La tecnica Landis modificata consente la misurazione accoppiata della conducibilità idraulica di singoli microvasi nel mesentere di ratti normali e geneticamente modificati in condizioni di controllo e test utilizzando tecniche di microperfusione. Fornisce un metodo conveniente per valutare i meccanismi che regolano la permeabilità dei microvasi e lo scambio transvascolare in condizioni fisiologiche.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli esperimenti per misurare le proprietà di permeabilità dei microvasi irrorati individualmente forniscono un ponte tra studio dei meccanismi molecolari e cellulari che regolano la permeabilità vascolare in coltura monostrato di cellule endoteliali e le proprietà di scambio funzionali di interi letti microvascolari. Un metodo per cannulare e perfusione microvasi venulari di ratto mesentere e misurare la conduttività idraulica della parete dei microvasi è descritta. Le principali attrezzature necessarie include un microscopio intravitale con un grande palco modificato che supporta micromanipolatori di posizionare tre differenti microtools: (1) una micropipetta di vetro smussato a cannulare e perfusione microrecipiente; (2) un vetro micro-occlusore per bloccare transitoriamente perfusione e consentire la misurazione di transvascular movimento flusso d'acqua ad una pressione idrostatica misurata, e (3) una bacchetta di vetro smussato per stabilizzare il tessuto mesenterico nel sito di incannulamento. Il Landis micro-occlusione techniq modificatoue utilizza globuli rossi sospese nel perfusato artificiale come marcatori di fluido movimento transvascular, e consente inoltre misurazioni ripetute di questi flussi condizioni sperimentali sono cambiati e differenza idrostatica e colloide pressione osmotica attraverso i microvasi sono attentamente controllati. Le misurazioni della conducibilità idraulica prima con un perfusato controllo, quindi dopo la ri-incannulamento della stessa microvasi con i perfusates prova consentono confronti della risposta dei microvasi in queste condizioni ben controllate associati. I tentativi di estendere il metodo per microvasi nel mesentere di topi con modificazioni genetiche che si prevede di modificare la permeabilità vascolare erano fortemente limitata a causa dell'assenza di lunghi microvasi dritti e ramificati nel mesentere del mouse, ma la recente disponibilità dei ratti con modificazioni genetiche simili utilizzando la tecnologia / Cas9 CRISPR è prevista l'apertura di nuove aree di indagine in cui possono essere applicati i metodi qui descritti.
Introduzione
Microperfusione nella vascolatura comporta istituisce controllato flusso di perfusato artificiale di composizione nota mediante una micropipetta in un vaso sanguigno di solito meno di 40 micron di diametro. Il vaso perfuso rimane nel suo ambiente tessuto normale e viene perfuso con dell'animale sangue fino al momento della cannulazione. Quando utilizzato in combinazione con una serie di video di immagini o di tecniche fluorimetrica, in situ microperfusione consente la misurazione dei flussi idrici e dei soluti attraverso le pareti dei microvasi in condizioni quali siano note le forze trainanti di questi flussi e le proprietà di permeabilità della parete ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Etica Dichiarazione: Tutte le procedure sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale.
1. Fabbricazione preliminare di Micropipette, la limitazione dei movimenti, e bloccanti
- Estrarre diversi tubi capillari di vetro borosilicato pulite in metà con un estrattore elettronico regolato in modo che, quando viene tirato, la porzione allungata del tubo è di circa 1 cm di lunghezza e le due metà sono piuttosto simmetriche. Assicurarsi che il cono è coerente con le dimensioni in figura 1. Utilizzare le due metà per micropipette, la limitazione dei movimenti e bloccanti.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
La Figura 4 mostra i risultati di misurazione del decorso temporale delle variazioni di L p in un ratto venulare microvasi cannulato successivamente con quattro perfusates. 33 L'entità di L p calcolata a pressione costante è stato usato come una misura delle variazioni di microvasi permeabilità della parete, prima nello stato di controllo con un perfusato contenente 1% di albumina sierica bovina poi, quando la nave è stata esposta per la bradichinina agente infiammat.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Dettagli dei calcoli p L. Anche se il movimento fluido transvascular si verifica mentre la nave è liberamente perfuso, tale scambio è troppo piccolo per essere misurato durante la perfusione libero perché è in genere inferiore allo 0,01% del tasso di perfusione nave. Tuttavia, in condizioni di perfusione viene transitoriamente fermato occludendo microrecipiente, flusso transvascular (cioè, filtrazione) è misurata dal movimento dei globuli rossi marcatori nel lume della colonna di fluido tra .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health sovvenzioni HL44485 e HL28607.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| MICROSCOPIO, TAVOLO E TAVOLINO Microscopio | |||
| invertito (tipo metallurgico) con testa trinoculare per video: esempio | Olympus | CK-40 | cerca di posizionare gli oculari più in alto rispetto al tavolino: devi guardare attraverso gli oculari mentre raggiungi la parte superiore del tavolino sopra i micromanipolatori intermedi |
| microscopio invertito (tipo metallurgico) con testa trinoculare per video: esempio | Leica | DMIL | cerca di posizionare gli oculari più in alto rispetto al palco: devi guardare attraverso gli oculari mentre raggiungi la parte superiore del palco sopra i micromanipolatori intermedi |
| stretto, lunga distanza di lavoro obiettivo: esempio | Nikon | Nikon E Plan 10×/0.25 LWD | |
| stage platform - 1/2 pollice o 1 cm | di officina di saldatura | questo dovrebbe essere pesante per ridurre le vibrazioni | |
| Unislide x-y table: diapositive a coda di rondine | Velmex | AXY4006W1 | |
| VIDEO Videocamera | |||
| CCD: esempio | Pulnix | TM-7CN (non più disponibile) | nessun colore necessario |
| sistema di acquisizione video con audio--sistema di riproduzione video generico | |||
| (fotogramma completamente fermo, movimento a fotogramma singolo) | |||
| piccolo microfoni | |||
| MICROMANIPOLATORI, SUPPORTI | |||
| micromanipolatore, XYZ (3) | Prior/Stoelting (non più disponibile) | cercare Z fine e una gamma più ampia di corsa in azionamenti grossolani per facilitare il posizionamento azionamento idraulico | |
| della sonda, un modo | FHC | 50-12-1C | bisogno di acquistare azionamento manuale o azionamento elettronico |
| azionamento manuale del tamburo | FHC | 50-12-9-02 | |
| o azionamento idraulico, 3 vie | Siskiyou Corporation | MX610 (1 via) o MX630 (3 vie) | ottimo per bracci corti, riempito d'acqua e deve essere rispedito indietro per la ricarica ~ ogni 2 anni |
| connettori / aste / supporti | Siskiyou Corporation | MXC-2.5, MXB ecc. | |
| morsa a spillo | Starrett | 162C | per contenere |
| il portapipette | World Prescision Instruments | MPH3 | |
| manometro dell'acqua ~120 cm | |||
| VASSOIO | |||
| MICROSCOPIO in plexiglas trasparente per vassoio per animali | |||
| Disco in quarzo lucido da 3/4 di pollice ~1/4 di pollice alto ~ 1/4 di pollice di altezza | Quartz Scientific Inc. | personalizzato | ( o plexiglass lucido, vetro); assicurarsi che l'altezza sia inferiore alla distanza di lavoro dell'obiettivo |
| Colla di plexiglas (Weld-on 4: ATTENZIONE CANCEROGENA) | |||
| adesivo medico per pozzetto dei tessuti | NuSil | MED-1037 | |
| Tappetino riscaldante in gomma siliconica multiuso, 5" L x 2" W | Cole Parmer | EW-03125-20 | riscaldatore per vassoio per microscopio - necessita di cavo e controller - versione 240V disponibile |
| Adattatore per cavo di alimentazione per riscaldatori e kit Kapton, 6 piedi, 120 V CA | Cole Parmer | EW-03122-75 | |
| STACO 3PN1010B Regolatore a tensione variabile, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out | Cole Parmer | EW-01575-00 | |
| PIPET MANUFACTURE | |||
| estrattore per pipette verticale | Sutter Instrument Company | P-30 con filamento | |
| 1,5 mm OD tubo capillare a parete sottile | Sutter Instrument Company | B150-110-10 | |
| macinatore per pipette per pietra porosa e microscopio per dissezione: vedere il riferimento nel testo | o acquistare un pacchetto da Sutter Instruments o World Precision Instruments | ||
| RX Levigatrice RX, System II | RX Levigatrice Corporation | MAC-10700 Rx System II Macchina | alternativa per pietra porosa, utilizzare con un microscopio da dissezione montato ad angolo |
| con disco per affilare in ceramica | RX Honing Machine Corporation | utilizzare "così com'è" o attaccare | |
| fogli di pellicola per lappatura, 0,3 o 0,5 um | 3M codice 051144 80827 | 268X Fogli di pellicola per lappatura imperiali con retro adesivo - può essere acquistato da Amazon |
Riferimenti
- Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
- Curry, F. R., Adamson, R. H.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
