Questo protocollo descrive un metodo per analizzare, sperimentalmente manipolare e cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Le culture espianto sono utili quando alto tasso di successo, l'efficacia e riproducibilità sono necessari per testare gli effetti di plasmidi per elettroporazione e / o di sostanze reagenti, vale a dire, gli inibitori enzimatici.
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Articolo metodologico
Espianti di retina intero da pollo embrioni per trattamenti di elettroporazione e Agenti chimici
In questo articolo
Sommario
Abstract
La retina è un buon modello per il sistema nervoso centrale di sviluppo. Le grandi dimensioni degli occhi e, soprattutto, l'accessibilità per le manipolazioni sperimentali in ovo / in vivo rende il pollo retina embrionale un modello sperimentale versatile e molto efficiente. Anche se la retina pollo è facile bersaglio in ovo da iniezioni intraoculari o elettroporazione, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti all'interno della retina può essere difficile da completamente il controllo. Ciò può essere dovuto a variazioni del sito di iniezione esatta, fuoriuscita dall'occhio o diffusione uniforme delle sostanze. Inoltre, la frequenza di malformazioni e mortalità dopo manipolazioni invasive come l'elettroporazione è piuttosto elevato.
Questo protocollo descrive un ex ovo tecnica per la coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo e fornisce un metodo per esposizione controllata della retina ai reagenti. Il protocol descrive come sezionare, sperimentalmente manipolare, e la cultura interi espianti di retina di embrioni di pollo. Gli espianti possono essere coltivate per circa 24 ore ed essere sottoposti a diverse manipolazioni come elettroporazione. I principali vantaggi sono che l'esperimento non dipende la sopravvivenza dell'embrione e che la concentrazione del reagente introdotto può essere variata e controllata al fine di determinare e ottimizzare la concentrazione efficace. Inoltre, la tecnica è rapida, economica e, insieme con il suo alto tasso di successo sperimentale, assicura riproducibile risultati. Va sottolineato che serve come un ottimo complemento per esperimenti eseguiti in ovo.
Introduzione
La retina è parte del sistema nervoso centrale ed è, con la sua relativa semplicità e architettura cellulare ben caratterizzato, un modello popolare per lo studio dello sviluppo del sistema nervoso centrale. L'occhio dell'embrione di pollo è relativamente grande rispetto al resto dell'embrione. E 'quindi facilmente accessibile in ovo per manipolazioni sperimentali, come le iniezioni o elettroporazione, e serve come un ottimo strumento per acquisire conoscenze su cellule della retina e biologia dello sviluppo in vivo. Nonostante questi importanti vantaggi, la sopravvivenza degli embrioni può essere basso quando gli esperimenti sono invasivi come ad esempio con electroporations, iniezioni ripetute o manipolazioni sperimentali combinati.
Elettroporazione di plasmidi DNA nell'embrione di pollo in ovo è una importante e consolidata tecnica 1. Esso consente per l'etichettatura dei neuroni, tracciando del destino delle cellule, così come tratti neuronali nella NERV centroSistema di unità organizzative e permette per l'espressione genica ectopica di analizzare la funzione delle proteine in vivo. La tecnica è stata utilizzata per gli studi di tubo neurale 2, romboencefalo 3, 4 e della retina. Elettroporazione di retina embrionale in ovo ha qualche difficoltà sperimentali che sono legati alla situazione in vivo. La posizione dell'occhio, a causa della piegatura craniale dell'embrione, è relativamente vicino al cuore. Questa vicinanza aumenta il rischio di arresto cardiaco dopo l'elettroporazione, e il rischio aumenta con l'età dell'embrione. Inoltre, per accedere l'occhio, è necessario aprire le membrane embrionali, aumentando così il rischio di sanguinamento, malformazioni e conseguente ridotta vitalità. Durante il test e l'ottimizzazione di un nuovo plasmide DNA spesso senza un risultato fenotipico noto, queste limitazioni possono diminuire l'efficacia e la potenza del metodo anche per un sperimentalista con esperienza. Come presentato in questo protocollo, la cultura del wespianto foro retina, definito come l'insieme retina neurale con dell'epitelio pigmentato rimosso, è un metodo efficace che completa l'approccio in ovo.
Iniezioni intraoculari di reagenti chimici sono relativamente facili da eseguire in ovo. Tuttavia, la concentrazione efficace e precisa dei reagenti iniettati all'interno della retina neurale può essere difficile controllare completamente. Il volume iniettato può variare a causa delle perdite e il luogo esatto di iniezione può influenzare sia la distribuzione del reagente all'interno dell'occhio e la diffusione attraverso il corpo vitreo. La variabilità avrà importanti implicazioni per l'interpretazione dei risultati, quando cioè una curva dose-risposta per un inibitore viene definito sulla; in particolare se l'effetto è piccola e la finestra temporale dell'effetto è stretta. Inoltre, solo un occhio può essere utilizzato da ogni embrione durante l'esecuzione in esperimenti ovo a causa di potenziali effetti sistemici attraverso il flusso sanguignosul occhio controlaterale. Età matching è importante quando si studia lo sviluppo e la variabilità individuale tra trattati e degli embrioni di controllo possono portare a ulteriore variabilità sperimentale.
Per queste ragioni, un ex ovo metodo basato su espianti retinici da embrioni di pollo è stato sviluppato, in cui la retina neurale può essere esposto ad una uniforme e controllato condizione sperimentale in vitro. Il presente protocollo è stato sviluppato sulla base di precedenti protocolli 5-9. Espianti di retina di fase (st) 20 (giorni embrionali [E] 3) a ST31 (E7) embrioni di pollo sono stati sezionati, colto e elettroporate con una concentrazione di DNA plasmidico definita o esposti ad un terreno contenente una concentrazione definita di un reagente chimico. Il protocollo presentato qui è stato implementato con successo in pubblicazioni recenti, utilizzando diversi reagenti chimici diversi, tra cui le autorità di regolamentazione della via danno al DNA, come KU55933, SB 218.078, e NSC 109555 Ditosylate, e il ciclo cellulare, come Cdk1 / 2 inibitore III 10,11.
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Protocollo
Questo protocollo è eseguita in conformità con le raccomandazioni nella "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio dell'Associazione per la ricerca in visione e oculistica".
1. Manipolazione Uovo e la raccolta degli occhi
- Conservare le uova bianche Livorno a 12-14 ° C per non più di 1 settimana. Se disponibile, utilizzare un dispositivo di raffreddamento di vino refrigerato per conservare le uova fecondate.
Nota: temperatura del serbatoio più elevate portano ad uno sviluppo anormale di embrioni, mentre temperature più basse aumentano la mortalità. Tempo di conservazione estesa aumenta sia la mortalità e lo sviluppo anormale. - Incubare le uova in un 37,5 ° C e 60% uovo incubatore umidificato con leggera oscillazione ad una frequenza di 5 volte per 24 ore.
- Rimuovere le uova incubate dal termostato uovo all'età embrionale desiderato.
Nota: L'età dell'embrione di pollo è determinato come il tempo di incubazione e viene indicato come giorno embrionale (E) o come fasi (st), Secondo la serie di stadi di sviluppo descritti da Hamburger e Hamilton 12. - Collocare le uova selezionati nella cappa a flusso laminare. Pulire il guscio d'uovo con il 70% di etanolo per evitare la contaminazione di un embrione.
Nota: Condurre tutte le procedure in condizioni asettiche con soluzioni sterili https://www.jove.com/science-education/5030/making-solutions-in-the-laboratory"lutions e strumenti. - Toccare il lato dell'uovo saldamente contro una superficie dura per crack aprire l'uovo. Posizionare il contenuto in una capsula di Petri 100 mm. Utilizzare un cucchiaino per trasferire l'embrione di un piatto Petri 35 mm contenente pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x per evitare che il tessuto si secchi.
- Porre la capsula di Petri 35 millimetri contenente il tessuto embrionale su un microscopio da dissezione stereovisione binocolo nella cappa a flusso laminare. Decapitare il embrione stringendo al collo con una pinza sottile e scartare il corpo.
- Utilizzare una pinza sottile per fare un'incisione °ruvida la bocca, ventrali per l'occhio. Partendo dalla sede dell'incisione, lacerare il tessuto che circonda l'intero occhio. Pinch off il nervo ottico e rimuovere l'occhio intatto dalla cavità oculare. Raccogliere sia l'occhio destro e sinistro dello stesso embrione per uso come sia il controllo o l'occhio trattato.
- Utilizzare un cucchiaino per trasferire gli occhi ad una nuova piastra di Petri 35 mm contenente pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x.
2. Preparazione di intere retina Espianti
- Utilizzare una pinza sottile per rimuovere tutto il tessuto intorno all'occhio compreso il anlage sclerale.
Nota: Il tessuto si stacca facilmente lasciando la retina sul corpo vitreo e lente con dell'epitelio pigmentato intatto (Figura 1A-B). - Utilizzare una pinza sottile per pizzicare una piccola incisione nel dell'epitelio pigmentato nella parte dorsale della occhio senza danneggiare la retina neurale (Figura 1C).
- Utilizzare una pinza sottile per strappare delicatamente aprire la starti epitelio pigmentatong al sito di incisione, lasciando la lente e l'intera retina attaccata al corpo vitreo (Figura 1D). Mantenere l'occhio in acqua calda (37 ° C) PBS 1x per facilitare la rimozione dell'epitelio pigmentato.
Nota: Il dell'epitelio pigmentato può essere difficile da rimuovere, in particolare lungo il corpo ciliare intorno alla pupilla, nella regione anteriore dell'occhio, e lungo la fessura coroide. Pertanto, alcuni dell'epitelio pigmentato può essere lasciato sulla retina neurale (Figura 1E-F).
3. Trattamento di interi retina Espianti
- Elettroporazione di intere espianti di retina
Nota: elettroporazione di intere espianti di retina può avvenire direttamente dopo la fase 2.- Preparare terreno di coltura contenente 1: 1 DMEM: F12 mix di nutrienti, il 10% FBS, 10 U / ml di penicillina streptomicina, 5 mg / ml di insulina, e 2 mM L-glutammina.
- Tagliare un 1,5 ml monouso provetta in plastica (12,5 millimetri x 12,5 millimetri x 45 mm) (o qualsiasi piccolo contenitore in grado di contenere soluzione 300-400 microlitri) di circa 8 mm dal fondo con una sega fine-lama.
- Diluire il DNA plasmidico di scelta in 1xDPBS ad una concentrazione finale di 0,1 mg / mL.
- Accendere i parametri elettroporatore e impostati a 15 V per ST20 - ST25 (E3-E4) retina e 20 V per ST26 - ST27 (E5) retina. Impostare il polso si ripete a 5 impulsi di 50 msec impulso di lunghezza, con intervalli di 1 sec. Utilizzare un generatore di impulsi che può essere controllato da un pedale sul pavimento come saranno necessarie entrambe le mani per tenere gli elettrodi in posizione.
- Collegare due paddle forma (piatta, diametro circolare. 4 mm) elettrodi di platino (Figura 2A) alla presa di uscita sul generatore di impulsi.
Nota: Gli elettrodi di platino utilizzati in questo protocollo sono state effettuate dal laboratorio dell'università. Gli elettrodi sono state fatte dalla piastra platino 0,1 millimetri "rondelle" (grado di platino: 950 Pt / 5 Cu). Il collegamento wi 0,8 millimetrire è stato isolato tramite tubi di plastica. - Trasferire accuratamente l'intero espianto della retina dal punto 2.3 alla cuvetta (o piccolo contenitore equivalente) con un polietilene pipetta Pasteur con la punta tagliata di acquisire la giusta dimensione punta-apertura per l'espianto della retina. Evitare l'uso di punte per pipette come la retina tende a collegare alla plastica e lacerare.
- Utilizzare una pipetta 100 microlitri per rimuovere delicatamente l'intero 1x PBS che circonda la retina espianto facendo attenzione a non toccare la retina per evitare di strappare.
- Aggiungere la soluzione plasmide 100 microlitri alla cuvetta per coprire l'intera espianto della retina. Premere con cautela il espianto della retina con una pinza se galleggia verso l'alto. Usare pinze o elettrodi di posizionare l'obiettivo di affrontare qualsiasi lato della cuvetta e il nervo ottico al fondo della cuvetta.
- Posizionare l'elettrodo positivo di fronte alla lente e l'elettrodo negativo dietro la retina (Figura 2A), senza toccare il tessuto.
- Applicare la corrente premendo il pedale. Verificare la presenza di bolle agli elettrodi che indica scarico di successo.
- Utilizzare una pipetta 100 microlitri per rimuovere tutto il mix plasmide dalla cuvetta senza danneggiare la retina. La miscela plasmide può essere riutilizzato tre a cinque volte.
- Riempire la cuvetta con pre-riscaldato (37 ° C) PBS 1x. Utilizzare pinze per staccare delicatamente l'espianto della retina dalla parete della provetta. Dopo elettroporazione retina è talvolta coperto di bolle, che fa aderire alla parete della provetta.
- Utilizzare la pipetta Pasteur polietilene per trasferire l'intera espianto retina in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) di coltura per pozzetto. Incubare un espianto di retina per pozzetto.
- Incubare la espianto retinica a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, in un incubatore cella con 5% di CO 2 per 24 ore. La rotazione è quello di garantire la massima esposizione al mezzo e Prevent adesione della retina al fondo della piastra da 24 pozzetti.
- Passare al punto 4.
- Trattamento di interi espianti retinici con reagenti chimici
Nota: il trattamento chimico di intere espianti di retina può avvenire direttamente dopo la fase 2.- Preparare terreno di coltura contenente 1: 1 DMEM: F12 mix di nutrienti, il 10% FBS, 10 U / ml di penicillina streptomicina, 5 mg / ml di insulina, e 2 mM L-glutammina.
- Utilizzare un cucchiaino per trasferire l'espianto retina dal punto 2.3 in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml preriscaldate (37 ° C) terreno di coltura per pozzetto. Incubare un espianto di retina per pozzetto.
- Incubare tutta espianto retina per 60 min a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, in un incubatore cella con 5% di CO 2 prima di aggiungere un reagente chimico o di un veicolo.
- Preparare la soluzione chimica, per esempio Cdk1 / 2 inibitore III, un inibitore della progressione fase M 13, ad una finaleconcentrazione di 30 mM in DMSO.
- Rimuovere la piastra 24 pozzetti, che contiene tutta la espianto della retina, dal termostato cella. Aggiungere 10 ml di reagente chimico o il veicolo (DMSO) direttamente al mezzo della retina, causando una concentrazione finale di 300 nM Cdk1 / 2 inibitore III 0,01% DMSO. Ruotare manualmente la piastra 24 pozzetti per consentire una distribuzione uniforme del reagente chimico o il veicolo in soluzione.
- Incubare le espianti retinici a 37 ° C su un agitatore rotatore, con una velocità costante di 50 giri al minuto, all'interno di un incubatore con 5% di CO 2 per il tempo desiderato (fino a 24 ore).
- Passare al punto 4.
4. Fissazione e congelamento di Whole retina Eexplants
- Rimuovere la piastra 24 pozzetti contenente tutta espianto della retina trattati dal termostato cella.
- Utilizzare un cucchiaino di trasferire l'espianto della retina di un 24-pozzetti contenenti 1 ml / pozzetto freddo ghiaccio 4% paraformaldeide in 1XPBS. Incubate in ghiaccio per 15 min.
- Utilizzare un cucchiaino per trasferire l'intera espianto retinica ad una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml / pozzetto 1XPBS ghiacciata per lavare la retina. Incubare in ghiaccio per 10 minuti.
- Utilizzare un cucchiaino di trasferire l'intera espianto della retina ad una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml / ben ghiacciata del 30% di saccarosio in 1XPBS. Incubare in ghiaccio per 1-3 ore a seconda del giorno embrionali della retina. Per ST20 - ST25 (E3) retine, incubare per 1 ora, retine anziani hanno bisogno di tempo di incubazione più lungo in saccarosio.
- Utilizzare un cucchiaino per trasferire l'intero espianto retinica su una pellicola di paraffina contenente mezzo di montaggio di circa 500 microlitri criostato congelamento. Rimuovere il più saccarosio possibile spostando delicatamente l'espianto della retina nel mezzo di congelamento con il cucchiaino.
- Trasferire l'espianto della retina di uno stampo embedding terreno contenente congelamento. Posizionare l'occhio per facilitare futuro sezionamento. Mettere lo stampo embedding contenente l'intero espianto della retina su dry ghiaccio finché il terreno è congelato solido. Conservare a -80 ° C.
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Risultati
Questo protocollo descrive la preparazione (Figura 1A-F) e coltura di espianti retinici interi da embrioni di pollo. Questo protocollo è stato usato con successo per interi espianti di retina da embrioni di ST20 (E3) a ST31 (E7).
Elettroporazione di plasmidi DNA in tutto espianti di retina permette per l'etichettatura e la tracciabilità delle cellule progenitrici della retina o sovra-espressione di diversi prodotti genici. Per gli esperimenti di elettroporazione, l'e...
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Discussione
In questo lavoro viene presentato un protocollo dettagliato per la dissezione, elettroporazione o trattamento chimico, e la coltura di interi espianti di retina di embrioni di pollo. Questo protocollo è facile, veloce e consente sia un alto tasso di successo e riproducibile risultati.
Elettroporazione di interi espianti retinici produce grandi aree di cellule che esprimono il costrutto gene di interesse. È facile posizionare correttamente gli elettrodi e di esporre una par...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Il lavoro è stato supportato da Barncancerfonden (PR2013-0104), Swedish Research Council (12187-18-3), ögonfonden, Kronprinsessan Margaretas arbetsnämnd för synskadade, Synfrämjandets forskningsfond e St Eriks ögonsjukhus forskningsstipendier.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1xPBS (tablet) | Life technologies | 18912-014 | |
| 10x DPBS | Life technologies | 14080-048 | |
| 100 mm piastra Petri | VWR | 734-0006 | |
| 100 μ l puntali per pipette | VWR | 613-0798 | |
| cuvetta monouso in plastica da 1,5 ml | Thomas Scientific | 8495V01 | |
| piastra a 24 pozzetti | Sigma Aldrich | D7039 | |
| piastra Petri da 35 mm | VWR | 391-1998 | |
| etanolo al 70% | Solveco | 1054 | |
| Cdk1/2 inibitore III | 217714 | Calbiochem | 300 nM allo 0,01% DMSO |
| Incubatore per colture cellulari | Thermo Forma | ||
| Microscopio da dissezione | Leica | ||
| DMEM | Life Technologies | 41966-029 | |
| Elettrodi | Platina, su misura | ||
| Poratore quadrato ECM 830 | Apparato Harvard F12 | ||
| Mix di nutrienti | Life Technologies | 31331-028 | |
| FBS | Life Technologies | 16140-071 | |
| Pinze | AgnThos | 0108-5-PS | |
| Mezzo di congelamento NEG50 | Cellab, Svezia | 6502 | |
| Plasmide di DNA che esprime GFP (pZGs) | |||
| Incubatore umidificato | Grumbach Brutgeraete GmbH, Asslar, Germania | 8204 | |
| Insulina | Sigma Aldrich | I9278-5ML | |
| L-glutammina | Life Technologies | 25030024 | |
| Mezzo di montaggio ProLong Gold con DAPI | Life Technologies | P36935 | |
| Film di paraffina | VWR | 291-1214P | |
| Paraformaldeide | Sigma Aldrich | 16005-1KG-R | |
| Peel-A-Way stampo per inclusione | Sigma Aldrich | E6032 | |
| Penicillina streptomicina | Life Technologies | 15140-122 | |
| Fosfoistone 3 (PH3) | Millipore | 06-570 | Diluizione 1/4.000 |
| Elettrodi di platino (realizzati su misura da "rondelle") | Sargenta | 390-R (rondeller) | Diametro: 4 mm, 0,1 mm di spessore |
| Elettrodi Platimun | Sonidel | CUY700P4L | Dia: 4 mm |
| Pipetta pasteur in polietilene | VWR | 612-2853 | |
| Agitatore rotatore | VWR | 444-2900 | |
| Cucchiaio piccolo | VWR | 231-2151 | |
| Saccarosio | VWR | 443815S | |
| Uova | Fornitore locale | ||
| Cantinetta vino | WineMaster 24, Caso, Berlino, Germania |
Riferimenti
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