VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

Yanwen Jiang; Kui Nie; David Redmond; Ari M. Melnick; Wayne Tam; Olivier Elemento

doi:10.3791/53215

Articolo metodologico

VDJ-Seq: sequenziamento analisi profonda di riorganizzate Immunoglobuline catena pesante gene per rivelare clonale Evoluzione Modelli di linfoma B cellulare

DOI:

10.3791/53215

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28 dicembre 2015

Yanwen Jiang¹^,² , Kui Nie³ , David Redmond² , Ari M. Melnick¹ , Wayne Tam³ , Olivier Elemento²

¹Department of Medicine, Weill Cornell Medical College, ²Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, ³Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive un approccio per interrogare le regioni VDJ della catena pesante delle immunoglobuline ricombinate dei linfomi mediante sequenziamento profondo e recuperare il riarrangiamento VDJ e lo stato di ipermutazione somatica per delineare l'architettura clonale del singolo tumore. Il confronto dell'architettura clonale tra la diagnosi accoppiata e i campioni di recidiva rivela le modalità di evoluzione clonale della recidiva del linfoma.

Abstract

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La comprensione clonalità tumore è fondamentale per comprendere i meccanismi coinvolti nella tumorigenesi e la progressione della malattia. Inoltre, comprendere i cambiamenti composizione clonali che si verificano all'interno di un tumore in risposta a determinati microambiente o trattamenti possono portare alla progettazione di approcci più sofisticati ed efficaci per eliminare le cellule tumorali. Tuttavia, tumori clonali inseguimento sottopopolazioni è stato difficile a causa della mancanza di marcatori distinguibili. Per risolvere questo problema, un protocollo VDJ-ss è stato creato per tracciare i modelli di evoluzione clonali di linfoma diffuso a grandi cellule B (DLBCL) recidiva sfruttando VDJ ricombinazione e mutazione somatica (SHM), due caratteristiche uniche di linfomi a cellule B.

In questo protocollo, il sequenziamento di nuova generazione (NGS) librerie con potenziale di indicizzazione sono stati costruiti da amplificato immunoglobuline riarrangiato catena pesante (IgH) regione VDJ da coppie di diagnosi primaria e la recidiva DLBCL samples. In media più di mezzo milione di sequenze VDJ per campione sono stati ottenuti dopo il sequenziamento, che contengono sia VDJ riassetto e informazioni SHM. Inoltre, le condutture bioinformatica personalizzati sono stati sviluppati per utilizzare pienamente le informazioni di sequenza per la caratterizzazione di IgH-VDJ repertorio all'interno di questi campioni. Inoltre, il gasdotto permette la ricostruzione e confronto dell'architettura clonale dei tumori individuali, che consente l'esame della eterogeneità clonale nei tumori diagnosi e la deduzione di modelli di evoluzione clonali fra la diagnosi e le coppie di recidiva del tumore. Quando si applica questa analisi a diverse coppie di diagnosi-recidiva, abbiamo scoperto le prove chiave che più tumorali distintivo modelli evolutivi potrebbero portare a DLBCL ricaduta. Inoltre, questo approccio può essere esteso ad altri aspetti clinici, come l'identificazione della malattia minima residua, monitorare i progressi recidiva e la risposta al trattamento, e ricerca di repertorio immunitarioes in contesti non linfoma.

Introduzione

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Il cancro è una malattia clonale. Da trenta anni fa, quando Peter C. Nowell ha proposto il cancro clonale evoluzione del modello ^1, molti studi hanno cercato di sezionare popolazioni clonali in campioni di tumore e ricostruire espansione ed evoluzione modelli clonali che sono alla base del processo di tumorigenesi ^2. Recentemente, tutto il sequenziamento del genoma ha permesso agli investigatori di dare uno sguardo profondo alla eterogeneità clonale e l'evoluzione ^3,4. Tuttavia, a causa della mancanza di marcatori trattabili in molti tipi cellulari, è difficile dedurre la precisa architettura clonale e percorso evolutivo. Fortunat....

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Protocollo

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1. VDJ Amplificazione

1.1) Estrazione del DNA da campioni tumorali

Estrarre il DNA da sezioni sottili (10-20 micron) di congelati PTOM incorporati tessuti normali e maligni.
1. Digest 10-30 sezioni sottili di tessuto incorporato tagliato da un microtomo criostato in 4 ml Nucleic Lysis Buffer (0,0075 M Tris HCl, pH 8,2; 0,3 M NaCl; 0,002 M _Na 2 EDTA) con Proteinasi K (0,5 mg / ml, concentrazione finale ) e 0,625% SDS in una provetta da centrifuga da 15 ml in un bagno d'acqua per una notte a 37 °.
2. Aggiungere 1 ml di NaCl satura (5 M) alla miscela di digestione e agitare vigorosamente per 15 secondi. <....

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Risultati

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La procedura complessiva di VDJ sequenziamento (VDJ-seq), compresa l'estrazione del DNA, ricombinato VDJ regione amplificazione e purificazione, la costruzione della libreria sequenziamento, legge elaborazione e analisi filogenetica, è rappresentato in figura 1. Ordinariamente 5-200 mg DNA può essere recuperato da sezioni di tessuto solido congelato o 0,5-20 mg DNA da sezioni di tessuto incluso in paraffina fissati in formalina. A seconda della qualità, modello riarrangiamento e SHM grado di singoli.......

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Discussione

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A causa del numero quasi illimitato di iterazioni di informazioni sequenza codificata da VDJ riarrangiamento e SHM al locus IGH delle cellule B umane, l'esame di tutto il repertorio IGH da high-throughput deep-sequenziamento ha dimostrato di essere un modo efficace e completo per delineare clonale e le popolazioni di cellule B sub-clonali. Inoltre, questa strategia può essere usato per studiare il percorso evoluzione clonale di sviluppo delle cellule B tumorali, remissione e ricaduta confrontando le architetture clo.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare la dottoressa Rita Shaknovich e i membri di Elemento lab, Melnick lab e Tam lab per le discussioni ponderate. Vorremmo anche ringraziare la Genomics Resources Core Facility del Weill Cornell Medical College per aver eseguito il sequenziamento VDJ. YJ è stato sostenuto dall'ASH Scholar Award. WT e OE sono supportati dal Weill Cornell Cancer Center Pilot Grant. OE è supportato dal premio NSF CAREER, dallo Starr Cancer Consortium e dall'Hirschl Trust. Vorremmo anche ringraziare Katherine Benesch, JD, MPH per il suo generoso sostegno a questo progetto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Etanolo	VWR	89125-170	200 proof, per biologia molecolare
tampone TE	Life Technologies	12090-015	10 mM Tris· Cl, pH 8,0; 10 mM EDTA
xileni	VWR	EM-XX0055-6	500 ml
proteinasi K	Life Technonogies	25530-015	100 mg
Deossinucleotide trifosfato (dNTP) Soluzione Miscela	Promega	U1515	10 mM per nucleotide
10x tampone PCR	Roche	11699105001	senza MgCl₂
AmpliTaq DNA polimerasi d'oro con tampone d'oro e MgCl₂	Life Technonogies	4311806	50 &; l a 5 U/µ l
Scala di controllo delle dimensioni dei campioni	Invivoscribe Technologies	2-096-0020	33 reazioni
Saggio di ipermutazione somatica IGH v2.0 - Gel Detection	Invivoscribe Technologies	5-101-0030	33 reazioni, Mix 2 per la rilevazione IGVHFR1
Saggio di clonalità genica IGH - Rilevamento di gel	Invivoscribe Technologies	1-101-0020	33 reazioni, Provetta B per la rilevazione IGVHFR2
GoTaq Flexi DNA polimerasi	Promega	M8291	20 &; l a 5 U/µ l
10X tampone Tris-Borato-EDTA (TBE)	Corning (cellgro)	46-011-CM	6x1 L
50x TAE BUFFER	VWR	101414-298	1 L
Soluzione di bromuro di etidio	Sigma-Aldrich	E1510	10 mg/ml
25 bp DNA Ladder	Life Technologies	10597011	1 &; g/µ l
100 bp DNA Ladder	Life Technologies	15628-019	1 µ g/µ l
UltraPure Agarose	Life Technologies	16500-500	500 g
Soluzione di acrilammide/Bis al 40%	Bio-Rad Laboratories	1610144	500 ml
Kit di estrazione del gel QIAquick	Qiagen	28704	50 colonne
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Qubit dsDNA Kit di test ad alta sensibilità	Life Technologies	Q32854
Kit DNA ad alta sensibilità	Agilent Technologies	5067-4626
2100 Bioanalizzatore	Agilent Technologies
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
MiSeq	Illumina
Qubit 2.0 Fluorimetro	Life Technologies	Q32872
Tampone di risospensione (Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)	Illumina	FC-121-2001
Miscela di riparazione finale (Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)	A Illumina	FC-121-2001
(Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)	Miscela	FC-121-2001
(Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)	Illumina	FC-121-2001
Indice dell'adattatore del DNA (Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)	Illumina	FC-121-2001
Tampone di legatura di arresto (Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)	Illumina	FC-121-2001
(Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)	Miscela	FC-121-2001
(Kit di preparazione del campione di DNA Illumina TruSeq v2)	Illumina	FC-121-2001
Supporto magnetico	Life Technologies	4457858
Sistema di imaging su gel	Bio-Rad Laboratories	170-8370

Miscela di coda di legatura Illumina Cocktail di primer PCR master PCR Illumina

Riferimenti

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Nowell, P. C. The clonal evolution of tumor cell populations. Science. 194 (4260), 23-28 (1976).
Greaves, M., Maley, C. C. Clonal evolution in cancer. Nature. 481 (7381), 306-313 (2012).
Ding, L., et al.

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Sequenziamento VDJ Sequenziamento di Nuova Generazione Ipermutazione Somatica Estrazione del DNA Elettroforesi su Gel Pipeline Bioinformatica Analisi Filogenetica

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