Articolo metodologico

Rapido In Situ Ibridazione utilizzando oligonucleotidi sonde su Paraformaldeide prefissa cervello di ratti con Sindrome serotoninergica

DOI:

10.3791/53165

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23 settembre 2015

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1Ross University School of Veterinary Medicine, 2Charles E. Schmidt College of Medicine, Florida Atlantic University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un metodo di ibridazione in situ rapido e semplificato ideale per il cervello con prefisso di paraformaldeide, riducendo così la necessità di passaggi complessi prolungati durante l'utilizzo di tessuti freschi congelati. Il metodo è convalidato utilizzando l'identificazione del gene del recettore della serotonina 5-HT2A htr2a nei ratti.

Abstract

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'3,4-Metilendiossimetamfetamina (MDMA; ecstasy) può causare cambiamenti region-specifici nell'espressione dell'mRNA serotoninergico a causa della sindrome acuta da serotonina (5-idrossitriptamina; 5-HT). Questa ipotesi può essere testata utilizzando l'ibridazione in situ per rilevare il gene del recettore della serotonina 5-HT2A htr2a. In passato, tali procedure, che utilizzavano la ribosonda radioattiva, erano difficili a causa del complicato flusso di lavoro che richiede diversi giorni per essere eseguito e della difficoltà aggiuntiva che la tecnica richiedeva l'uso di tessuti freschi congelati mantenuti in un ambiente privo di RNasi. Recentemente, lo sviluppo di sonde corte di oligonucleotidi ha semplificato le procedure di ibridazione in situ e ha permesso l'uso di sezioni cerebrali con prefisso di paraformaldeide, che sono più ampiamente disponibili nei laboratori. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato utilizzando sonde oligonucleotidiche non radioattive sui tessuti cerebrali prefissati. Le sonde di ibridazione utilizzate per questo studio includono dapB (un gene batterico che codifica per la diidrodipicolinato reduttasi), ppiB (un gene di housekeeping che codifica per la peptidilprolil isomerasi B) e htr2a (un gene della serotonina che codifica per i recettori 5-HT2A). Questo metodo è relativamente semplice, economico, riproducibile e richiede meno di due giorni per essere completato.

Introduzione

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La sindrome da serotonina (5-idrossitriptamina; 5-HT) è un disturbo neurologico acuto causato da farmaci che promuovono la 5-HT come gli antidepressivi1, mentre si verifica anche in situazioni di uso di MDMA per scopi ricreativi2. I meccanismi molecolari responsabili degli sbalzi d'umore, dei deficit di apprendimento e di memoria che si verificano in associazione con la sindrome acuta non sono ben compresi3,4. L'ibridazione in situ è un potente strumento di ricerca che consente l'individuazione e la quantificazione di specifici mRNA espressi potenzialmente a livello di singola cellula. Il modo convenzionale per eseguire l'ibr....

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Protocollo

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Procedure per l'uso degli animali descritti di seguito sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) Ross University School di Medicina Veterinaria e Florida Atlantic University. Anche se sono necessarie tecniche sterili e guanti, l'ambiente privo di RNasi non è necessario durante l'utilizzo di questo protocollo.

1. Preparazione

  1. Preparazione dei tessuti e sezionamento
    1. Assegnare i ratti a caso in tre gruppi: fresco / salina (SAL; 0,9% NaCl), il prefisso / SAL e prefissati / 3,4-metilene (MDMA; vedi dettagli nella tabella 1).
    2. Somministrare tre do....

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Risultati

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Usando le sonde oligonucleotidi RNA (<25 nt), ibridazione può essere rilevato come punti rossi nelle cellule dell'ipotalamo preparate dal cervello paraformaldeide-prefissato e freschi congelati. Le molecole di mRNA HTR2A sono presenti in alcune cellule (indicati dalle frecce solidi), ma non altri (frecce aperti). Abbiamo osservato che non vi è alcuna differenza tra la paraformaldeide-prefissato e tessuti freschi congelati (Figura 1). Un ibridazione successo può essere valutato per primo occh.......

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Discussione

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Una delle principali preoccupazioni del test di ibridazione in situ è quella di scegliere le tecniche appropriate utilizzate per la conservazione dell'RNA a causa degli enzimi RNasi. È noto che questi enzimi sono ampiamente presenti nelle cellule e nell'ambiente, il che può influenzare i risultati. Tuttavia, l'attività enzimatica può essere rapidamente distinta posizionando il tessuto nella soluzione di ghiaccio secco/alcol5,12. Sebbene la conservazione rapida sia fondamentale per l'ibridazione utiliz.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dalla concessione NIH (R15DA029863), la concessione Florida Atlantic University di ricerca triennale (M30014) e la Scuola di Medicina Veterinaria assegno di ricerca Ross University. Vorremmo ringraziare il National Institute on Drug Abuse (Rockville, MD) per la fornitura di (±) 3,4-metilene (± MDMA) per questo lavoro.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
RNAscope Negative Control Probe-DapBDiagnostica cellulare avanzata, INC310098
RNAscope Pretreat 4Diagnostica cellulare avanzata, Kit320046
RNAscope 2.0 HD - RossoDiagnostica cellulare avanzata, INC310036
Sonda RNAscope - Rn-PpibDiagnostica cellulare avanzata, INC313921
Rat Htr2aDiagnostica cellulare avanzata, INC300031
CryostatLeicaCM 1850
Agitatore orizzontaleVWR88032-088
Forno di ibridazioneThermo Fisher Scientific222000
Vetrino per microscopio Superfrost PlusFisher Scientific12-550-15
Penna idrofobicaVectorH-4000
MicroscopioOlympusProvis AX70
di reagenti INC

Riferimenti

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  1. Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine. Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).
  2. Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M.

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Ristampe e permessi

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Cervello fissato in paraformaldeideespressione del gene HTR2Areagenti di pretrattamentofasi di amplificazionerilevazione con Fast Redanalisi con Image Jquantificazione dell RNA

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