stoviglie mediante trattamento con 4 ml di tripsina-EDTA (0,25%), e alla loro raccolta per centrifugazione a 270 xg in una centrifuga desktop per 2 min.
3. Risospendere il pellet di cellule con 50 ml di soluzione fredda A in un tubo da 50 ml e centrifugare la sospensione cellulare a 270 xg per 2 minuti. Ripetere questa procedura di lavaggio per tre volte; Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet di cellule ad una densità di 2 x 10 ⁷ cellule / ml in Sol A.
4. Mescolare un'aliquota di 400 ml di sospensione cellulare con 2 μg di RNA sintetico in una cuvetta gap 2 mm, e prontamente elettroporazione la miscela con un elettroporatore in condizioni ottimali di elettroporazione: lunghezza 980 V, 99 msec impulsi, e 5 impulsi (Figura 4C).
   Nota: utilizzare il ^{3 H-marcato} RNA sintetizzato nel protocollo 6.5 direttamente per l'elettroporazione, senza ulteriore purificazione.
5. Lasciare le cellule elettroporate a temperatura ambiente per 10 minuti e trasferire in una provetta 1,7 ml contenente 600 ml di terreno di coltura completo.
6. Preparare una diluizione seriale di 10 volte delle cellule elettroporate in 1 ml di mezzo di coltura completo e piastra un'aliquota di 100 microlitri di ogni diluizione sui monostrati di unelectroporated cellule BHK-21 (5 x 10 ⁵⁾ in una piastra da 6 pozzetti.
7. Dopo 4-6 ore di incubazione, sovrapporre le cellule con 0,5% di agarosio in mezzo essenziale minimo contenente siero bovino fetale 10%. Incubare le piastre per 4 giorni a 37 ° C con 5% di CO _2.
8. Visualizza il centro infettivas (placche) di fissaggio con il 7% di formaldeide e colorazione con 1% di cristallo viola a 5% di etanolo ²⁷ (figura 6A).
   1. Opzionale: Esaminate le cellule RNA-elettroporate a 18-20 ore dopo la trasfezione per ICE espressione della proteina mediante saggi di immunofluorescenza ^27,73 (Figura 6B), e raccogliere il surnatante dalle cellule RNA-elettroporate a 22 e 40 ore dopo la trasfezione per il virus titolazione saggi placca ^27,63 (Figura 6C).

Risultati

Per tutti i virus RNA positivi filamento, l'affidabilità e l'efficienza di un sistema di genetica inversa dipendono dalla stabilità genetica di un full-length cDNA clonato, la cui sequenza è equivalente alla sequenza consensus di RNA genomico virale. ²⁷ La Figura 1 mostra un cinque strategia passo per la costruzione di un cDNA infettiva intera lunghezza come per BAC ICE SA ₁₄ -14-2 ^28: Fase 1, purificazione dell'RNA virale dal supernatante di coltura cellulare di ICE-infettate cellule BHK-21 (Figura 1A); Fase 2, la sintesi di quattro ampliconi cDNA sovrapposti (da F1 a F4) che coprono l'intero genoma virale (Figura 1B); Fase 3, subcloning di ciascuno dei quattro frammenti di cDNA contigui in un vettore BAC, creando PBAC / F1 a PBAC / F4 (Figura 1C); Fase 4, la modifica dei cDNA clonati per la trascrizione in vitro run-off con SP6 RNA polimerasi, cioè, mettendo un SP6sequenza promotrice immediatamente a monte del virale 5'-end (PBAC / F1 ^SP6), eliminando un preesistente sito interno Xba I al nucleotide 9131 introducendo una mutazione puntiforme silenzioso, ⁹¹³⁴ A → T (PBAC / F3 ^KO), ed inserendo un sito immediatamente a valle del virale 3'-end (PBAC / F4 ^RO) (Figura 1D) nuovo Xba artificiale I run-off; e Step 5, il montaggio di un full-length SA ₁₄ -14-2 cDNA BAC, PBAC / SA ₁₄ -14-2 (Figura 1E). La tabella 1 elenca i oligonucleotidi utilizzati in questa procedura di clonazione. ²⁸

Per la costruzione di un funzionale ICE cDNA, il primo passo importante è la sintesi dei quattro frammenti di cDNA sovrapposizioni con RNA virale purificato come modello per RT-PCR. La Figura 2 fornisce un risultato rappresentativo per i quattro prodotti RT-PCR che erano elettroforesi su 0,8%gel di agarosio. Questo gel dimostra chiaramente che un integrale ICE cDNA viene amplificato in quattro frammenti di cDNA sovrapposti. Occasionalmente, reazioni di RT-PCR potrebbero produrre uno o più prodotti specifici per il virus o aspecifiche che sono per lo più piccolo del prodotto atteso, a causa della ricottura non specifico di primer durante cDNA sintesi / amplificazione. D'altra parte, poca o nessuna prevede prodotto RT-PCR sarebbe amplificato a causa della contaminazione RNasi accidentale durante l'isolamento dell'RNA virale o improprio prestazioni RT-PCR.

Il successivo passaggio chiave è la clonazione e la modifica di un integrale parzialmente autonome o ICE cDNA in BAC, che è una procedura relativamente semplice che utilizza tecniche di DNA ricombinante standard. ⁶⁹ Figura 3 presenta un risultato rappresentativo per la purificazione del clone BAC contenenti un full-length cDNA di ICE SA ₁₄ -14-2 da bande in un gradiente di CsCl-EtBr.In questo esperimento, dopo centrifugazione per 16 ore a 401.700 xg, due bande distinte, vale a dire, la E. coli DNA cromosomico sopra e la BAC DNA plasmidico superavvolto seguito, sono visibili al centro del tubo sotto la luce ultravioletta a onda lunga. Un volume minimo (~ 400 microlitri) della fascia BAC DNA inferiore è stato accuratamente recuperato colpendo un foro con una siringa sul lato del tubo. Successivamente, l'EtBr è stato estratto dal DNA BAC per estrazione butanolo, e il BAC DNA libero-EtBr stata concentrata mediante precipitazione in etanolo.

Il passo finale è la determinazione della infettività specifica degli RNA trascritti in vitro di sintesi dal full-length SA ₁₄ -14-2 BAC (PBAC / SA ₁₄ -14-2) dopo RNA trasfezione in cellule permissive (Figura 4). Questa fase prevede tre fasi successive: Fase 1, linearizzazione del full-length SA ₁₄ -14-2 cDNA al 3 '-end del genoma virale (Figura 4A); Fase 2, la produzione di RNA di sintesi del cDNA linearizzata di run-off di trascrizione (Figura 4B); e Step 3, salvataggio dei virus ricombinanti in BHK-21 cellule transfettate con RNA sintetici (Figura 4C). Sperimentalmente, due cloni indipendenti di PBAC / SA ₁₄ -14-2 stati linearizzati con Xba I digestione e trattati con MBN per rimuovere le quattro-base 5 sbalzo 'generato dalla digestione Xba I. I BAC linearizzate sono stati puliti da estrazione con fenolo-cloroformio, seguita da precipitazione in etanolo. La linearizzazione delle due BAC purificati è stata dimostrata su un gel di agarosio 0,8% (Figura 5A). L'estrazione con fenolo-cloroformio deve essere fatto con attenzione per assicurare che le BAC linearizzate sono privi di RNasi. Ciascuno dei due BAC linearizzate servito come modello per la trascrizione cDNA scolo usando SP6 RNA polimerasi in presenza di m ⁷ G (5 ') PPP (5') Un analogo cap. L'integrità degli RNA sintetici stato dimostrato eseguendo aliquote delle due miscele di reazione trascrizione su un gel di agarosio 0,6%, con un kb scala di riferimento 1 DNA (Figura 5B). In questo semplice test, la principale fascia RNA prominente sempre migrato solo al di sotto dei 3 kb riferimento banda DNA e sembrava essere tagliente. Tuttavia, degradato RNA avrebbe un aspetto spalmato sullo stesso gel.

Un test centro infettiva è il gold standard per la determinazione del infettività specifica dei RNA sintetici. Questo test è stato fatto da electroporating cellule BHK-21 con campioni di RNA, la semina uguali aliquote delle 10 volte le cellule elettroporate serialmente diluiti in 6 pozzetti contenenti naïve cellule BHK-21 (3 x 10 ⁵ cellule / pozzetto), e la sovrapposizione agarosio sui monostrati cellulari. Dopo incubazione per 4 giorni, cellule sopravvissute sono state fissate con formaldeide e colorate con cristalvioletto soluzione di quantificare il numero di centri infettive (placche), che corrisponde al numero di molecole di RNA infettivi trasportati nelle cellule (Figura 6A). Poiché il cDNA utilizzato per la trascrizione in vitro è stato dimostrato di essere non-infettiva, ²⁷ una aliquota della miscela di reazione di trascrizione è stata utilizzata direttamente per elettroporazione. Elettroporazione è il metodo preferito per l'RNA trasfezione; In alternativa, RNA possono essere trasfettate con altri metodi usando liposomi DEAE-destrano e cationici. RNA elettroporazione è molto efficace, ma "arco" dell'impulso elettrico si verifica raramente, se sono presenti nella reazione elettroporazione o se la cuvetta elettroporazione viene riutilizzato sali. L'espressione di proteine ​​virali in cellule transfettate RNA è stato esaminato mediante saggi di immunofluorescenza usando un antisiero di coniglio anti-NS1 (Figura 6B). La produzione di particelle virali accumulati nei surnatanti di cellule transfettate RNA eraalyzed mediante saggi placca (Figura 6C). I risultati di questi esperimenti mostrano chiaramente che gli RNA sintetici cDNA derivati ​​sono infettive in permissivi cellule BHK-21, generando un alto titolo di virus ricombinanti.

Oligonucleotide	Sequenza di un (5 'a 3')	Posizione b	Polarità
1RT	TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT	2578-2603	Antisenso
1F	aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT	1-22	Senso
1R	attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT	2532-2553	Antisenso
2RT	TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA	5975-6000	FormicaIo percepisco
2F	aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT	1800-1821	Senso
2R	attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC	5929-5950	Antisenso
3RT	ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT	9426-9451	Antisenso
3F	aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT	5500-5521	Senso
3R	attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT	9380-9401	Antisenso
4RT	AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA	10.952-10.977	Antisenso
4F	aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA	9200-9221	Senso
4R	attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC	10.956-10.977	Antisenso
SP6F	cataccccgcgtattcccac ta		Senso
SP6R	ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa	1-14	Antisenso
F1F	aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG	1-17	Senso
F1R	TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA	638-662	Antisenso
X1f	CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG	8403-8427	Senso
X1R	AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC	9120-9148	Antisenso
X2F	GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT	9120-9148	Senso
X2R	cacgtggacgagggcatgcc tgcag		Antisenso
ROF	CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC	10.670-10.694	Senso
ROR	agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC	10.954-10.977	Antisenso
una sequenza JEV sono riportati in lettere maiuscole, e le sequenze BAC sono indicati in lettere minuscole. posizione b Nucleotide si riferisce alla sequenza completa del genoma di ICE SA 14 -14-2 (numero di accesso Genbank JN604986).

Tabella 1: oligonucleotidi utilizzati per la sintesi del DNA, amplificazione PCR, e BAC mutagenesi.

Figura 1.0; strategia per la costruzione di un full-length cDNA di ICE SA ₁₄ -14-2 come BAC (A) Isolamento di RNA virale da particelle ICE.. Viene mostrato un diagramma schematico del RNA genomico di ICE SA ₁₄ -14-2. (B) Sintesi di quattro frammenti di cDNA sovrapposti (F1 a F4) che copre l'intero genoma virale. (C) Subclonaggio di quattro frammenti di cDNA sovrapposti in un vettore BAC, creando PBAC / F1 a PBAC / F4. (D) Modifica dei cDNA clonati per la trascrizione ballottaggio in vitro. PBAC / F1 ^SP6 è un derivato di PBAC / F1 che contiene la sequenza del promotore SP6 monte del virale 5'-end. PBAC / F3 ^KO è un derivato di PBAC / F3 che contiene una mutazione puntiforme silente (A ⁹¹³⁴ → T, asterisco). PBAC / F4 ^RO è un derivato del PBAC / F4 che contiene un artificiale Xba I sito deflusso a valle del virale 3'-end. (E strong>) Assemblaggio di un full-length SA ₁₄ -14-2 BAC (PBAC / SA ₁₄ -14-2). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Sintesi di quattro frammenti di cDNA sovrapposti (da F1 a F4) che attraversa il full-length RNA genomico di ICE SA ₁₄ -14-2. I quattro prodotti RT-PCR vengono valutati mediante elettroforesi in gel di agarosio 0,8%. M, 1 kb scala del DNA. Le dimensioni attese dei quattro frammenti di cDNA sono indicati nella parte inferiore dell'immagine gel. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Purificazione della BAC contenente un full-length cDNA di ICE SA ₁₄ -14-2. Il plasmide BAC è isolato dal E. coli DH10B con il metodo di lisi SDS-alcalino e ulteriormente purificato mediante bande in un gradiente di CsCl-EtBr. Presentato è un esempio del gradiente CsCl-EtBr utilizzando un tubo di polipropilene sigillato 16 × 76 millimetri. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Sommario del recupero di virus infettivi da un integrale ICE SA ₁₄ -14-2 cDNA assemblato in un BAC. (A) linearizzazione del cDNA. Il full-length ICE BAC è tagliato conXba I e trattati con MBN. (B) Sintesi dei trascritti di RNA. Il cDNA linearizzato viene trascritto da RNA polimerasi SP6 in presenza di m ⁷ G (5 ') ppp (5') Un analogo cap. (C) Recupero del sintetico JEVs. In vitro RNA trascritti sono trasfettati in cellule BHK-21 per l'elettroporazione, che genera un alto titolo di virus sintetico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Sintesi degli RNA mediante trascrizione in vitro utilizzando un full-length BAC ICE come modello cDNA. (A) Generazione del full-length linearizzato ICE BAC, PBAC / SA ₁₄ -14-2. Due cloni indipendenti di PBAC/ SA ₁₄ -14-2 (Cl.1 e Cl.2) linearizzate mediante digestione con Xba I e successivo trattamento con MBN. I BAC linearizzate sono esaminati mediante elettroforesi su gel di agarosio 0,8%. (B) La produzione di RNA sintetici per trascrizione run-off. Ciascuno dei due BAC linearizzate viene utilizzato come modello per SP6 RNA polimerasi di trascrizione run-off. Aliquote delle due reazioni di trascrizione vengono eseguiti su un gel di agarosio 0,6%. M, 1 kb scala del DNA. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. infettività specifica dei RNA sintetici trascritti da un BAC ICE full-length e il recupero del virus sintetico. BHK-21 cellule sono mock-elettroporate (Mock) o elettroporate con i trascritti di RNA derivati ​​from ciascuno dei due cloni indipendenti del full-length ICE BAC (Cl.1 e Cl.2). (A) RNA infettività. Le cellule sono sovrapposti con agarosio e colorate con cristallo viola a 4 giorni dopo la trasfezione. RNA infettività è determinata mediante saggi centro infettivi per stimare la quantità di RNA infettivi elettroporate nelle cellule (pannello di sinistra). Inoltre, le immagini rappresentative di centri infettive sono riportati (pannello di destra). (B) L'espressione proteica. Le cellule sono coltivate in 4 pozzetti camera di diapositive. Espressione di proteine ​​virali in cellule elettroporate-RNA a 20 ore dopo la trasfezione (HPT) viene analizzata mediante saggi di immunofluorescenza usando un antisiero di coniglio anti-NS1 primaria e IgG anti-coniglio di capra secondario Cy3-coniugato (rosso). I nuclei sono contrastate con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (blu). Le immagini di immunofluorescenza sono sovrapposte le immagini di contrasto interferenza corrispondente differenziali. (C) resa virus. Le cellule vengono coltivate in 150 piatti mm cultura. La produzione di virioni infettivi accumulati nei sovranatanti di coltura di cellule RNA-elettroporate a 22 e 40 HPT viene esaminato attraverso saggi placca. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo attuale è stata utilizzata con successo per generare full-length cDNA cloni infettive, per due diversi ceppi (CNU / LP2 ²⁷ e SA ₁₄ -14-2 ²⁸⁾ di ICE, un flavivirus cui cDNA funzionale ha dimostrato di essere di per sé difficile da costruire e propagare causa della tossicità cellula ospite e l'instabilità genetica del cDNA clonato ^8,74-76 Questo protocollo prevede tre componenti principali:. prime, massimizzando la sintesi / amplificazione del cDNA una copia fedele del RNA virale con alta fedeltà transcrittasi inversa / DNA polimerasi; secondo, la clonazione il PRM-E codificanti regione virale contenente sequenze tossiche (dati non pubblicati) ^74,77,78 in un bassissimo copia numero vettore BAC del cDNA iniziale subcloning ai full-length fasi di montaggio cDNA finali; e in terzo luogo, utilizzando un tasso alcolemico di clonazione vettore che può ospitare un DNA estraneo con una dimensione media di 120-350 kb, ^19-21 che tollera apparentemente più grande inse DNArts di quanto non facciano altri vettori di clonazione. Questo approccio clonazione sarà generalmente applicabile a molti altri virus a RNA positivi filamento, in particolare quelli con una grande genoma RNA del ~ 10 a 32 kb. Generazione di un clone di cDNA infettiva è un passo fondamentale nello sviluppo di un sistema di genetica inversa per virus a RNA, soprattutto per i virus a RNA positivi a filo, perché il suo genoma agisce come mRNA virale che si traduce in proteine ​​dai ribosomi della cellula ospite. Così, la replicazione virale può essere iniziato con l'introduzione di un genoma lunghezza RNA molecola di cDNA derivato in una cellula ospite suscettibile. La disponibilità di un clone di infettiva ICE cDNA, quando combinato con la tecnologia del DNA ricombinante, ha aumentato la nostra comprensione dei vari aspetti del ciclo di vita virale a livello molecolare, come ad esempio l'espressione genica ^73,79 e replicazione del genoma. ^63,64 Inoltre, un full-length ICE clone di cDNA ha dimostrato di essere uno strumento prezioso per lo sviluppo di vaccini antivirali ²⁸ e vettori di trasferimento genico. ^80,81

Come per tutti i virus RNA positivi fili, ci sono più passaggi critici nella costruzione di un cDNA funzionale affidabile per ICE da cui RNA altamente infettivi possono essere sintetizzate in vitro. Idealmente, la sequenza di RNA sintetici trascritti da un clone della intera lunghezza cDNA dovrebbe essere identica a quella del RNA genomico virale, in particolare i 5'- e 3'-terminale sequenze che sono necessari per l'inizio della replicazione virale RNA . ^60-62 Nel protocollo corrente, l'autentica e 5'-3'-estremità erano assicurati mettendo la sequenza del promotore SP6 monte della prima adenina nucleotide del genoma virale e il posizionamento di un sito di restrizione Xba I artificiale unica valle dell'ultimo timina nucleotide del genoma virale, rispettivamente. Capped RNA sintetici con l'autentico 5 'e 3' estremità sono state prodotte dalla trascrizione run-off di un Xba I-linearizzato e MBN trattati cDNA template usando SP6 RNA polimerasi innescato con il m ⁷ G (5 ') ppp (5') Un analogo cap. Questo protocollo può essere modificato in vari modi. Per la trascrizione in vitro, un'altra RNA batteriofago polimerasi (ad esempio, T3 o T7) può essere utilizzato in combinazione con la sua sequenza promotore ben definita. ²⁷ Come sito scolo, un sito di restrizione differente può essere utilizzata se non è presente in il genoma virale e se l'RNA sintetico del cDNA linearizzato termina con l'autentico 3 '. L'importanza della sequenza nucleotidica 3'-end è stata dimostrata da una diminuzione ~ 10 volte in RNA infettività quando un RNA sintetico contiene tre o quattro nucleotidi virus non correlato alla sua 'estremità 3. ²⁷ In una reazione di trascrizione in vitro, sia la m ⁷ G (5 ') ppp (5') A e m ⁷ G (5 ') ppp (5') G tappo analogico può essere utilizzato altrettanto bene, anche se queste ultime posti un estraneo G nucleotide supplementare monte del virale 5 '-end, ma cheInoltre non altera l'infettività o la replica di RNA sintetico. ^{27 Inoltre,} la rimozione del cDNA da RNA trascritti di DNasi I digestione non è necessaria per le prove RNA infettività, poiché il modello cDNA sé non è infettiva. ²⁷

La tecnologia BAC è stata ora applicata alla costruzione di cloni di cDNA infettivi per una manciata di virus a RNA positivo filamento, vale a dire, due JEVs, CNU / LP2 ²⁷ e SA ₁₄ -14-2 ²⁸ (dimensione del genoma, ~ 11 kb); due virus dengue, BR / ⁹⁰ 26 e NGC ²⁹ (~ 11 kb); il virus della diarrea bovina virale, SD1 (~ 12 kb); ²⁵ due classici virus della febbre suina, C e Paderborn (~ 12 kb); ²⁴ il virus della malattia di confine, Gifhorn (~ 12 Kb); ²⁴ il suino virus sindrome riproduttiva e respiratoria , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); ³⁰ il virus gastroenterite trasmissibile, PUR46-MAD (~ 29 kb); ¹⁶ il felino virus della peritonite infettiva,DF-2 (~ 29 kb), ³² la grave sindrome acuta da coronavirus respiratorio, Urbani (~ 30 ^kb), 9 Medio Oriente sindrome respiratoria coronavirus, EMC / 2012 (~ 30 kb), ¹⁷ e coronavirus umano, OC43 (~ 31 kb) ³¹ Il principale vantaggio di utilizzare BAC per la costruzione di cDNA è l'elevata stabilità genetica delle grandi, 1 o 2 copie plasmidi BAC.; tuttavia, la natura intrinseca del suo numero estremamente basso di copia è anche un grande svantaggio, a causa delle basse rese di DNA BAC e la conseguente riduzione della purezza del DNA BAC rispetto ospitare DNA cromosomico. Nel protocollo attuale, il rendimento del DNA BAC è massimizzata da una crescente E. coli DH10B trasformato con il contagioso BAC PBAC / SA ₁₄ -14-2 in un mezzo ricco di sostanze nutritive, 2xYT. Nonostante questo sforzo, il rendimento medio è solo ~ 15 mg di DNA BAC da 500 ml di brodo 2xYT. Inoltre, la purezza del DNA BAC è meglio realizzato utilizzando CsCl-EtBr centrifugazione in gradiente di densità per la purificazione, Piuttosto che la colonna basata isolamento plasmide comunemente usato. Tuttavia, è importante tenere presente che la E. BAC trasformati coli non deve invadere perché potrebbe mettere a repentaglio la stabilità genetica del cDNA clonato, e una maggiore crescita non necessariamente portare a maggiori rendimenti o superiore purezza BAC DNA.

Il protocollo qui descritto è ottimizzato, efficiente, e il metodo semplificato per la costruzione e la propagazione di un full-length geneticamente stabile clone cDNA infettiva come BAC per ICE, una procedura volta pensò praticamente impossibile. Questa stessa strategia di clonazione può anche essere applicato a molti altri virus a RNA positivo filamento. In generale, cloni di cDNA infettivi ci permettono di introdurre una varietà di mutazioni (ad esempio, delezioni, inserzioni e mutazioni puntiformi) in un RNA genoma virale per studiare le loro funzioni biologiche nella replicazione virale e la patogenesi. Questo sistema di genetica inversa basata cDNA-consente di sviluppare e TESt vaccino e candidati terapeutici mirati un fattore di virulenza (s) di un particolare virus RNA positivo filamento di interesse. Inoltre, questa tecnologia cDNA infettiva può essere utilizzato anche come un vettore virale, capace di esprimere un gene estraneo (s) di interesse per molte applicazioni nella ricerca biomedica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1. Clonazione molecolare
2xYT Brodo	Sigma-Aldrich	Y2377
[3H]UTP	PerkinElmer	NET380250UC	Radioattivo
50 ml Tubo	Thermo Scientific (Nalgene)	3114-0050
250 ml Beckman	Coulter	356011
Agarosio	Lonza	50004
Agarosio (basso punto di fusione)	Life Technologies (Invitrogen)	16520-100
AvaI	New England BioLabs	R0152S
AvrII	New England BioLabs	R0174S
BamHI	New England BioLabs	R0136S
BsiWI	New England BioLabs	R0553S
BsrGI	Nuovo Inghilterra BioLabs	R0575S
Butanolo	Fisher Scientific	A399-1
Cloruro di cesio	Fisher Scientific	BP1595-1
Cloramfenicolo	Sigma-Aldrich	C0378
Cloroformio	Sigma-Aldrich	C2432	Carcinogeno
DE-81 Carta da filtro	GE Healthcare Life Sciences	3658-023
Miscela dNTP	Life Technologies (Invitrogen)	18427-088
E. coli DH10B	Life Technologies (Invitrogen)	18297-010
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134
Etanolo	Sigma-Aldrich	E7023
Bromuro di etidio	Sigma-Aldrich	E7637	tossica e altamente mutagena
(kit plasmidico Maxiprep)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-26
Acido acetico glaciale	Sigma-Aldrich	A6283	Glucosio irritante
	Sigma-Aldrich	G5400
Glicogeno	Roche	10901393001
DNA polimerasi ad alta fedeltà	New England BioLabs	M0491S
Alcool isoamilico	Sigma-Aldrich	I9392	Isopropanolo infiammabile
	Amresco	0918	Brodo LB infiammabile
	Life Technologies (Invitrogen)	12795-027
Cloruro di litio	Sigma-Aldrich	L9650
Lisozima	Amresco	0663
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	M8266
M-MLV Trascrittasi inversa	Life Technologies (Invitrogen)	18080-044
Fagiolo mung nucleasi	New England BioLabs	M0250S
ago (18G, 20G)	BD	305196, 305175	a rischio biologico (rifiuti taglienti)
NotI	New England BioLabs	R0189S
Oligonucleotide	Integrated DNA Technologies	Sintesi
PacI	New England BioLabs	R0547S
pBeloBAC11	New England BioLabs	ER2420S (E4154S)
Fenolo (saturo di tampone)	Life Technologies (Invitrogen)	15513-039	Tossico e altamente corrosivo
Fenolo:Cloroformio:Alcool isoamilico Life	Technologies (Invitrogen)	15593-031	Fenolo tossico e altamente corrosivo
:Guanidina Isotiocianato	Life Technologies (Ambion)	10296-010	Pme I Tossico, corrosivo e irritante
Pme I	New England BioLabs	R0560S
Acetato di potassio	Amresco	0698
Inibitore della RNasi	Life Technologies (Invitrogen)	10777-019
rNTP Set	GE Healthcare Life Sciences	27-2025-01
Tubo in polipropilene sigillabile (16 &volte; 76 mm)& nbsp;	Beckman Coulter	342413
SfiI	New England BioLabs	R0123S
Sma I	New England BioLabs	R0141S
Acetato di sodio	Sigma-Aldrich	S2889
Sodio dodecil solfato	Amresco	0227
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S5881
SP6 RNA polimerasi	New England BioLabs	M0207S
Spin Column (kit di minipreparazione plasmidica)	Life Technologies (Invitrogen)	K2100-11
Siringa	HSW NORM-JECT	4200.000V0
T4 DNA ligasi	New England BioLabs	M0202S
Tris	Amresco	0826
tRNA (lievito)	Life Technologies (Invitrogen)	15401-011
XbaI	New England BioLabs	R0145S
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
2. Colture cellulari
Alpha Minimal Essential Medium Life	Technologies (Gibco)	12561-049
Provetta conica (50 mL)	VWR	21008-242
Crystal Violet	Piatto di coltura Sigma-Aldrich	C0775
(150 mm)	TPP	93150
Cuvetta (gap 2 mm)	Apparecchio Harvard	450125
Siero fetale bovino	Life Technologies (Gibco)	16000-044
Formaldeide	Sigma-Aldrich	F1635	Glutammina tossica e cancerogena
Life	Technologies (Gibco)	25030-081
Minimal Essential Medium	Life Technologies (Gibco)	61100-061
Penicillina/streptomicina	Life Technologies (Gibco)	15070-063
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	P3911
Fosfato di potassio monobasico	Sigma-Aldrich	P9791
Piastra a sei pozzetti	TPP	92006
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S3014
Fosfato di sodio bibasico	Sigma-Aldrich	S3264
Tripsina-EDTA (0,25%)	Life Technologies ( Gibco)	25200-056
Vitamine	Sigma-Aldrich	M6895
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
3. AttrezzaturaSistema di
elettroforesi su gel di agarosio	Mupid	MPDEXU-01
CO2 Incubatore	Thermo Scientific	Heracell 150i
Centrifuga da tavolo	Thermo Scientific	ST16R
Elettroporatore	Harvard Apparecchio	ECM 830
Lampade ultraviolette a onde lunghe (palmare)	UVP	UVGL-58
Centrifuga da tavolo	Coltro Beckman 368826
Termociclatore	Tecnologie di vita (Applied Biosystems)	GeneAmp PCR System 9700
Vortexer	Scientific Industries	G-560
Bagno d'acqua	Jeio Tech	WB-10E