Questo protocollo descrive un metodo di ibridazione in situ rapido e semplificato ideale per il cervello con prefisso di paraformaldeide, riducendo così la necessità di passaggi complessi prolungati durante l'utilizzo di tessuti freschi congelati. Il metodo è convalidato utilizzando l'identificazione del gene del recettore della serotonina 5-HT2A htr2a nei ratti.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
'3,4-Metilendiossimetamfetamina (MDMA; ecstasy) può causare cambiamenti region-specifici nell'espressione dell'mRNA serotoninergico a causa della sindrome acuta da serotonina (5-idrossitriptamina; 5-HT). Questa ipotesi può essere testata utilizzando l'ibridazione in situ per rilevare il gene del recettore della serotonina 5-HT2A htr2a. In passato, tali procedure, che utilizzavano la ribosonda radioattiva, erano difficili a causa del complicato flusso di lavoro che richiede diversi giorni per essere eseguito e della difficoltà aggiuntiva che la tecnica richiedeva l'uso di tessuti freschi congelati mantenuti in un ambiente privo di RNasi. Recentemente, lo sviluppo di sonde corte di oligonucleotidi ha semplificato le procedure di ibridazione in situ e ha permesso l'uso di sezioni cerebrali con prefisso di paraformaldeide, che sono più ampiamente disponibili nei laboratori. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato utilizzando sonde oligonucleotidiche non radioattive sui tessuti cerebrali prefissati. Le sonde di ibridazione utilizzate per questo studio includono dapB (un gene batterico che codifica per la diidrodipicolinato reduttasi), ppiB (un gene di housekeeping che codifica per la peptidilprolil isomerasi B) e htr2a (un gene della serotonina che codifica per i recettori 5-HT2A). Questo metodo è relativamente semplice, economico, riproducibile e richiede meno di due giorni per essere completato.
Introduzione
La sindrome da serotonina (5-idrossitriptamina; 5-HT) è un disturbo neurologico acuto causato da farmaci che promuovono la 5-HT come gli antidepressivi1, mentre si verifica anche in situazioni di uso di MDMA per scopi ricreativi2. I meccanismi molecolari responsabili degli sbalzi d'umore, dei deficit di apprendimento e di memoria che si verificano in associazione con la sindrome acuta non sono ben compresi3,4. L'ibridazione in situ è un potente strumento di ricerca che consente l'individuazione e la quantificazione di specifici mRNA espressi potenzialmente a livello di singola cellula. Il modo convenzionale per eseguire l'ibridazione in situ consiste nell'utilizzare una ribosonda marcata con radioattività che ibrida specificamente il gene di interesse. Tuttavia, uno dei principali svantaggi è che il metodo richiede fasi complicate e dispendiose in termini di tempo per la preparazione della sonda e l'ibridazione, nonché l'accesso a tessuti freschi congelati mantenuti in un ambiente privo di RNasi5,6.
Le sonde oligonucleotidiche sono state recentemente sviluppate per ibridare frammenti di RNA più corti di quelli richiesti per le ribosonde7. Inoltre, le sonde producono un basso segnale di fondo senza sacrificare la specificità8. Questa tecnologia di sonda di nuova concezione può essere utilizzata nell'ibridazione in situ su tessuti cerebrali con prefisso di paraformaldeide comunemente disponibili nei laboratori di immunocitochimica.
Qui, descriviamo un protocollo per l'ibridazione in situ utilizzando sonde oligonucleotidiche su cervello di ratto con prefisso di paraformaldeide e confrontiamo i risultati con quelli osservati in un cervello fresco congelato5,6. Questo protocollo viene utilizzato per testare l'ipotesi che l'abuso di sostanze MDMA causi cambiamenti nel gene del recettore 5-HT2A htr2a mRNA nel cervello. Abbiamo iniziato la procedura con il trattamento con MDMA seguito dalla perfusione tissutale di paraformaldeide dell'animale, dall'ibridazione in situ della sonda thr2a e dall'analisi dei dati. Si noti che il dapB (il gene batterico che codifica per la diidrodipicolinato reduttasi) è usato come controllo negativo e il ppiB (gene di housekeeping che codifica per la peptidilprolil isomerasi B) come controllo positivo.
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Protocollo
Procedure per l'uso degli animali descritti di seguito sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) Ross University School di Medicina Veterinaria e Florida Atlantic University. Anche se sono necessarie tecniche sterili e guanti, l'ambiente privo di RNasi non è necessario durante l'utilizzo di questo protocollo.
1. Preparazione
- Preparazione dei tessuti e sezionamento
- Assegnare i ratti a caso in tre gruppi: fresco / salina (SAL; 0,9% NaCl), il prefisso / SAL e prefissati / 3,4-metilene (MDMA; vedi dettagli nella tabella 1).
- Somministrare tre dosi di 1 ml / kg SAL e 10 mg / kg per via intraperitoneale MDMA, rispettivamente, ai gruppi SAL e MDMA a intervalli 2 ore. Lasciare gli animali a sopravvivere il trattamento per 6 giorni.
- Il giorno 7, somministrare 100 mg / kg di ketamina in combinazione di 5 mg / kg per via intraperitoneale xilazina ai ratti per una anestesia profonda (cioè, perdita di lampeggio corneale e tail pizzico riflessi).
- Per il gruppo fresco / SAL, decapitate rapidamente ratti e rimuovere il cervello per il test del cervello fresco (vedi dettagli nel riferimento 5).
- Per i gruppi / MDMA prefissati / SAL e prefissati, effettuare un taglio lungo lo sterno circa 10 -12 cm e quindi esporre l'estremità dello sterno.
- Tenere l'estremità dello sterno con una pinza emostatica e tagliare il diaframma lateralmente da entrambi i lati con forbici affilate e poi tagliare verso l'alto attraverso le costole e paralleli ai polmoni.
- Con una mano, tenere la punta ventrale del cuore con piccole pinze. Con l'altra mano, perforare il ventricolo sinistro con una G siringa 18 (notare il lato dell'adattatore dell'ago è collegato con un tubo flessibile di silicio a forma di Y per SAL e paraformaldeide contenitori ghiacciate e pompe peristaltiche, vedere il riferimento 9).
- Accendere la pompa SAL al livello medio della portata (~ 5 ml / min) e forare l'atrio destro con la pinza per consentire la fuoriuscita di ritorno circlamento. Mantenere SAL perfusione per 30 min.
- Accendere la pompa paraformaldeide al livello medio e consentire il ghiacciata 4% paraformaldeide per defluire in all'animale per 30 min.
- Rimuovere strumento perfusione e decapitare il animali. Fare un postero tagliare la linea mediana del cranio, e poi sbattere il cranio per esporre la cavità del cranio 10.
- Rimuovere il cervello con una spatola dalla cavità cranio e posizionare il cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 25 ml di 4% paraformaldeide. Mantenere il cervello all'interno del tubo-paraformaldeide contenente 4 ºC frigorifero per 24 ore.
- Spostare il cervello in una provetta da centrifuga da 50 ml contenente 25 ml di soluzione di saccarosio al 30% a 4 ° C per 3 giorni. Infine, conservare il cervello in sacchetti di plastica a -80 ° C fino all'uso.
- Montare il cervello su un mandrino con i media embedding e congelare i media incorporamento contenenti cervello in un criostato ad una temperatura di -26 ° C. Tagliare il congelato frescon cervello in 20 sezioni micron e il cervello paraformaldeide-preceduti in sezioni di 10 micron. Trasferire la sezione di un vetrino da microscopio RT toccando la slitta alla sezione.
- Asciugare a temperatura ambiente per 4 ore. Conservare i vetrini sezione in un sacchetto stretto sigillato a -80 ° C fino all'uso.
- Disidratazione
- Prendere diapositive dal -80 ° C freezer e assegnare sezioni in una delle tre prove: HT2A, ppiB (controllo positivo) o dapB (controllo negativo); marchio e le sezioni di etichette con una penna a sfera (non usare una matita). Immergere i vetrini in 100% di alcol a temperatura ambiente per 5 minuti. Asciugare i vetrini per 5 minuti in una cappa aspirante.
- Pretrattamento
- Pipettare 20 ml di pretrattamento-1 (reagente inattivazione della fosfatasi alcalina), alle sezioni su vetrini. Porre i vetrini su una cremagliera in un vassoio di umidità (notare che il vassoio è coperta con un coperchio per mantenere una elevata umidità per prevenire evaporazione dal solutio reazionen).
- Agitare delicatamente il vassoio di umidità su un agitatore orizzontale a bassa velocità per 10 min. Lavare i vetrini due volte con acqua bidistillata (DDH 2 O) per 2 min. Immergere il vetrino in un becher da 200 ml contenente 150 ml del pretrattamento-2 reagente (rottura dei legami trasversali indotte da fissazione paraformaldeide). Lessare i vetrini per un totale di 5 min a 100 ° C (ripristino indotta dal calore della struttura dell'RNA 11).
- Lavare i vetrini due volte con DDH 2 O per 2 min. Porre i vetrini in 100% di alcol per 5 min. Essiccare i vetrini per 5 min in cappa. Utilizzare una penna idrofobico per disegnare un cerchio attorno all'area selezionata nella sezione di tessuto (ad esempio, strutture non corticali, tra talamo e ipotalamo come delineate nella figura 2).
- Pipettare 10 ml di pretrattamento-3 reagente (aumenti di penetrazione della sonda) per ogni area selezionata, e coprire il vassoio di umidità con il coperchio. Posizionare il vassoio nel forno di ibridazioneequipaggiato con lo shaker orizzontale e impostare la temperatura del forno a 40 ° C; scuotere delicatamente il cassetto per 30 min. Lavare i vetrini due volte con DDH 2 O per 2 min.
2. Ibridazione e Amplificazione
- Pipettare 10 ml di HTR2A, ppiB e dapB reagenti sonda, rispettivamente, sulle aree selezionate. Coprire il vassoio di umidità con il coperchio per evitare l'evaporazione del reagente. Agitare delicatamente l'agitatore orizzontale impostato a bassa velocità. Incubare i vetrini a 40 ° C in forno per 2 ore.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di amplificazione-1 reattivo su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 30 min.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-2 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 15 minuti.
- Lavare i vetrini due volte with un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di amplificazione-3 reattivo su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 30 min.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-4 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a 40 ° C per 15 minuti.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-5 per ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 30 min.
- Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min. Pipettare 10 ml di reagente di amplificazione-6 su ogni area selezionata, agitare e incubare i vetrini a temperatura ambiente per 15 min. Lavare i vetrini due volte con un tampone di lavaggio per 2 min.
3. Rilevamento segnale
- Pipettare 10 ml di reagente Red a ciascuna area selezionata (Si noti che il reagente è una miscela di rosso-B e Red-A con un rapporto 1:60 e deve essere utilizzato imediatamente). Posizionare il vetrino nel cassetto umidità sulla agitatore orizzontale a temperatura ambiente e agitare delicatamente a bassa velocità per 10 min.
- Lavare i vetrini due volte con (DDH 2 O) per 10 min. Essiccare i vetrini a 60 ° C in forno per 15 min. Porre i vetrini in xilene sotto la cappa per 5 min. Dispensare 20 ml di mezzo di montaggio a base di xilene, su ogni area selezionata e coprire con un coprioggetto.
4. Acquisizione Immagine
- Prendere microfotografie digitali delle aree selezionate (ad esempio, ipotalamo, le figure 1 e 3) con un ingrandimento di 4 × 20 × e lenti dell'obiettivo. Salvare il file di immagine.
Analisi Particle 5. Immagine
- Trascinare e rilasciare il file immagine nella finestra di ImageJ principale. Vai alla barra dei menu e selezionare 'Immagine', successiva selezionare 'Tipo' dal menu a discesa, quindi selezionare '8-bit'.
- Seleziona 'Regola', quindi selezionare 'Threshold 'per aprire la finestra di dialogo. Regolare il valore barra inferiore della finestra di dialogo in modo che il fondo indesiderato viene rimosso. Vai alla barra dei menu e selezionare 'Analizza', quindi selezionare 'Analizza Particelle' per aprire una seconda finestra di dialogo.
- Impostare la dimensione delle particelle a 10, prossimo selezionare 'Mostra delinea' e selezionare 'Mostra risultati "e" scatole Riassumere'. Infine, fare clic su 'OK' per visualizzare i dati delle particelle nelle finestre di dialogo.
6. Foglio di calcolo
- Inserire i dati nel foglio Excel e la media dei numeri di particelle nel gruppo SAL come linea di base. Calcolare il livello percentuale di ogni sezione e fare un grafico di conseguenza (Figura 4).
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Risultati
Usando le sonde oligonucleotidi RNA (<25 nt), ibridazione può essere rilevato come punti rossi nelle cellule dell'ipotalamo preparate dal cervello paraformaldeide-prefissato e freschi congelati. Le molecole di mRNA HTR2A sono presenti in alcune cellule (indicati dalle frecce solidi), ma non altri (frecce aperti). Abbiamo osservato che non vi è alcuna differenza tra la paraformaldeide-prefissato e tessuti freschi congelati (Figura 1). Un ibridazione successo può essere valutato per primo ...
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Discussione
Una delle principali preoccupazioni del test di ibridazione in situ è quella di scegliere le tecniche appropriate utilizzate per la conservazione dell'RNA a causa degli enzimi RNasi. È noto che questi enzimi sono ampiamente presenti nelle cellule e nell'ambiente, il che può influenzare i risultati. Tuttavia, l'attività enzimatica può essere rapidamente distinta posizionando il tessuto nella soluzione di ghiaccio secco/alcol5,12. Sebbene la conservazione rapida sia fondamentale per l'ibridazione utiliz...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dalla concessione NIH (R15DA029863), la concessione Florida Atlantic University di ricerca triennale (M30014) e la Scuola di Medicina Veterinaria assegno di ricerca Ross University. Vorremmo ringraziare il National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) per la fornitura di (±) 3,4-metilene (± MDMA) per questo lavoro.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RNAscope Negative Control Probe-DapB | Diagnostica cellulare avanzata, INC | 310098 | |
| RNAscope Pretreat 4 | Diagnostica cellulare avanzata, Kit | 320046 | |
| RNAscope 2.0 HD - Rosso | Diagnostica cellulare avanzata, INC | 310036 | |
| Sonda RNAscope - Rn-Ppib | Diagnostica cellulare avanzata, INC | 313921 | |
| Rat Htr2a | Diagnostica cellulare avanzata, INC | 300031 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850 | |
| Agitatore orizzontale | VWR | 88032-088 | |
| Forno di ibridazione | Thermo Fisher Scientific | 222000 | |
| Vetrino per microscopio Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Penna idrofobica | Vector | H-4000 | |
| Microscopio | Olympus | Provis AX70 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
