In questo studio presentiamo un sistema di coltura in vitro in grado di generare in modo efficiente pDC co-coltivando progenitori linfoidi comuni con cellule feeder AC-6 in presenza del ligando Flt3.
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Articolo metodologico
In Vitro Generazione di Murine plasmacitoidi dendritiche Cellule dal comune linfoide Progenitori utilizzando l'AC-6 Alimentatore Sistema
In questo articolo
Sommario
Abstract
Cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono di tipo potente che interferone (IFN-I) che producono cellule che si attivano in risposta a infezioni o durante le risposte infiammatorie. Purtroppo, studio della funzione pDC è ostacolato dalla loro bassa frequenza in organi linfoidi, e metodi esistenti per la generazione vitro DC prevalentemente favoriscono la produzione di CDC sopra pDC. Qui vi presentiamo un approccio unico per generare efficientemente pDCs da progenitori linfoidi comuni (CLPS) in vitro. In particolare, il protocollo ha descritto i dettagli come purificare CLPS dal midollo osseo e generano pDCs da coculturing con AC-6 cellule di alimentazione gamma-irradiati in presenza di Flt3 ligando. Una caratteristica unica di questo sistema di coltura è che i CLPS migrano sotto le celle AC-6 e diventano cellule territoriali che formano acciottolate, un passaggio fondamentale per l'espansione pDCs. DC morfologicamente distinte, vale a dire PDC e CDC, sono stati generati dopo circa due settimane con una composizione di 70-90% pDCs in condizioni ottimali. Tipicamente, il numero di pDC generati da questo metodo è circa 100 volte del numero di CLPS seminati. Pertanto, questo è un nuovo sistema con cui generare robusto il gran numero di pDC necessarie per agevolare ulteriori studi sviluppo e la funzione di queste cellule.
Introduzione
Le cellule dendritiche (DC) sono cellule presentanti l'antigene professionale che svolgono un ruolo importante nel controllo risposte immunitarie 1. Mentre DC sono eterogenei, possono essere classificati in due popolazioni, DC convenzionale (CDC) e cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) 2,3. Oltre agli organi linfoidi, CDC e pDCs si trovano anche in tessuti tra cui polmone, intestino, pelle e 2. La morfologia di CDC e pDCs differenzia, con CDC espositrici proiezioni dendriti-simili e la forma di pDCs essere più plasma alveolare. Inoltre, il marcatore DC comune topo, CD11c, è più altamente espresso su CDCS che su pDC. Inoltre, CDC....
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Protocollo
C57BL / 6 topi wild-type sono stati acquistati dal National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan. Tutti i topi sono stati allevati e tenuti in condizioni esenti da organismi patogeni specifici. Protocolli e le procedure di utilizzo degli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale della National Taiwan University College of Medicine (Permesso Numero: 20.120.075). Inoltre, i ricercatori fatto ogni sforzo per ridurre il potenziale di dolore, la sofferenza, l'angoscia negli animali durante l'esecuzione di esperimenti. Tutte le procedure descritte sono state effettuate a temperatura ambiente con i guanti.
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Risultati
Un totale di 7 4-6x10 cellule BM sono in genere isolate da femori e tibie di un 6-8 sett-vecchio, wild-type C57BL / 6 del mouse. Per risolvere CLPS, cellule totali BM sono colorate con anticorpi coniugati PE contro marcatori lignaggio (CD3, CD8, B220, CD19, CD11b, Gr-1, Thy1.1, NK1.1, TER119, e MHC-II), anti -c-Kit-PerCP / Cy5.5, anti-Sca-1-FITC, anti-M-Cecoslovacchia-APC e anti-IL-7Rα-PE / Cy7, analizzati e ordinati con un cell sorter. La strategia di ordinamento per CLP è mostrato in Figura.......
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Discussione
Qui si descrive un sistema in vitro in coltura per la robusta generazione di DC, e pDCs in particolare, da un piccolo numero di CLPS. L'unicità di questo sistema di coltura è dovuto all'uso di AC-6 cellule, una linea cellulare stromale, come alimentatori. Questo approccio ha dimostrato di fornire non solo le citochine, come IL-7, SCF, M-CSF e FL 20, ma anche il contatto cellula-cellula 21 necessario per sostenere lo sviluppo DC. AC-6 cellule sono state usate in precedenza per facil.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Drs. Markus Manz e Irving Weissman per la fornitura di reagenti. Riconosciamo inoltre il servizio fornito dal citometria a flusso di analisi e cellulare ordinamento Nucleo Struttura del Primo e del Secondo Nucleo Laboratory presso la National Taiwan University College of Medicine e NTU ospedale, rispettivamente. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (MOST 102-2320-B-002-030-MY3) e il National Institutes Health Research, Taiwan (NHRI-EX102-10256SI e NHRI-EX103-10256SI).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti-topo Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5 | Biolegend | 108408 | marcatore di lignaggio |
| Anti-topo NK1.1 (PE), clone PK136 | Biolegend | 108708 | marcatore di lignaggio |
| Anti-topo CD11b (PE), cloneM1/70 | Biolegend | 101208 | marcatore di lignagine |
| Anti-topo CD19 (PE), clone eBio1D3 | Biolegend | 115508 | marcatore di lignagine |
| Anti-topo B220 (PE), clone RA3-6B2 | Biolegend 103208 | marcatore di lindro/FACS | |
| Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2 | Biolegend | 100308 | marcatore di lignagine |
| Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7 | Biolegend | 100707 | marcatore di lignagine |
| Anti-topo MHC-II (PE), clone NIMR-4 | Biolegend | 107608 | marcatore di lignagine |
| Anti-topo Ter119 (PE), clone TER-119 | Biolegend | 116208 | marcatore di lignagine |
| Anti-topo Thy1.1 (PE), clone HIS51 | eBioscience | 12-0900-83 | marcatore di lignaggio |
| Anti-topo M-CSFR (APC), clone AFS98 | Biolegend | 135510 | FACS |
| C-Kit anti-topo (PerCP/Cy5.5), clone 2B8 | Biolegend | 105824 | FACS |
| Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7 | Biolegend | 108106 | FACS |
| Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34 | Biolegend | 135014 | FACS |
| Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418 | Biolegend | 117328 | FACS |
| Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70 | Biolegend | 101206 | FACS |
| FACSAria III | BD Biosciences | Selezionatore cellulare | |
| FACS tubo di smistamento | BD Biosciences | 352054 | |
| FlowJo | FlowJo LLC | Sofrware per l'analisi del flusso |
Riferimenti
- Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
- Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A.
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Ristampe e permessi
