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Articolo metodologico

La differenziazione del SH-SY5Y neuroblastoma umano linea cellulare

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⸱

DOI:

10.3791/53193

⸱

17 febbraio 2016

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Huck Institutes of the Life Sciences, The Pennsylvania State University

In questo articolo

Sommario

È fondamentale in neurobiologia e neurovirologia avere un sistema in vitro affidabile e replicabile che funga da modello traslazionale per ciò che avviene in vivo nei neuroni umani. Questo protocollo descrive come coltivare e differenziare le cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y in neuroni vitali per l'uso in applicazioni in vitro.

Abstract

Avere sistemi appropriati in vivo e in vitro che forniscono modelli traslazionali per le malattie umane è un aspetto integrante della ricerca in neurobiologia e neuroscienze. I tradizionali modelli sperimentali in vitro utilizzati in neurobiologia includono colture neuronali primarie di ratti e topi, linee cellulari di neuroblastoma tra cui cellule B35 di ratto e cellule Neuro-2A di topo, cellule PC12 di ratto e colture di fette a breve termine. Sebbene molti ricercatori si affidino a questi modelli, mancano di una componente umana e gli effetti sperimentali osservati potrebbero essere esclusivi delle rispettive specie e potrebbero non verificarsi in modo identico negli esseri umani. Inoltre, sebbene queste cellule siano neuroni, possono avere cariotipi instabili, rendendo il loro uso problematico per gli studi sull'espressione genica e gli studi riproducibili sulla segnalazione cellulare. È quindi importante sviluppare modelli più coerenti di malattia neurologica umana.

La seguente procedura descrive un metodo facile da seguire e riproducibile per ottenere colture neuronali umane omogenee e vitali, differenziando la linea cellulare di neuroblastoma umano cromosomicamente stabile, SH-SY5Y. Questo metodo integra diversi metodi precedentemente descritti1-4 e si basa sulla rimozione sequenziale del siero dai terreni. La sequenza temporale include la graduale carenza di siero, con l'introduzione di proteine della matrice extracellulare e fattori neurotrofici. Ciò consente ai neuroni di differenziarsi, mentre le cellule epiteliali vengono selezionate, risultando in una coltura neuronale omogenea. Risultati rappresentativi dimostrano il successo della differenziazione delle cellule di neuroblastoma SH-SY5Y da un fenotipo cellulare iniziale simile all'epitelio a un fenotipo neuronale più ampio e ramificato. Questo protocollo offre un modo affidabile per generare popolazioni omogenee di colture neuronali che possono essere utilizzate per successive analisi biochimiche e molecolari, fornendo ai ricercatori un modello traslazionale più accurato dell'infezione e della malattia umana.

Introduzione

La possibilità di utilizzare in sistemi modello in vitro ha notevolmente migliorato i campi della neurobiologia e neuroscienze. Le cellule in coltura forniscono una piattaforma efficiente per caratterizzare la funzionalità delle proteine ​​e dei meccanismi molecolari alla base dei fenomeni specifici, per comprendere la patologia di malattie e infezioni, e di effettuare valutazioni preliminari di prova della droga. In neurobiologia, i principali tipi di modelli di coltura cellulare includono colture neuronali primarie derivate da ratti e topi, e le linee di cellule di neuroblastoma come le cellule di ratto B35 5, Neuro-2A cellule di topo 6, e le cellule di ratto PC12 7. Sebbene l'uso di tali linee cellulari ha avanzato significativamente il campo, ci sono diversi fattori confondenti associati alla manipolazione cellule non e tessuti umani. Questi includono la comprensione specie-specifiche differenze nei processi metabolici, fenotipi di manifestazione della malattia, e la patogenesi rispetto agli esseri umani. E 'anche importante notare che ilre sono differenze significative tra il mouse e l'espressione genica umana e segnalazione fattore di trascrizione, mettendo in evidenza i limiti dei modelli di roditori e l'importanza di comprendere quali percorsi sono conservati tra i roditori e gli esseri umani 8-11. Altri hanno impiegato l'uso di linee cellulari neuronali umani, tra cui la N-Tera-2 (NT2) linea di cellule umane teratocarcinoma e le cellule staminali pluripotenti inducibile (iPSCs). Queste linee cellulari forniscono buoni modelli per i sistemi umani in vitro. Tuttavia, la differenziazione delle cellule NT2 con acido retinoico (RA) comporta la generazione di una popolazione mista di neuroni, astrociti e cellule gliali radiali 12, che richiedono un ulteriore stadio di purificazione per ottenere popolazioni pure di neuroni. Inoltre, cellule NT2 mostrano un cariotipo altamente variabile 13, con più del 60 cromosomi in 72% di cellule. iPSCs dimostrano variabilità nella differenziazione tra diverse linee cellulari e variano in termini di efficienza differenziazione 14. E 'quindi auspicabile disporre di un modello di cellule neuronali umane e riproducibile per completare queste alternative.

cellule neuroblasti-like SH-SY5Y sono un sottoclone della parentali cellule di neuroblastoma SK-N-SH. La linea cellulare parentale è stato generato nel 1970 da una biopsia del midollo osseo che contiene sia neuroblast-like e cellule epiteliali-come 15. cellule SH-SY5Y hanno un cariotipo stabile composto di 47 cromosomi, e possono essere differenziati da uno stato neuroblast simile in neuroni umani maturi attraverso una varietà di meccanismi diversi, tra cui l'uso di RA, esteri del forbolo, e neurotrofine specifici come derivato dal cervello fattore neurotrofico (BDNF). Prove Prima suggerisce che l'uso di metodi differenti può selezionare per specifici sottotipi neuronali come adrenergici, colinergici, e neuroni dopaminergici 16,17. Quest'ultimo aspetto rende le cellule SH-SY5Y utili per una moltitudine di esperimenti neurobiologia.

ontent "> Diversi studi hanno notato importanti differenze tra le cellule SH-SY5Y nei loro stati indifferenziati e differenziati. Quando le cellule SH-SY5Y sono indifferenziate, che rapidamente proliferano e sembrano essere non polarizzata, con pochissime, processi brevi. Spesso crescono in gruppi ed esprimere marcatori indicativi di neuroni immaturi 18,19. Quando differenziate, queste cellule si estendono lungo, ramificata processi, diminuzione della proliferazione, e in alcuni casi polarizzano 2,18. cellule SH-SY5Y completamente differenziati sono stati precedentemente dimostrato di esprimere un varietà di diversi marcatori di neuroni maturi tra cui proteine ​​di crescita-associata (GAP-43), i nuclei neuronali (NeuN), synaptophysin (SYN), delle vescicole sinaptiche proteina II (SV2), enolasi neurone specifica (NSE) e proteine ​​associate ai microtubuli (MAP) 2,16,17,20, e mancare espressione di marcatori gliali come la proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) 4. a ulteriore sostegno che differenziano le cellule SH-SY5Y RAPPRESEnt una popolazione neuronale omogenea, la rimozione di BDNF si traduce in apoptosi cellulare 4. Questo suggerisce che la sopravvivenza delle cellule SH-SY5Y differenziate dipende da fattori trofici, simile a maturare neuroni.

L'utilizzo di cellule SH-SY5Y è aumentato rispetto alla subclone è stata fondata nel 1978 3. Alcuni esempi del loro uso includono indagare la malattia di Parkinson 17, il morbo di Alzheimer 21, e la patogenesi delle infezioni virali tra cui poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 , virus varicella-zoster (VZV) 1, citomegalovirus umano 25, e il virus herpes simplex (HSV) 2,26. È importante notare che diversi studi utilizzando cellule SH-SY5Y hanno utilizzato queste cellule nella loro forma indifferenziata, soprattutto nel campo della neurovirology 27-36. La differenza nel fenotipo osservato di indifferenziata rispetto a cellule SH-SY5Y differenziate pone la questione di whether la progressione osservata dell'infezione sarebbe diversa nei neuroni differenziati maturi. Ad esempio, le cellule SH-SY5Y differenziati hanno una maggiore efficienza di HSV-1 captazione contro, proliferano le cellule SH-SY5Y indifferenziate, che può essere a causa della mancanza di recettori di superficie che legano HSV e modulano l'ingresso sul indifferenziate cellule SH-SY5Y 2. È quindi importante che quando si progetta un esperimento focalizzata sui test neuroni in vitro, cellule SH-SY5Y dovrebbero essere differenziati al fine di ottenere i risultati più accurati per la traduzione e confronto di modelli in vivo.

Lo sviluppo di un metodo affidabile per generare colture neuronali umane è indispensabile per consentire ai ricercatori di effettuare esperimenti traslazionale che modellano con precisione il sistema nervoso umano. Il protocollo qui presentata è una procedura che delinea le best practice derivate da metodi precedenti 1-4 per arricchire per i neuroni umani che si differenzianocon acido retinoico.

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Protocollo

1. Considerazioni generali

  1. Vedere la tabella dei materiali / attrezzature per un elenco di reagenti necessari. Eseguire tutte le operazioni in condizioni asettiche rigorose.
  2. Utilizzare siero fetale bovino inattivato al calore (hiFBS) per tutte le preparazioni dei media che includono FBS. Per riscaldare-inattivare, riscaldare a 50 ml aliquota di FBS a 56 ° C per 30 minuti, invertendo ogni 10 min (vedi anche tabella 1).
    Nota: Quando FBS viene utilizzato senza calore inattivazione, il fenotipo epiteliale-come progredisce più rapidamente in tutto colture di cellule SH-SY5Y.
  3. Prima dell'uso, consentire ai media per riscaldare ed equilibrare in un incubatore di stabilire un equilibrio del pH corretto prima di ogni passo. Ad esempio, 50 ml di media dura circa un'ora per equilibrare completamente (pH 7, 37 ° C, 5% CO 2).
    Nota: Questo protocollo utilizza una procedura di scissione in due fasi che richiede cellule parzialmente differenziate SH-SY5Y essere trypsinized e ri-placcati. Questa è una stressanteProcedimento per queste cellule estremamente fragili. Pertanto, è importante incubare le cellule in tripsina per una quantità minima di tempo. Ciò consentirà per la preferenziale lift-off di neuroni, lasciando le cellule epiteliali come ancora attaccato al piatto.
  4. Eseguire triturazione di cellule differenziate lentamente con una pipetta di plastica da 10 ml con la punta contro il fondo del tubo conico contenente le cellule. Eseguire triturazione a bassa velocità, su e giù per non più di cinque volte.

2. Il passaggio di SH-SY5Y Culture manutenzione

  1. culture manutenzione Split quando le cellule hanno raggiunto il 70-80% di confluenza, e non superare i 10 ei 15 passaggi. Le culture in genere devono essere diversi passaggi ogni 3-5 giorni (culture assumendo non sono diluiti più di 5 volte durante splitting).
  2. Per le celle passaggio da un pallone T-75, aspirare fuori dei media, quindi risciacquare con circa 10 ml di PBS 1X.
    Nota: Si consiglia di non dividere il SH-SY5Y manutenzione culture further di 1: 5 durante passaging perché questo può causare le cellule a morire a causa della bassa confluenza.
  3. Aspirare PBS e aggiungere 2,5 ml di 0,05% tripsina-EDTA (1x).
  4. Incubare in incubatrice 2-3 min e ribaltare delicatamente per rilasciare cellule dalla superficie del pallone.
  5. Aggiungere 10 ml di base Crescita media (vedi Tabella 2) e triturare 1-2 volte.
  6. Spin down per 2 min a 1000 xg, i media aspirare, quindi risospendere pellet in 5 ml di base Crescita Media.
  7. Diluire le cellule da 1: 3 a 1: 5 in un volume totale di 20 ml per placcatura normale T-75 pallone, o contare e la piastra di differenziazione (punto 5).

3. congelamento cellule SH-SY5Y

  1. Congelare i primi passaggi di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y in crescita di base di media integrati con il 5% (v / v) DMSO.
  2. Inizialmente, congelare aliquote a -80 ° C per 24 ore, poi il trasferimento per l'azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
    Nota: Per avere un riferimento, un confluenti (75-85%) T-75 pallone produrrà cinque1 ml aliquote di cellule SH-SY5Y per il congelamento. Ognuna di queste aliquote dovrebbero contenere ovunque da 2-5 milioni di cellule totali.

4. Cellule Scongelare e Cultura indifferenziata SH-SY5Y neuroblastoma

  1. Preparare la crescita di base Media.
  2. Scongelare rapidamente cellule congelate a bagnomaria C 37 ° (circa 2 min).
  3. Risospendere le cellule in 9 ml di base la crescita media in un tubo da 15 ml, e poi centrifugare per 2 min a 1000 x g.
  4. Aspirare il surnatante facendo attenzione a non disturbare le cellule pellet, e le cellule delicatamente risospendere in 10 ml di base Crescita Media.
  5. Cellule piatto sulla un pallone T-25 o 60 mm 2 piatto.
  6. Il giorno successivo, sostituire il supporto per rimuovere le cellule morte.

5. Giorno 0: placcatura cellule di differenziazione

  1. Vedere la Figura 1 per il programma di differenziazione.
  2. Lavare le cellule indifferenziate con 1x PBS, aspirare, e poi trypsinize con 1-2 ml riscaldati1x 0,05% tripsina-EDTA.
  3. Quando le cellule sono in tripsina, incubare per circa 3 minuti in un incubatore.
  4. Placare la tripsina con l'aggiunta di 10 ml di crescita di base dei media, sciacquare le pareti del pallone o un piatto, e triturare delicatamente 1-3 volte. Trasferire contenuto in una provetta conica da 15 ml.
  5. Centrifugare per 2 min a 1000 xg, e aspirare i media facendo attenzione a non disturbare il pellet.
  6. Risospendere il pellet in 5 ml di base Crescita media e triturare 1-3 volte.
  7. Contare le cellule utilizzando un emocitometro, poi diluite con la crescita di base media di 50.000 cellule / ml.
  8. Piastra 2 ml di cellule per 35 mm 2 piatto per un totale di 100.000 cellule per piatto e mettere di nuovo in incubatrice.

6. Giorno 1: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)

  1. Aliquota 50 ml di differenziazione media # 1 (vedi tabella 2) e incubare in un bagno d'acqua a 37 ° C.
  2. Quando il supporto è riscaldato, lasciarlo equilibrare in un incubatore (37° C, 5% CO 2) per almeno un ora di stabilire un giusto equilibrio pH prima dell'uso.
  3. Aggiungere acido retinoico (RA) (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
    Nota: L'acido retinoico è sensibile alla luce e deve essere conservato in bottiglie scure a 4 ° C
  4. Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
  5. Aggiungere 2 ml di differenziazione media # 1 con RA per 35 mm 2 piatto e tornare a incubatore.

7. Giorno 3: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)

  1. Ripetere Sezione 6 (punti 1-5)

8. Giorno 5: Cambia supporto (Differenziazione media # 1)

  1. Ripetere Sezione 6 (punti 1-5)

9. Giorno 7: Dividi celle 1: 1

  1. Aggiungere RA riscaldato ed equilibrato differenziazione media # 1 immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
  2. Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
  3. Aggiungere 200 plriscaldato 0,05% 1x tripsina EDTA a 35 mm 2 piatto e caldo in incubatrice circa 2-3 minuti o fino a quando le cellule sono visibilmente sollevati dalla piastra come osservato sotto un microscopio.
  4. Placare la tripsina con l'aggiunta di 2 ml di differenziazione media # 1 con RA per 35 mm 2 piatto e utilizzare i media per lavare rimanenti cellule neuronali fuori la piastra. Poi il trasferimento contenuto in un tubo conico da 50 ml.
    Nota: Durante tripsinizzazione passi, non trypsinize troppi piatti in una sola volta. Questo aiuta ad assicurare colture neuronali non vengono incubate in tripsina per troppo tempo, che può essere citotossico.
  5. Unire il contenuto da un massimo di 10 piatti in tubo conico da 50 ml e delicatamente triturare lentamente su e giù non più di cinque volte con una pipetta di plastica da 10 ml.
  6. Aliquota sospensione cellulare 2 ml in fresco 35 mm 2 piatti e tornare a incubatore.

10. Giorno 8: Variazione media (differenziazione media # 2)

  1. Aggiungere RA (vedi Tabella 1) per riscaldato ed equilibrato dei media immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
  2. Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
  3. Lentamente aggiungere 2 ml di differenziazione media # 2 (vedi tabella 2) con RA per 35 mm 2 piatto e ritorno in incubatrice. Non permettere neuroni di essere esposte all'aria per un periodo prolungato di tempo in quanto possono asciugare rapidamente.

11. Giorno 9: Preparare matrice extracellulare (ECM) Piatti rivestiti

  1. Scongelare una fiala di soluzione di ECM sul ghiaccio e diluire 1: 100 in DMEM freddo.
  2. Distribuire 2 ml di miscela in ciascuna delle piastre 35 mm 2 e garantire l'intera base del piatto è coperto.
  3. Inserire in termostato (37 ° C, 5% CO 2) per 1 ora o durante la notte.
  4. miscela Aspirare e lasciare asciugare per circa 1 ora in una cappa. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 2 mesi.

12. Giorno 10: Cellule trasferimento suECM Piastre rivestite 1: 1

  1. Aggiungere RA (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
  2. Delicatamente aspirare fuori dei media e scartare.
  3. Aggiungere 200 microlitri riscaldati tripsina a ciascuna piastra da 35 mm 2 e lasciare incubare a temperatura ambiente per circa 1-2 minuti o fino neuroni sono visibilmente sollevati dal piatto come osservato sotto un microscopio.
    Nota: Eseguire questo passaggio tripsinizzazione a temperatura ambiente in modo da non a un eccesso di incubare neuroni con tripsina e causare danni. I neuroni rilasciano dai piatti molto più velocemente rispetto alle cellule epiteliali-come in questa fase.
  4. Placare la tripsina con l'aggiunta di 2 ml di differenziazione media # 2 per 35 mm 2 piatto e utilizzare i media per lavare rimanenti cellule neuronali fuori la piastra. Poi il trasferimento contenuto in un tubo conico da 50 ml.
  5. Unire il contenuto da un massimo di 10 piatti in tubo conico da 50 ml e delicatamente triturare lentamente su e giù non più di cinque volte conuna plastica pipetta 10 ml.
  6. Dispensare 2 ml di sospensione cellulare in ECM rivestite da 35 mm 2 piatti e tornare a incubatore.

13. Giorno 11: Cambia supporto (differenziazione media # 3)

  1. Aggiungere RA (vedi Tabella 1) per riscaldato e dei media equilibrata immediatamente prima di aggiungere supporti per piatti.
  2. Delicatamente aspirare fuori vecchi media e scartare.
  3. Aggiungere lentamente 2 ml Differenziazione media # 3 (vedi tabella 2) con RA per 35 mm 2 piatto e tornare a incubatore. Non permettere neuroni di essere esposte all'aria per un periodo prolungato di tempo.

14. Giorno 14: Cambia supporto (differenziazione media # 3)

  1. Ripetere Sezione 13 (passi 1-3)

15. Giorno 17: Ultima media Change (Differenziazione media # 3)

  1. Ripetere Sezione 13 (passi 1-3)

16. Giorno 18: colture neuronali pronto per l'uso

  1. Cambia supporto per fresco Differenziazione media # 3 con RA ogni 3 giorni per mantenere la salute dei neuroni.
    Nota: Le cellule devono essere differenziate in neuroni e mostrano un fenotipo neuronale. Le culture sono generalmente stabili fino a 14 giorni dopo la differenziazione terminale, tuttavia durata del neurone redditività dipende dal numero passaggio delle cellule indifferenziate all'inizio di differenziazione. numeri di passaggio maggiore resa neuroni differenziati con una vita utile più breve.

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Risultati

Attualmente, ci sono molti casi nel campo della neurobiologia e neurovirology in cui le cellule SH-SY5Y indifferenziate vengono utilizzati come un modello funzionale per i neuroni umani 27-36, e, soprattutto, le cellule indifferenziate possono mancare fenotipi quali ottimale assorbimento virale 2 che sono necessario per la corretta interpretazione. È fondamentale che quando si usano cellule SH-SY5Y o qualsiasi altro sistema in vitro neuronale, le cellule sono opportunamente differenziate i...

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Discussione

Il protocollo di cui sopra fornisce un metodo semplice e riproducibile per generare colture neuronali umane omogenee e vitali. Questo protocollo utilizza tecniche e pratiche che integrano diversi metodi precedentemente pubblicati 1-4 e mira a delineare le migliori pratiche di ciascuno. Differenziazione delle cellule SH-SY5Y si basa sulla progressiva deprivazione di siero; l'aggiunta di acido retinoico, fattori neurotrofici e proteine ​​della matrice extracellulare; e la divisione di serie per selezionare ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati per i contributi di Yolanda Tafuri nell'ottimizzare le condizioni per la differenziazione SH-SY5Y, e per il supporto della Dott.ssa Lynn Enquist, nel cui laboratorio è stato avviato questo lavoro. Y. Tafuri ha contribuito con le immagini mostrate nella Figura 3. Questo lavoro è stato supportato dal NIH-NIAID Virus Pathogens Resource (ViPR), dal Bioinformatics Resource Center (MLS e L. Enquist) e dal K22 AI095384 (MLS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
B-27ThermoFisher Scientific17504-044Vedere Tabella 1 per la preparazione
Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)SigmaSRP3014 (10 μ g)/B3795 (5 μ g)Vedere Tabella 1 per la preparazione
dibutirril ciclico AMP (db-cAMP)SigmaD0627Vedere Tabella 1 per la preparazione
DMSOATCC4-X-Minimum
Essential Medium Eagle (EMEM)SigmaM5650-Fetal
Bovine Serum (FBS) HycloneSH30071.03Vedere Tabella 1 per la preparazione
GlutamaxILife Technologies35050-061-Glutammina
HycloneSH30034.01-Potassium
Chloride (KCl)Fisher ScientificBP366-1Vedere Tabella 1 per la preparazione
della soluzione MaxGel Extracellular Matrix (ECM)SigmaE0282Vedere il passaggio 11 del protocollo
NeurobasalLife Technologies21103-049-Penicillina
/Streptomicina (Pen/Strep)Life Technologies15140-122-Acido
retinoico (RA)SigmaR2625Deve essere conservato al buio a 4 ° C perché questo reagente è sensibile alla luce
SH-SY5Y CelluleATCCCRL-2266-0,5
% Tripsina + EDTALife Technologies15400-054-Falcon
35 mm TC piastreFalcon (A Corning Brand)353001-

Riferimenti

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