Svelare entropico velocità di accelerazione indotta da solventi Dynamics a membrana Enzimi

Sommario

Canali per il trasporto di molecole d'acqua in enzimi influenzano sito solvatazione attiva e catalisi. Qui vi presentiamo un protocollo per la progettazione di questi motivi catalitici aggiuntivi sulla base di modelli al computer in silico e sperimentazione. Ciò permetterà di migliorare la nostra comprensione della influenza delle dinamiche del solvente sulla catalisi enzimatica.

Abstract

La catalisi enzimatica si è evoluta in un ambiente acquoso. L'influenza della dinamica dei solventi sulla catalisi è, tuttavia, attualmente poco conosciuta e solitamente trascurata. Lo studio della dinamica dell'acqua negli enzimi e delle conseguenze termodinamiche associate è molto complesso e ha coinvolto simulazioni al computer, esperimenti di risonanza magnetica nucleare (NMR) e calorimetria. I tunnel d'acqua che collegano il sito attivo con il solvente circostante sono fondamentali per lo spostamento e la dinamica del solvente. Il protocollo qui contenuto consente l'ingegnerizzazione di questi motivi per il trasporto dell'acqua, che influisce sulla specificità, l'attività e la termodinamica. Fornendo un quadro biofisico fondato sulla teoria e sugli esperimenti, il metodo qui presentato può essere utilizzato da ricercatori senza precedenti competenze nella modellazione al computer o nella chimica biofisica. Il metodo farà progredire la nostra comprensione della catalisi enzimatica a livello molecolare misurando i cambiamenti entalpici ed entropici associati alla catalisi da varianti enzimatiche con tunnel d'acqua ostruiti. Il protocollo può essere utilizzato per lo studio di enzimi legati alla membrana e di altri sistemi complessi. Ciò migliorerà la nostra comprensione dell'importanza della riorganizzazione dei solventi nella catalisi e fornirà nuove strategie catalitiche nella progettazione e nell'ingegneria delle proteine.

Introduzione

L'acqua costituisce una pietra miliare per la chimica della vita ^1. Modelli acqua e solvatazione di siti attivi enzimatici influenzano sia l'entalpia e l'entropia di legame ^1,2 e catalisi ³ in un modo altamente complesso si estende oltre l'effetto idrofobico ^2,3 ligando. NMR ^4, calorimetria ² e modellistica molecolare di proteine ​​solvatate sono stati utilizzati per far luce sul ruolo delle molecole d'acqua esplicite nel fornire una forza trainante per ligando associazione ^5-8, la specificità e l'attività ^2,9,10. Qui presentiamo una metodologia unica per la valutazione sperimentale dell'impatto termodinamico di spostamento solvente su catalisi enzimatica (Figura 1). La nostra strategia combinata si basa sull'utilizzo di simulazioni al computer di concerto con l'ingegneria enzimatica e analisi termodinamica (Figura 1). Questo permette di far luce ulteriore sull'impatto delle dinamiche del solvente su catalisi, che attualmente è poco conosciuta.

Stabilizzare interazioni entalpici, forniti da legami idrogeno-mediata acqua in enzimi solvatato siti attivi, possono essere compensati con sanzioni entropiche ^1. Tali costi entropiche sono associati con la diminuzione dei gradi di libertà visualizzati da molecole di acqua confinate entro cavità proteiche, rispetto all'acqua in bulk ^5. Il rilascio di molecole d'acqua ordinato può quindi fornire un volano entropica per associazione ligando ¹ e catalisi ^3. Un aspetto fondamentale della dinamica solvente è lo spostamento delle molecole d'acqua tra l'interno delle proteine ​​e del solvente esterni ^4. I cambiamenti di accompagnamento in energia di attivazione, entalpia e l'entropia ¹¹ sono state comprese a livello molecolare. Ostruendo tunnel singoli responsabili del trasporto di acqua in enzimi, l'importanza delle dinamiche del solvente e il suo contributo alla attivazioneenergia può essere valutata (Figura 1). Inoltre, effettuando esperimenti cinetici one-pot a diverse temperature, i relativi parametri termodinamici di attivazione di diversi substrati possono essere estratti da un numero ridotto di esperimenti (figura 1, a destra). Il nostro metodo interdisciplinare è validato per di membrana complessi enzimi triterpene ciclasi che generano terpeni policiclici di grande importanza per la vita ^12. Il protocollo consente il recupero di elevate quantità di proteine ​​di membrana (10-20 mg / L) utilizzando una centrifuga standard.

Sebbene enzimi evoluti in acqua, il ruolo del solvente nel promuovere la catalisi è generalmente trascurato. Oltre alla dinamica delle proteine ^​​13,14 che forma pre-organizzato siti attivi con complementarità elettrostatica per lo stato di transizione ^15, dinamica dell'acqua potrebbero essere di grande importanza per la catalisi enzimatica efficiente. Forgiando diverse tecniche interdisciplinari, il nostroobiettivo è quello di facilitare lo altamente complesso studio delle dinamiche d'acqua e termodinamica. Rendere questi strumenti più accessibili alla comunità scientifica porterà allo sviluppo di nuove strategie in ingegneria enzima e progettazione di proteine ​​per le attività alterati e specificità.

Protocollo

Modellazione 1. In Silico Computer

1. Scarica una struttura PDB della proteina di interesse da parte della banca dati di proteine ​​(PPB). Preparare la struttura, rimuovendo subunità in eccesso e quindi aggiungendo mancanti atomi di idrogeno e solvente esplicito utilizzando la "neutralizzazione delle cellule e p K _{una previsione"} esperimento di YASARA ^16. Per membrana legato ciclasi triterpenici, adeguate dimensioni della scatola acqua sono 91x67x77 Å. Regolare lo stato protonazione degli amminoacidi cataliticamente attivi manualmente.
   Nota: se necessario, un analogo substrato nel file PDB può essere modificato per un vero e proprio supporto utilizzando "Modifica | Swap | Atom" comando.
2. Ridurre al minimo la struttura per il comando "Energia minimizzazione" utilizzando il campo suite di forza AMBER ^17. Utilizzare l'approccio a rete particella Ewald (PME) ¹⁸ per tener conto a lungo raggio interazioni elettrostatiche. Impostare il limite per van der Waals secondoa impostazioni standard.
   Nota: Il comando "Energia minimizzazione" elimina lo stress conformazionale da una breve ripida minimizzazione discesa, quindi una ricottura simulata (timestep 2 FSEC, velocità atomo ridimensionato da 0,9 ogni ¹⁰ ° passo) viene eseguito fino a raggiungere la convergenza (cioè, il miglioramento di energia da meno di 0.012 kcal / mol per atomo durante 200 gradini).

2. Modello di attivo del sito Solvatazione e accesso dell'acqua

1. Dopo la ricottura simulata, eseguire un 20 dinamica molecolare NSEC (MD) traiettoria e generare almeno 10 immagini dalla "File | Simulazione Istantanea | Salva con nome" comando seguito da "Simulazione On". Eseguire le simulazioni su un computer standard con condizioni al contorno periodiche sotto l'insieme canonico. Mantenere la temperatura a 298 K utilizza un termostato Berendsen.
2. Preparare le istantanee ottenuti da 2.1 cancellando tutte le molecole d'acqua ed eventuali ligandi / substrati utilizzando il4; Modifica | Elimina | Residue "comando Superpose ogni snapshot individualmente sull'originale PDB-struttura per la". Superpose | comando Oggetto "per garantire che tutte le strutture condividono la stessa posizione spaziale Salva ogni istantanea preparata in questo modo come un nuovo progetto preliminare di bilancio. -file (utilizzando il "File | Save as | PDB" di comando).
   Nota: per modellisti esperti: uno script per automatizzare questo processo in base al modello di cui al Codice supplementare File 1.
3. Utilizzare le istantanee preparate (PDB) da 2.2 che sono stati allineati in 3D-spazio come input per il speleologo software 3.0 ^19. Per l'analisi di un numero limitato di istantanee, eseguire Caver su un computer standard. Utilizzare un raggio di 0,7 Å sonda ¹⁹ per assicurare il rilevamento di gallerie che sono specifici per il trasporto di molecole d'acqua.
4. Visualizzare i tunnel generati da speleologo 3.0 in un software di grafica molecolare. Per una facile visualizzazione di gallerie, utilizzare la macro mostrato in integrativa Codice File 2.

3. In Silico Enzyme Engineering di modificare i modelli di acqua e dinamiche d'acqua

1. Identificare le gallerie più alto ordinati secondo l'intestazione "ID" elencato nel file di output "summary.txt" generato dal software speleologo 3.0.
2. Identificare gli aminoacidi che rivestono i tunnel più alta classifica (3.1) e che mostra una piccola catena laterale che punta verso l'interno del canale mediante ispezione visiva (utilizzando il modello ottenuto dal 2,4). Identificare sostituzioni di singoli aminoacidi che bloccano il tunnel da un aumento sterico utilizzando il comando "Scambia Residue". Verificare che il tunnel è ostruito da ispezione visiva, e quindi ripetendo i passi 1,2-3,1 del protocollo.

4. L'espressione di geni mutati

1. Introdurre le mutazioni nel gene wild-type da Mutagenesi PCR usando primer non sovrapposti ^20.
2. Aggiungere DNA plasmide contenente il gene di interesse a tubos con cellule competenti di un ceppo adatto clonazione e incubare in ghiaccio per 30 min. Eseguire una trasformazione shock termico per 45 secondi in un bagno d'acqua con la temperatura impostata a 42 ° C. Aggiungere 500 pl di una ricca mezzo fresco (2YT, 16 g / L di triptone, estratto di lievito 10 g / L, 5 g / L di NaCl) e incubare a 37 ° C, 200 rpm per 45 min. Effettuare una selezione placcando le cellule trasformate su piastre di agar integrati con antibiotici appropriati.
3. Dopo aver verificato la sequenza di DNA del gene mutato, trasformare il DNA plasmidico in un ceppo espressione utilizzando scossa di calore come descritto sopra. Per l'espressione di membrana legati ciclasi triterpenici, utilizzare BL21 (DE3).
4. Avviare un 5 ml O cultura / N a 37 ° C del ceppo espressione 2YT-media integrato con antibiotici appropriati.
5. Inoculare un dibattimento in pallone sconcertato 2 L, contenente 300 ml 2YT-media integrato con antibiotici appropriati, ad una OD finale di 0,05-,09 (misurata a 600 nm). Dopo l'induzione con un diametro esterno di 0,6-0.8 e l'espressione della proteina, congelare il pellet di cellule e conservare a -80 ° C.
   1. Per di membrana ciclasi triterpenici in un vettore pD861, indurre con 0,5 a 2 mM ramnosio e 4 ore di espressione a 37 ° C per ottenere alte rese di proteine ^​​21.

5. membrana Estrazione con centrifuga normale e purificazione delle proteine

1. Preparare i seguenti buffer: buffer di risospensione (100 potassio fosfato mM, pH 7,5 addizionato di inibitori della proteasi compresse), tampone detergente (1% (v / v) Triton X-100, potassio fosfato 50 mM, pH 7,5) e tampone di reazione (0,2 % Triton X-100, 50 mM potassio fosfato, pH 7.5).
   1. Per ciclasi squalene-hopene o altri enzimi legati alla membrana con pH ottimale inferiore, sostituire il fosfato di potassio nel buffer risospensione con citrato. Per tali enzimi utilizzare i seguenti buffer: buffer di detersivo (1% Triton X-100, Citrato 60 mM, pH 6,0) e tampone di reazione (citrato 0,2% Triton X-100, 60 mM, pH 6,0).
      Nota: se un His-tag viene utilizzato per la purificazione, integrare il buffer di risospensione con imidazolo mm 20 (concentrazione finale).
2. Pesare un pellet di cellule congelate in un bicchiere di vetro. Risospendere le cellule in tampone risospensione utilizzando un omogeneizzatore ad una concentrazione finale di 0,3 g cellule / ml. Lisare le cellule risospese di ultrasuoni con un'ampiezza di 80% e un impulso di 1 sec acceso e 1 sec spento. Utilizzare tre cicli ripetuti di 50 sec ciascuno.
3. Aggiungere tampone detersivo una concentrazione finale di 0,2% (v / v) di detersivo. Equilibrare da end-over-end miscelazione a 4 ° C per 1 ora. Recupero della frazione proteina di membrana salvando surnatante dopo una singola fase di centrifugazione a 39.000 xg per 50 min a 4 ° C.
   Nota: Se si utilizza His-tag purificazione, aggiungere circa 1,5 ml di Ni-NTA agarosio cellule / g e incubare per 1 ora.
4. Eseguire una prima purificazionepasso da uno scambio ionico o purificazione ²¹ His-tag. Supplemento le equilibrazione e eluizione buffer con 0,2% Triton X-100. Concentrare la proteina purificata cinque volte utilizzando filtro centrifugo Unità con un cut-off di 10 kDa.
   Nota: La dimensione del Triton X-100 micelle risultati in una concentrazione di detersivo ad una concentrazione finale di circa 1%.
5. Finalizzare la purificazione da una filtrazione su gel lucidatura passo con la proteina concentrata e una matrice compatibile con una serie di frazionamento per le proteine ​​globulari di 2 × 10 ⁴ × 10 -8 ^6. Utilizzare il tampone di reazione come tampone di corsa. Misurare la quantità di proteina purificata utilizzando il kit Ultra Bradford secondo il protocollo del produttore.

6. Cinetica

1. Fare un fresco 5 soluzione madre mM di substrato in tampone di reazione. Ottenere un'emulsione omogenea da ultrasuoni al 30% di ampiezza per 2-5 min.
2. Equilibrare un thermomixeralla temperatura di reazione desiderata. Verificare la temperatura all'interno di una fiala di vetro contenente l'acqua da un termometro esterno.
3. Per cinetiche singolo substrato, diluire il substrato emulsionato in almeno cinque fiale di vetro alla stessa concentrazione finale del substrato.
   1. Per uno-pot relativa cinetica con più substrati, preparare almeno cinque fiale di vetro identiche mescolando tutti i supporti in ogni fiala. Per triterpeni idrofobiche, usare concentrazioni di substrato finale nel range di 10-200 micron.
4. Preincubare le fiale di vetro nel thermomixer per 10 min. Avviare la reazione aggiungendo l'enzima. Un volume di reazione totale di 1 ml è adatto. Utilizzare una velocità di agitazione di almeno 1.200 giri al minuto.
5. Fermare le reazioni in diversi momenti con l'aggiunta di 500 microlitri etilacetato spillo con 100 micron decanolo come standard di integrazione.

7. Estrazione e analisi termodinamica

1. Estrarre le miscele di reazione divortex e agitazione manuale, le fiale di vetro vigorosamente per 1 min. Centrifugare i flaconi di vetro a 9.600 xg in una centrifuga da tavolo per 10 minuti a RT. Trasferire lo strato superiore (fase organica) ad un tubo vuoto. Aggiungere un ulteriore 500 ml di estrazione con solventi per le provette di reazione e ripetere la procedura di estrazione.
2. Essiccare le miscele di reazione estratti con Na ₂ SO _4. Vortex per 5 secondi e lasciare che i tubi riposare per 10 minuti. Eseguire una fase di centrifugazione finale a 9.600 xg per 1 min a temperatura ambiente usando una centrifuga da tavolo. Trasferire i campioni estratti per gascromatografia (GC) fiale.
3. Ripetere i passaggi sotto 6,1-7,2 per ciascuna variante enzima di interessi, utilizzando almeno quattro diversi concentrazione iniziale del substrato (per cinetiche singolo substrato) e quattro diverse temperature (sia per singolo substrato e la cinetica della concorrenza).
4. Eseguire GC-analisi come descritto precedentemente ^3. Utilizzare una colonna non polare per l'analisi di hydrophobic prodotti pentaciclici. Impostare la temperatura iniziale del forno a 120 ° C e utilizzare un gradiente di temperatura di 5 ° C / min, a seconda dei prodotti e la colonna.
5. Integra le aree dei picchi del prodotto (s) e trasformare aree dei picchi prodotto nei corrispondenti concentrazioni del prodotto utilizzando l'area dello standard di integrazione (corrispondente a 100 mM). Tracciare la concentrazione di ciascun prodotto ([P]) in funzione del tempo di reazione (t). Eseguire la regressione lineare dei punti di dati corrispondenti a meno del 10% di conversione. La velocità di reazione iniziale (V ₀₎ è data dalla pendenza della retta secondo:
   
   Nota: Per una pentola relativi cinetica con più substrati, V ₀ è la velocità iniziale di un particolare substrato sotto l'influenza di altri substrati.
6. Per cinetiche substrato singoli, trama V ₀ / [E] contro le corrispondenti concentrazioni di substrato. Il / valore apparente k _cat K _M è data dalla pendenza della parte lineare del grafico secondo:
   
   [S] è la concentrazione di substrato e [E] la concentrazione di enzima utilizzato nella trasformazione. K _cat / K _M equivale alla costante catalitico sopra la costante di Michaelis. Ripetere l'analisi per ciascuna temperatura e ogni variante enzima.
7. Per cinetiche singolo substrato, eseguire un'analisi termodinamica secondo passaggio teoria dello stato ²²
   
   _b k è la costante di Boltzmann, h la costante di Planck, T la temperatura in Kelvin, e R la costante dei gas. Eseguire un'analisi di regressione lineare della trama di ln ((k _{cat / K M) / ((k b * T) / h))) rispetto al 1 / T. L'entalpia di attivazione (Δ H ^‡) è data dalla (-slope) * R e l'entropia di attivazione (Δ S ^‡) è data da (intercetta) * R.
   Nota: Analogamente, un'analisi sotto saturando concentrazione del substrato può essere eseguita utilizzando k cat come tasso costante nell'equazione 3.}
8. Per uno-pot relativa cinetica con più substrati, ottenere il relativo apparente
   k _cat / valori K _M da ^23:
   (K _cat / K _{M) A} / (k _cat / K _{M) B} = _{0 V, A} / V _{0, B} * [B] / [A] (4)
   per cui V _{0, A} si riferisce alla velocità iniziale di substrato A in concorrenza con substrato B.
9. Per uno-pentola relativo kinetics con più substrati, ottenere i parametri termodinamici relativi di attivazione per B, rispetto ad A come riferimento, con la regressione lineare:
   
10. Calcolare i parametri di attivazione assoluti per substrato B dal entalpia ed entropia di attivazione di riferimento composto A:
    

Risultati

L'importanza della dinamica dell'acqua in enzimatica polycyclization catalisi è implicato da analisi in silico e la successiva visualizzazione di gallerie rilevati (utilizzando lo script nel Codice supplementare File 2). In seguito la sezione 3 del protocollo, S168 si trova ad essere un residuo amminoacido "hot spot" che allinea una delle gallerie della triterpene ciclasi enzima Alicyclobacillus acidocaldarius (Figura 1, al centro a sinistra). Introducendo la mutazione S168F in silico, il tunnel è ostruita come visto mediante ispezione visiva (Figura 1, in basso a sinistra).

La velocità di reazione per la formazione di prodotti policiclici visualizzati dall'enzima triterpenici cyclase è molto sensibile alla temperatura (Figura 2A). Seguendo il protocollo (sezione 4-7), si è constatato che l'apparente k _cat / K _{M visualizzato da wild-type enzimatico per la formazione di prodotti pentaciclici aumenta fiftyfold quando la temperatura è aumentata di 25 ° C (Figura 2A). Blocco individuali gallerie introducendo una mutazione puntiforme ha un effetto significativo sui assoluta apparente k cat / valori K M determinati sperimentalmente, nonché sulla loro dipendenza dalla temperatura (Figura 2A).}

Dai parametri cinetici determinate sperimentalmente, trame termodinamiche lineari sono generate dall'equazione 3 e seguendo sezione 6-7 del protocollo per cinetiche substrato singoli (Figura 2B). I grandi cambiamenti di entropia di attivazione ed entalpia osservati per varianti ospitanti tunnel bloccati implica un ruolo chiave dinamica dell'acqua nel promuovere cascata polycyclization (Figura 2C, calcoli basati sulla Figura 2B). Inoltre, Varianti con tunnel di acqua alterate mostrano una energia libera di Gibbs alterato di attivazione (Δ G ^‡ = Δ H ^‡ - T * Δ S ^‡, figura 2B-C). Per esempio, a 303 K variante tunnel S168F visualizza una energia libera di Gibbs di attivazione di 14 kcal / mol rispetto al 16 kcal / mol per il wild-type enzima.

A seguito del protocollo nella sezione 7, equazione 4 consente per il calcolo dei _{cat /} valori apparente K K _M per supporti aggiuntivi da esperimenti di cinetica uno-pentola (Figura 3A). Inoltre, una trama termodinamica lineare (figura 3B) può essere costruito mediante l'esecuzione del saggio concorso a diverse temperature (equazione 5). In analogia con la cinetica singolo substrato, l'entalpia ed entropia relativa attivazione per supporti aggiuntivi rispetto ad un composto di riferimento sono readily accessibile dal intercetta e pendenza lineare si adatta ai dati sperimentali. I valori assoluti dei parametri termodinamici di attivazione possono essere valutati dalla aggiunta aritmetica utilizzando dati termodinamici associati con il composto di riferimento (equazione 6). Utilizzando il protocollo qui, hanno generato risultati mostrano chiaramente che la membrana enzima varianti con tunnel di acqua bloccate mostrano fondamentalmente diversi parametri termodinamici di attivazione per i substrati di diverse dimensioni (Figura 3C).

Figura sintesi 1. Protocollo:. In modellazione al computer silico di concerto con progettazione di proteine ​​sperimentale e analisi termodinamica permette una migliore comprensione dell'influenza delle dinamiche del solvente sulla catalisi enzimatica Cliccatequi per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. parametri termodinamici di attivazione di wild-type e tunnel varianti dal cinetica unico substrato. (A) k apparente _{cat /} valori K _M ottenuti dai dati sperimentali e utilizzando le equazioni 1 e 2. (B) analisi termodinamico utilizzando la teoria dello stato di transizione e in forma lineare dei dati sperimentali all'equazione 3. (C) parametri termodinamici di attivazione calcolati dai grafici in (B). Il substrato squalene già piegati è mostrato con legami formati / rotto come linee tratteggiate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. parametri termodinamici di attivazione di wild-type e tunnel varianti per diversi substrati. (A) k relativa _{cat /} valori K _M ottenuti da un pot-cinetiche, utilizzando l'equazione 4. (B) Trame termodinamiche dei dati cinetici a diverso temperature utilizzando la formula 5. (C) parametri termodinamici assoluti di attivazione calcolati dall'equazione 6 e utilizzando la squalene substrato in figura 2 come riferimento. Obbligazioni formato / rotti nei substrati sono mostrati come linee tratteggiate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Le fasi più critiche per raggiungere dati termodinamici sperimentali ad alta qualità wild-type membrana enzimi e tunnel varianti sono: 1) generazione del modello di computer; 2) le proteine ​​purificate in modo omogeneo; 3) le scorte di substrato emulsionati; 4) il controllo della temperatura durante cinetiche; 5) estrazione di miscele di reazione usando standard interno.

La generazione del modello di computer è notevolmente facilitata dall'utilizzo di un software con interfaccia user-friendly che supporta una varietà di piattaforme. Quindi, questo protocollo si fonda sulla modellazione suite di YASARA ¹⁶ per rendere la nostra strategia accessibile anche a modellare non addetti ai lavori. Un modello di computer per l'identificazione tunnel acqua deve idealmente essere basato su una struttura cristallina dell'enzima di interesse ^24. A questo scopo, la ricchezza di strutture cristalline disponibili nella banca dati di proteine ​​è molto vantaggioso. Nella nostra esperienza, un aspetto fondamentale per la preparazione di successo di temPiastre per l'identificazione del tunnel è quello di mantenere le acque cristallografiche. E 'altrettanto importante utilizzare una casella di enzima solvatato durante l'esecuzione di simulazioni di dinamica molecolare, che possono essere eseguiti su un normale computer. Il ciclasi triterpene da Alicyclobacillus acidocaldarius è stabile in acqua durante le simulazioni MD ^3. Tuttavia, mantenere detergenti cristallografiche e / o utilizzando imita membrana cellulare sarebbe forse essere richiesto per gli enzimi potenzialmente instabili per consentire simulazioni MD estesi. E 'previsto che la struttura cristallina minimizzato di obiettivi altamente impegnativi potrebbe fornire informazioni importanti meccanicistica utilizzando il protocollo, anche se questo non sarebbe cogliere aspetti dinamici dell'organizzazione tunnel.

Caver ^{19 nella} modalità di base, con un singolo o un numero limitato di istantanee come input, può essere usato da persone non esperte su un laptop standard. Sulla base dell'esperienza ^3, gallerie con un raggio strozzatura (cioè, il raggionel punto più stretto) minore di 1 Å può essere molto rilevante per l'acqua, specialmente se le molecole di acqua cristallografici risiedono nel tunnel predetto (Figura 1, metà sinistra). D'altra parte, un raggio collo di bottiglia più grande potrebbe implicare un tunnel per il trasporto del substrato in e fuori del sito attivo ^10. Lo script di Codice supplementare file 2 possono essere utilizzate dai non esperti per la visualizzazione di gallerie previste. Esperimenti futuri rivelerà se modelli omologia saranno sufficientemente alta risoluzione per consentire lo studio atomistico delle reti idriche e dinamiche. Far luce su come eseguire simulazioni di dinamica molecolare, con e senza un legante presente nel sito attivo, influenza il processo di identificazione tunnel sarebbe anche di importanza.

Cinetica di proteine ​​di membrana possono costituire una sfida formidabile ^25. Il protocollo qui si basa su un protocollo di estrazione semplice membranaper ottenere l'enzima di membrana senza l'uso di attrezzature costose, quali un'ultracentrifuga. L'uso di gel filtrazione come passo lucidatura finale rimuove le particelle potenziali di membrana residua e permette di definire un ambiente detersivo adatta ^25.

Un aspetto fondamentale per ottenere risultati cinetici riproducibili dal protocollo è di emulsionare soluzione substrato magazzino da ultrasuoni. Semplice vortex di substrati idrofobici diluiti nel tampone di reazione dà miscele omogenee substrato detergenti. Il pipettaggio di soluzioni substrato non emulsionate porta a concentrazioni non riproducibili (confermati da GC quantitativa), che impedisce la determinazione accurata dei tassi iniziali. Al contrario, il pipettaggio di soluzioni stock correttamente emulsionate dovrebbe tradursi in analisi di regressione lineare dei tassi iniziali con R ² nell'intervallo di 0,98-0,99. Un altro aspetto importante di substrati idrofobici è il substrato solubilità apparentee disponibilità di miscele substrato detergenti. In realtà, non è stato possibile saturare ciclasi triterpenici con il substrato squalene riferimento. Per questo motivo apparente k _{cat /} valori K _M vengono presentati nel presente documento che potrebbe contenere i contributi provenienti sia vincolante e la chimica. Tuttavia, è stato dimostrato che la chimica è limitante per k _{cat /} K _M per la cascata polycyclization condotto da ciclasi triterpeniche ^3.

E 'di grande importanza per verificare la temperatura reale all'interno di un flacone di vetro reazione con un termometro esterno. Eppure, attacchi lineari possono essere più poveri per le varianti con costante essenziale apparente k _{cat /} valori K _M a diverse temperature. Questo è sottolineato per la variante S168F qui (Figura 2A) con una entalpia di attivazione vicino a zero (Figura 2B e 2C). Molto small cambiamenti di temperatura-dipendenti apparente k _cat / K _M, potrebbero indurre incertezza nella entropia di attivazione osservata Δ S ^‡ (cioè, l'intercetta nelle trame lineari in Figura 2B). In linea di principio, l'entropia di attivazione osservata potrebbe anche essere influenzata da una diversa abbondanza di enzimi attivi per diverse varianti, che non sarebbero rilevati misurando la concentrazione proteica. Si prevede che gli errori sperimentali sono ridotti durante la miscelazione diversi substrati in una pentola. Questo perché tutti i diversi substrati interagiscono con la stessa quantità di enzima in queste circostanze (equazione 4). L'uso di un solvente di estrazione spillo con uno standard interno è importante tenere conto delle differenze durante l'estrazione e / o GC-iniezione.

Teoria dello stato di transizione è stato utilizzato con successo in enzimologia ^26. Questo importante quadro teorico è stato originariamente desvi- reazioni unimolecolari in fase gassosa. Tuttavia, è stato dimostrato che gli enzimi lavorano principalmente abbassando l'attivazione classica barriera di energia ^26. Il coefficiente di trasmissione presume essere uno qui potrebbe influenzare l'entalpia di attivazione misurata e / o di entropia. Il contributo di tunneling, e altri effetti non classici come riattraversare dello stato di transizione, possono contribuire circa 1000 volte alla catalisi ²⁶ corrispondente a circa 4 kcal / mol di energia. Si può notare che l'entropia di attivazione visualizzato dal wild-type enzima (16 kcal / mol a 328 K, Figura 2C) è molto più grande di tali effetti non classici causati da un coefficiente di trasmissione non uniforme. L'impatto del coefficiente di trasmissione dovrebbe diminuire quando si confrontano parametri termodinamici di attivazione per tipo e tunnel varianti selvatiche mediante il protocollo.

L'energia libera di Gibbs di attivazione (Δ G ^‡) è composed sia di un entalpico (Δ H ^‡) e un entropico (- T * Δ S ^‡) termine. Riorganizzazione solvente in enzimi durante la catalisi può influenzare entrambi i parametri. Il presente protocollo è prevista per facilitare lo studio di questi fenomeni con l'assemblaggio di una serie di strumenti di rilevanti e utente amichevole in silico strumenti di calcolo con il necessario quadro sperimentale biofisico. Il metodo prevede di essere utile per studiare una pletora di processi enzimatici, tra catalisi da enzimi di membrana.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
YASARA	YASARA Biosciences	http://www.yasara.org/	Programma di modellazione e simulazione molecolare
PARACARICE	CaverSoft	http://caver.cz/	Tool per l'analisi dei tunnel nelle proteine, licenza gratuita per uso accademico
Bradford Ultra	Expedeon	BFU1L, BFU05L	Quantificazione delle proteine in soluzioni contenenti fino all'1% di detergente
Omogeneizzatore Potter-Elvehjem	VWR	432-0205, 432-0217	Omogeneizzazione di pellet cellulare congelato
Compresse cocktail di inibitori della proteasi	Roche	4693159001	inibitore della proteasi
	Millipore	UFC901008	Unità filtranti centrifughe per la concentrazione di proteine, MWCO 10 kDa
Thermomixer	Eppendorf	5382000015	Thermomixer per l'incubazione dei campioni

Unità filtranti centrifughe