Utilizzo di mitocondri isolati da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per High micropiastre rendimento respiratorie Misure

Summary

I metodi presentati forniscono istruzioni passo dopo passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre utilizzando mitocondri isolati da quantità minime di muscolo scheletrico di topo. Questi saggi sono in grado di misurare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Abstract

I mitocondri del muscolo scheletrico svolgono un ruolo specifico in molte patologie. Pertanto, la misurazione del consumo di ossigeno come indicatore della funzione mitocondriale in questo tessuto è diventata più diffusa. Sebbene esistano molte tecnologie e saggi che misurano le vie respiratorie mitocondriali in una varietà di cellule, tessuti e specie, attualmente c'è un vuoto in letteratura per quanto riguarda la compilazione di questi saggi utilizzando mitocondri isolati dal muscolo scheletrico di topo per l'uso in tecnologie basate su micropiastre. È importante sottolineare che l'uso di saggi respirometrici basati su micropiastre è in crescita tra i biologi mitocondriali in quanto consente misurazioni ad alta produttività utilizzando quantità minime di mitocondri isolati. Pertanto, è stata sviluppata una raccolta di saggi respirometrici basati su micropiastre in grado di valutare i cambiamenti/adattamenti meccanicistici nel consumo di ossigeno in un modello animale comunemente usato. I metodi qui presentati forniscono istruzioni dettagliate per eseguire questi saggi con una quantità ottimale di proteine mitocondriali e reagenti e un'elevata precisione, come evidenziato dalla varianza minima nell'intervallo dinamico di ciascun test.

Introduction

Il ruolo fisiologico principale mitocondri muscolari scheletriche è produrre ATP da fosforilazione ossidativa ^1. È importante sottolineare che i mitocondri dei muscoli scheletrici svolgono un ruolo specifico nella capacità di esercizio ^{2, 3} invecchiamento, malattia degenerativa ^{4 e} diabete di tipo II ^5. Come una società che invecchia, e diabete di tipo II è il ⁷ ° causa di morte negli Stati Uniti ^6, la necessità di metodi che valutano la funzione mitocondriale è diventato sempre più prevalente nella ricerca biomedica ^7,8. In particolare, la misurazione del consumo di ossigeno ha utilità eccezionale per la valutazione della funzione mitocondriale in quanto rappresenta la funzione coordinata tra genomi mitocondriali e nucleari per esprimere i componenti funzionali di fosforilazione ossidativa ^9.

Esistono diverse tecnologie che consentono la misurazione del consumo di ossigeno in cellule intatte e isolared mitocondri ^7-10. Inoltre, i saggi sono stati sviluppati per più tipi di cellule e tessuti, e in una varietà di specie che consentono la misurazione di percorsi mitocondriali e controllo respiratorio ^9,11,12. Tuttavia, non esiste attualmente un vuoto nella letteratura per quanto riguarda la raccolta di tutti questi saggi utilizzando mitocondri isolati da topo muscoli scheletrici per uso in tecnologie di consumo di ossigeno su micropiastra. È importante sottolineare che l'uso di micropiastra saggi respirometrici sta crescendo tra i biologi mitocondriali e consente misurazioni di throughput elevati con quantità minime di mitocondri isolati ^9. Pertanto, una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici sono stati sviluppati che permettono di individuare dove anomalie e / o adattamenti possono essere presenti nella catena di trasporto degli elettroni (ETC). Inoltre, due saggi respirometriche su micropiastra supplementare sono stati sviluppati che permettono la valutazione del coordinamento between l'acido (TCA) Ciclo tricarbossilici e l'ETC, e tra i ß-ossidazione e la ETC. È importante sottolineare che i metodi presentati forniscono un modo chiaro e conciso per misurare i cambiamenti meccanicistici nella funzione mitocondriale in un modello animale di uso comune.

Protocol

NOTA: Questo protocollo inizia dopo che si è isolato mitocondri dal muscolo scheletrico rosso. I mitocondri sono stati isolati come precedentemente descritto da ~ 75 - 100 mg di rosso muscolo scheletrico ^13. Tra 5-10 mg / mL di proteine ​​mitocondriali sarà raggiunto da questa quantità di tessuto risospendendo il pellet finale mitocondriale in ≤50 ml di buffer di isolamento per i mitocondri (IBM) 2 (Cfr Frisard et al ^13).

1. Setup

1. Preparare una soluzione madre (Tabella 1) e la soluzione di analisi mitocondriale (MAS) miscele (Tabella 2) per le analisi successive.
   Nota: La maggior parte della preparazione per i test può essere fatto in anticipo come la maggior parte delle soluzioni di titoli e MAS possono essere memorizzati.
2. Idratare una cartuccia test respirometrico in 1 ml di soluzione di calibrazione la sera prima l'esperimento in un non-CO _{2 incubatore} a 37 ° C.
3. Il giorno dell'esperimento, take fuori scorte congelate (substrati e modulatori mitocondriali, mix MAS, MAS w / o BSA, tabella 1) e disgelo a 37 ° C bagno o incubatore.
4. Preparare tutte le soluzioni di substrato (Tabella 3) e iniezioni (Tabella 4-5) e pH regolare, se lo desideri (pH 7,4). Dopo che il pH viene regolato, memorizzare su ghiaccio.
5. Programmare la macchina di misura del consumo di ossigeno più bene a giusto mix, aspettare, e parametri di misura (vedere Tabella 6) e lo sfondo dell'etichetta e di gruppo / condizione pozzi immettendo prima il software di analisi, seguita dalla modalità "Standard".
   1. Entra nel forum "Guest" e cliccare su "Assay Wizard". Una volta in "Assay Wizard", cliccare su "Protocollo" per cambiare miscela, aspettare, e misurare i parametri. Etichettare i pozzetti di fondo con il "Back. Correzione scheda "ed essere sicuri di evidenziare" Do correzione del fondo ".
   2. Etichetta condizioni di primo clic sulla scheda "Gruppi & etichette", quindi la scheda "Info Gruppo". Dopo questi parametri vengono immessi, fare clic su "Fine", seguito da "Salva modello".

2. Il test Run

1. Caricare le soluzioni di iniezione in una cartuccia sessione d'analisi e avviare la calibrazione inserendo prima il software di analisi, seguita entrando nella modalità "Standard". Entra nel forum "Guest". Aprire il modello salvato nel passaggio 1.5 sotto l'unità "XF", nella scheda "Modelli". Una volta aperta, fare clic su "Start" per iniziare la calibrazione.
   Nota: La cartuccia sessione d'analisi deve essere inserito nella macchina con l'angolo dentellato in basso a sinistra. Questa operazione richiede circa 30 min. Fare attenzione per iniettare soluzioni nelle porte appropriate. Iniezioni in Tabella 4-5 sono elencati in ordine di carico.
2. Delicatamente, ma mescolare bene il mitochondria magazzino agitando la soluzione con un puntale 200 pl, seguita dalla triturazione delicatamente il brodo con una pipetta punta di 200 microlitri, che ha avuto il suo orifizio ampliato tagliando ~ 3 mm l'estremità della punta con le forbici.
3. Eseguire un test dell'acido bicinconinico (BCA) per determinare la concentrazione di proteine ​​dello stock mitocondriale.
4. Utilizzando la concentrazione della acquisita dal punto 2.3, risospendere 10 mg di proteina mitocondriale / 200 microlitri della miscela substrato succinato / rotenone (Tabella 3). Risospendere 14 mg di proteina mitocondriale / 200 ml di rimanenti miscele di substrato (questo deve essere fatto per ogni miscela substrato) (tabella 3). Inserite tutte le proteine ​​mitocondriali / substrato mescola su ghiaccio.
   Nota: La quantità ottimale di proteine ​​mitocondriali per bene per ogni test è stato determinato come descritto in precedenza ^9. È stato stabilito che il piruvato / malato, palmitoil carnitina / malato, glutammato / malato und flusso di elettroni saggi utilizza 3,5 mg di proteina mitocondriale, mentre il saggio succinato / rotenone utilizza 2,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto. Pertanto, il ricercatore ha bisogno per sospendere di nuovo abbastanza proteine ​​mitocondriali per 4 repliche in questo passaggio in quanto o 2,5 mg o 3,5 mg ogni 50 ml viene caricato per bene (vedere il punto 2.6).
5. Mescolare le soluzioni mitocondri / substrato delicatamente, ma accuratamente agitando la soluzione con un puntale 200 pl, seguita dalla triturazione delicatamente il brodo con una pipetta punta di 200 microlitri che ha avuto ~ 3 millimetri della sua fine tagliati fuori.
6. Collocare una piastra di coltura cellulare su ghiaccio e in triplice copia, carico di 50 ml / pozzetto di ciascuna delle miscele mitocondri / substrato. Gli sviluppatori del saggio respirometrico micropiastra raccomandano lasciando un minimo di due vuoto (nessun mitocondri) pozzi, preferibilmente su entrambi i lati sulla piastra di coltura cellulare.
7. Spin piastra di coltura cellulare a 2.000 g per 20 minuti a 4 ° C. Mentre la piastra è spinning, riscaldare le soluzioni di substrato in un bagno d'acqua a 37 ° C.
8. Dopo la rotazione è completa, caricare accuratamente 450 ml di ciascuna soluzione di substrato sopra dei suoi rispettivi pozzetti (cioè, caricare il piruvato / malato substrato nei pozzetti che hanno mitocondri inizialmente risospese in questa soluzione di substrato). Accertarsi di caricare la piastra a temperatura ambiente. Nota: i pozzi vuoti devono essere caricati con 500 ml di substrato. Pozzetti del bianco designate per l'analisi del flusso di elettroni devono essere caricati con il substrato flusso degli elettroni (Piruvato / Malato + FCCP), mentre i test accoppiato pozzetti del bianco possono essere caricati con qualsiasi substrato test di accoppiamento.
   Nota: Se si effettuano le analisi di flusso di elettroni accoppiati e sulla stessa piastra, il ricercatore deve riassegnare pozzi di fondo ai rispettivi test dopo la sessione d'analisi è completa utilizzando la piattaforma "XF Reader" nella scheda "Instrument". Una volta all'interno l'impostazione "strumento", cliccare su "Amministrazione"scheda, seguito da "Correzione sfondo". Hit "End Modo Impostazioni dello strumento" al termine. Questo perché la combinazione di ascorbato / TMPD può consumare O _2, quindi una correzione del fondo separata è necessaria per ogni tipo di saggio.
9. Dopo il 450 ml di substrato viene aggiunta a ciascun pozzetto, visualizzare lo strato di mitocondri nel pozzo per garantire che i mitocondri sono dispersi uniformemente in un unico monostrato (20X di ingrandimento [Cfr Rogers ^9, Figura 4]). Wells che non sembrano avere un monostrato uniformemente distribuita possono essere rimossi post hoc.
10. Dopo aver controllato per l'adesione mitocondriale, inserire la microplacca nello strumento test respirometrico e avviare il test eseguito facendo clic su "OK".
    Nota: La calibrazione dal punto 2.1 deve essere completa prima che la corsa avrà inizio. Una volta che il ricercatore fa clic su "OK", la macchina viene espulso il piatto di utilità che è stato utilizzato per la calibrazione.
    1. Rimuovere la piastra utilità e posizionare la piastra di coltura cellulare che contiene i mitocondri sul vassoio. La tacca blu sulla piastra di coltura cellulare deve essere posto in basso a sinistra del vassoio. Clicca su "continua" per avviare la sessione d'analisi.
11. Dopo la corsa è terminata, estrarre la piastra di coltura cellulare e la cartuccia premendo il tasto "Eject" sullo schermo.
    1. Una volta che il piatto viene espulso, rimuovere ed eliminare la piastra di coltura cellulare e la cartuccia e fare clic su "Continua" sullo schermo. Il percorso sarà salvato automaticamente come file xls nel file "Dati".
12. Aprire questo file e modificare la visualizzazione da "O2" a "OCR" premendo la freccia verso il basso sotto il "Y1:" marcatore.
    1. Prossimo cambiamento "Middle Point" a "Point-to-Point tariffe" sotto la "Data Rate visualizza come:" l'opzione. Fare clic su "OK" per applicare le modifiche.
13. Fare clic sulla scheda "Modalità Gruppo Well" in basso a sinistra dello schermo per i pozzi di gruppo di condizioni simili insieme. Infine, fare clic sulla scheda "Campione Media / Standard Error" verso il centro dello schermo, a sinistra. In alternativa, questi comandi possono essere impostati prima che il test inizia l'impostazione "Assay Wizard".
    Nota: Ogni condizione avrà una media ± deviazione standard visualizzato per ogni classe e ogni condizione. Ci sono la misurazione della frequenza prese per condizione (Stato 2 [Accoppiamento] / State3u [Electron flusso] respirazione seguito da quattro iniezioni). Utilizzare la media della frequenza della seconda misura Stato 2, determinare Stato 4o al punto minimo dopo oligomicina iniezione, utilizzare il punto massimo per Stato 3 e 3u Stato dopo ADP e iniezione FCCP, rispettivamente, e utilizzare il punto di minimo per Antimicina A respirazione indotta per i saggi di accoppiamento. Utilizzare il punto di massimo per piruvato / malato indotta Stato 3u respirazione, utilizzare il minimopunto per rotenone indotta respirazione, utilizzare il punto di massimo per succinato indotta 3u Stato respirazione, e utilizzare il punto di minimo per Antimicina Una respirazione indotta per il saggio Electron Flow. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti 3 volte ed i dati indicati sono i risultati di un tracciato rappresentativo.

Results

La figura 1 rappresenta consumi di ossigeno (OCR) per la piruvato / malato, succinato / rotenone, palmitoil carnitina / malato, e glutammato / saggi malato (accoppiamento Assays). Questi tracciati del test vengono visualizzati come consumo di ossigeno Rate, o OCR, in funzione del tempo, sono sfondo correceted, e vengono visualizzati come i tassi di point-to-point. Ogni pannello rappresenta il consumo di ossigeno in diversi stati mitocondriali come descritto da Chance e Williams ^14. Il primo pannello rappresenta il consumo di ossigeno basale, o Stato 2. Il secondo pannello, dopo l'iniezione di ADP, rappresenta la massima accoppiato respirazione, o Stato 3. Il terzo pannello, dopo l'iniezione di oligomicina A (un inibitore del Complesso V), rappresenta la respirazione a causa a perdita di protoni, o dello Stato 4o. Il quarto pannello, dopo l'iniezione di FCCP, rappresenta la massima respirazione disaccoppiati, o 3U Stato. Infine, il quinto pannello, dopo l'iniezione di Antimicina A, rappresenta l'inibizione della respirazione ossidativa. In particolare, all stati mitocondriali hanno deviazione standard minimo. Ciò è dovuto alla completa miscelazione dello stock mitocondriale e miscele mitocondri / substrato, e il raggiungimento di un unico monostrato di mitocondri dopo lo spin aderenza (punto 2.6). D'altra parte, caricando mitocondri disuguali in ciascun pozzetto e non conseguire un singolo monostrato di mitocondri nel pozzetto della micropiastra porta ad un aumento deviazione standard in ogni stato come mostrato nella Figura 2.

I tracciati in figura 1 mostra gli altipiani per ogni stato mitocondriale e per ogni substrato. Il plateau raggiunta dopo due cicli di misurazione suggerisce buona qualità mitocondriale e che i mitocondri rimangono attaccati al bene per tutta la durata del test. Inoltre, il conseguimento dei tassi massimi raggiunto il plateau può essere più desiderabile poiché questo consente al ricercatore di prendere la media OCR questi stati mitocondriali, riducendo distorsione che può verificarsiselezionando un punto arbitrario.

La quantità di mitocondri per pozzetto è stato determinato mediante prove di ottimizzazione. La quantità ottimale di mitocondri per bene dovrebbe portare a Stato 2 tassi tra 100-200 pmol / min / e statali e 3 quote <1.500 pmol / min / bene, dal momento che questi valori sono all'interno del campo di rilevamento dell'ossigeno dinamica di ossigeno multi-bene macchina di misura del consumo. Caricamento troppe proteine ​​mitocondriale per pozzetto può comportare OCRs oltre la gamma dinamica dello strumento (Figura 3A). Figura 3 illustra il caricamento di 3,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto (tracciato blu) rispetto al carico 2,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto (rosso tracciamento) per il saggio succinato / rotenone. Caricamento troppe proteine ​​mitocondriale per pozzetto può anche portare all'esaurimento di ossigeno all'interno della microcamera del pozzo, impedendo così la misurazione accurata di OCR per ogni successiva misura ⁹ (Figura 3B </ strong>). Point-to-point OCR è il tasso istantaneo di variazione del OCR. Se piatta, l'OCR è costante / stabile, ma se in calo, allora ci potrebbe essere un problema biologico o tecnico. Il forte calo delle OCR in Stato 3 e la respirazione 3U Stato (figura 3A) è causata dai mitocondri estenuanti la fornitura di ossigeno prima della fine della misurazione (Figura 3B).

Figura 4 rappresenta OCR in funzione del tempo per il saggio flusso di elettroni. Il tracciato è corretto e visualizzato come descritto per Figura 1. Il primo pannello in questo test rappresenta Stato 3U respirazione su piruvato / malato via I. Complesso Il secondo pannello, dopo l'iniezione di rotenone, rappresenta l'inibizione del complesso I respiratorio mediata. Il terzo pannello, dopo l'iniezione di succinato, rappresenta il substrato stimolato 3U Stato con gli elettroni di entrare nel ETC al Complesso II (Complesso II respirazione mediata). Il quarto pannello, dopo l'iniezione di Antimycin A, rappresenta l'inibizione del complesso III e la respirazione quindi totale. Infine, il quinto pannello, dopo l'iniezione di acido ascorbico / TMPD, rappresenta Complesso IV respirazione mediata. Simili i tracciati in figura 1, tutti gli stati mitocondriali avere deviazione standard minimo, e ogni aliquota ha o quasi ha raggiunto un plateau.

Figura 1. accoppiamento Assays (A) malato piruvato 10 mM / 5 mM, (B) succinato / 2 mM rotenone, (C) 40 mM 1 malato palmitoil carnitina / mM, e (D) 10 mM glutammato / 10 mM. 10 mM malato accoppiato mitocondriali tracciati del test di respirazione come determinato dalla misurazione multi-bene di consumo di ossigeno. I valori sono espressi come media ± SD. Proteina mitocondriale caricato per bene è stata di 3,5 mg per tutti i test tranne succinato / rotEnone, che utilizza 2,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto. Dati rappresentano n = 3 repliche biologiche appaiati. OCR = consumo di ossigeno Tasso; ADP = adenosina difosfato; Oligo = Oligomicina A; FCCP = carbonile cyanide- 4 - (trifluorometossi) fenilidrazone; Anti-A = Antimicina A; PYR = piruvato; SUCC = succinato; ROT = Rotenone; PAL-C = palmitoil carnitina; GLUT = glutammato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. altamente variabili piruvato / malato Assay. Altamente variabile 10 mM piruvato / 5 mM saggio malato causati da incompleta mescolando mitocondri dallo stock mitocondriale nel substrato / mix MAS, determinando in tal modo pro mitocondriale variabileTEIN carico in ogni pozzetto. Proteina mitocondriale caricato per bene era di 3,5 mg. Dati rappresentano n = 3 repliche biologiche appaiati. OCR = consumo di ossigeno Tasso; ADP = adenosina difosfato; Oligo = Oligomicina A; FCCP = carbonile cyanide- 4 - (trifluorometossi) fenilidrazone; Anti-A = Antimicina A; PYR = piruvato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Il sovraccarico mitocondriale di proteine ​​per la succinato / Rotenone Assay. (A) consumi di ossigeno al di fuori della gamma dinamica della macchina di misura del consumo di ossigeno più pozzetti causato dal caricamento 3,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto (tracciato blu) rispetto al carico 2,5 mg di proteina mitocondriale per pozzetto (tracciato rosso). (B ) OxyGen tensione prossimi allo zero dopo ADP e iniezioni FCCP causati dal caricamento eccessivo proteina mitocondriale (3,5 mg) per bene (tracciato blu) rispetto al caricamento di una quantità ottimale (2,5 mg) di proteine ​​mitocondriali per bene (tracciato rosso). Dati rappresentano n = 3 repliche biologiche appaiati per quantità proteina mitocondriale. OCR = consumo di ossigeno Tasso; ADP = adenosina difosfato; Oligo = Oligomicina A; FCCP = carbonile cyanide- 4 - (trifluorometossi) fenilidrazone; Anti-A = Antimicina A; SUCC = succinato; ROT = Rotenone; O ₂ = ossigeno; mm Hg = millimetri di mercurio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Electron dosaggio a flusso. 5mM piruvato / 1 mM malato + 4 micron FCCP, elettrone fbasso mitocondriale tracciamento test respirazione come determinato dalla misurazione multi-bene di consumo di ossigeno. I valori sono espressi come media ± SD. Proteina mitocondriale caricato per bene era di 3,5 mg. Dati rappresentano n = 3 repliche biologiche appaiati. OCR = consumo di ossigeno Tasso; Anti-A = Antimicina A; Asc = ascorbato; TMPD = N, N, N ', N' -tetramethyl- pag fenilendiamina. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Reagente	Concentrazione di stock	MW	Volume finale	Messa Aggiunto	Commenti / Descrizione
	(M)	(g / mol)	(ml)	(go ml)
EGTA, pH 7,2	0.1	380,35	100 ml di 1M Tris Base	3,801 g	Conservare a 4 ° C
HEPES	1	238,3	250 ml di DIH 2 O	59. 57 g	Conservare a 4 ° C
MgCl 2, esaidrato	1	203,31	250 ml di DIH 2 O	50.82 g	Conservare a 4 ° C
Piruvato pH 7,4	0.1	88.06 (14.11 M Viene come soluzione)	40 ml di DIH 2 O	0,283 ml di acido piruvico	Fai 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C, rendono fresco ogni due settimane
Succinate pH 7,4	0.5	118.09	100 ml di dih 2 O	9,4 g di suAcido ccinic	Fai 1 ml aliquote e conservare a -20 ° C
Malate, pH 7,4	0.5	134.09	100 ml di etanolo al 95%	6,7 g di acido malico	Rendere 200 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C
TMPD	0.01	164.25	10 ml	0,0164 g	Rendere 300 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C; Mescolare con una quantità equimolare di ascorbato per mantenere TMPD ridotto
Palmitoil L-carnitina cloruro	0.01	436,07	1,14 ml di etanolo al 95%	0.005 g	Fai 40 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C
Oligomicina A	0.006	791,06	0,987 ml di etanolo al 95%	0.005 g	Fai 20 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C
FCCP	0.01	254,17	3,9 ml di etanolo al 95%	0,01 g	Fai 40 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C
Rotenone	0.001	394,4	10 ml di etanolo al 95%	0,0039 g	Conservare a -20 ° C
Antimicina A	0.005	548,63	9.12 ml di etanolo al 95%	0.025 g	Conservare a -20 ° C
K + ADP	0.5	501,32	3,9 ml di dih 2 O	1,0 g	Conservare a -20 ° C
Acido malico, pH 7,4	0.5	134.09	40 ml	2.68 g	Rendere 200 microlitri aliquote e conservare a -20 ° C

Immagini Solutions

Reagente	Concentrazione di stock	Messa Aggiunto	Molarità Finale / Percentuale
	(M)	(go ml)
Saccarosio	-	11.98 g	70 MM
Mannitolo	-	20.04 g	220 mm
Potassio fosfato monobasico	-	0,34 g	5 mM
MgCl 2, esaidrato	1	2,5 ml	5 mM
HEPES	1	1,0 ml	2 mm
EGTA	0.1	5.0 ml	1 mM
Essenzialmente acidi grassi Free-BSA	-	1,0 g	0.20%

. Tabella 2. MAS Mix pH 7.4, 500 ml: 25 ml aliquote e conservare a -20 ° C * Nota: Escludere BSA per mix MAS usato per le iniezioni di analisi.

Substrato media	Concentrazione finale	Quantità di magazzino (ml)	Importo del MAS * (ml)
Piruvato / Malate	10 mM / 5 mM	Piruvato: 1.000	9
		Malate: 100
Succicinate / Rotenone	10 mm / 2 micron	Succinate: 200	10
		Rotenone 20
* Piruvato / Malato + FCCP	5 mm / 1 mm / 4 micron	Piruvato: 500	10
		FCCP: 4
		Malate: 20
Palmitoil L-carnitina / Malate	40 mM / 1 mM	Palmitoylcarnitine: 40 Malate: 20	10
Il glutammato / Malate	10 mM / 10 mM	Il glutammato: 400	10
		Malate: 200

Tabella 3. substrato Soluzioni pH 7,4: Rendere fresco il giorno dell'esperimento. * Soluzione test flusso di elettroni.

Iniezione media	Concentrazione	Quantità di magazzino (ml)	Importo del MAS (ml)	Importo iniettato nella cartuccia	Concentrazione finale
					(Dopo iniettato in lamiera)
ADP	50 mm	300 microlitri	3	50 microlitri	5,0 mm
Oligomicina A	20 micron	10 microlitri	3	55 microlitri	2.0 micron
FCCP	40 mM	12 ml	3	60 microlitri	4,0 micron
Antimicina A	40 mM	24 microlitri	3	65 microlitri	4,0 micron

Tcapaci 4. Iniezioni di saggi accoppiate pH 7,4:. Rendere fresco il giorno dell'esperimento. * Analisi di accoppiamento includono (ma non sono limitati a) piruvato / malato, succinato / rotenone, palmitoil carnitina / malato, e il glutammato / malato.

Iniezione media	Concentrazione	Quantità di magazzino (go ul)	Importo del MAS (ml)	Importo iniettato nella cartuccia	Concentrazione finale (dopo iniettato in lamiera)
Rotenone	20 micron	60 microlitri	3	50 microlitri	2.0 micron
Succinate	50 mm	300 microlitri	3	55 microlitri	5,0 mm
Antimicina A	40 mM	24 μ; l	3	60 microlitri	4,0 micron
TMPD / Ascorabte	1 mM, 100 mM	TMPD: 300 ml	3	65 microlitri	100 micron, 10mm
		Ascorbato: 0.059 g

Tabella 5. Iniezioni per il flusso di elettroni test pH 7,4:. Fai fresco il giorno dell'esperimento

Comando	Tempo (min)	# Dei cicli
Calibrare
Aspettare	10 minuti (per consentire targa di riscaldarsi dal passo aderenza)
Mescolare	1 minuto	2
MeAsure	2 min
Iniettare A
Mescolare	1 minuto	2
Misura	2 min
Iniettare B
Mescolare	1 minuto	2
Misura	2 min
Iniettare C
Mescolare	1 minuto	2
Misura	2 min
Iniettare D
Mescolare	1 minuto	2
Misura	2 min

Tabella 6. Strumento Run protocollo.

Discussion

I metodi presentati in questo articolo forniscono le istruzioni passo-passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici utilizzando mitocondri isolati 75-100 mg di topo muscoli scheletrici. Questi saggi possono essere eseguite con alta precisione come evidenziato dalla deviazione standard stretto tra i pozzetti in triplicato. È importante sottolineare che questi test permettono di individuare respirometriche di dove anomalie e / o adattamenti possono essere presenti nel ETC, ciclo TCA, β-ossidazione percorso, trasportatori substrato, ecc in un modello animale di uso comune.

E 'importante sottolineare il razionale per l'utilizzo di diversi combustibili e inibitori utilizzati in questo protocollo. Il piruvato / malato e glutammato / malate saggi respirometrici permettono la valutazione del complesso I respirazione mediata, nonché la valutazione dei rispettivi trasportatori, e nel caso di glutammato, deaminasi ^15. In alternativa, la combinazione disuccinato / rotenone permette di valutare il flusso respiratoria mitocondriale attraverso Complesso II della ETC da rotenone inibisce complesso I e succinato fornisce elettroni Complesso II attraverso la riduzione della flavina adenina dinucleotide (FADH ₂₎ ^15. Questi test forniscono informazioni specifiche substrato da efficienza di accoppiamento e la respirazione massima. Il test di flusso di elettroni è unico in quanto la combinazione di substrati e inibitori permette di valutare più complessi durante flusso respiratoria mitocondriale ^9. Il mix substrato iniziale di piruvato / malato + FCCP permette la valutazione della respirazione massima guidato da complesso I, mentre l'iniezione di rotenone seguita da succinato consente la respirazione valutazione massima spinto da Complesso II. L'iniezione di Antimicina A, un inibitore del complesso III, seguito dall'iniezione di ascorbato / TMPD consentono per la valutazione della respirazione guidata da Complesso IV poiché l'ascorbato / TMPD è undonatore di elettroni di citocromo C / Complesso IV. Mentre si ottiene nessuna informazione sulla efficienza di accoppiamento, il metodo è ideale per molto campioni di piccole dimensioni che precludono l'esecuzione di più supporti in modo indipendente. Infine, l'uso di palmitoil carnitina / malato consente la valutazione del coordinamento tra β-ossidazione e l'ETC in quanto l'equivalente riducendo prodotta dalla ossidazione di acido palmitico (β-ossidazione) alimentato nel ETC attraverso l'elettrone trasferimento flavoproteina ^15. Va notato che i saggi di flusso di accoppiamento e di elettroni possono essere usati anche in tandem per identificare cambiamenti nella funzione mitocondriale causa di qualche intervento (trattamento farmacologico, manipolazione genetica).

L'elevata precisione conseguito per questi test è dovuto principalmente alla completa miscelazione dei mitocondri, sia prima della determinazione della proteina, o con le soluzioni del substrato. Lungo queste linee, una volta che i mitocondri è resuspendend nel solutio substratons, è fondamentale mescolare questa soluzione accuratamente prima di caricare la piastra di coltura cellulare come descritto al punto 2.2, con una punta foro pipetta allargata. La mancata mescolare i mitocondri accuratamente porterà a grande variazione nel dosaggio. Inoltre, utilizzando un sottile puntale orifizio creerà forze di taglio durante la miscelazione mitocondri e aumenta il potenziale di danneggiare le membrane mitocondriali e il rilascio di citocromo C. La fase aderenza (2.7) è anche un passo fondamentale in questo protocollo. La mancata girare la piastra di coltura cellulare carico lungo / abbastanza veloce si tradurrà in aderenza incompleta dei mitocondri al pozzo, determinando in tal modo una maggiore variabilità tra i pozzi e le misurazioni.

Il protocollo descritto è stato ottimizzato per includere: il caricamento di una quantità ottimale di proteine ​​mitocondriali per pozzetto, utilizzando le corrette concentrazioni / metodi di preparazione per fare azionari e substrato soluzioni, alterando la sessione d'analisi per garantire mitocondriale pla statoteaus, e adeguata miscelazione dei mitocondriali azionari e mitocondriale / substrato mix. Prima di questi sforzi di ottimizzazione, gli autori incontrano insidie ​​nella corsa dosaggio. Di seguito si illustrano i metodi di risoluzione dei problemi / modifiche che erano utile per ottimizzare questo protocollo. Per quanto riguarda il carico ottimale, carico troppo poco mitocondri non suscitare una risposta forte, durante il caricamento di troppo mitocondri, si esaurirà la dell'ossigeno all'interno della microcamera e portare a misurazioni imprecise. Rogers et al ⁹ fornisce esempi di determinazione ottimale quantità di carico dei mitocondri per pozzetto per micropiastra saggi respirometrici. Più spesso, troppo mitocondri viene caricato per bene come evidenziato dallo stato 2 quote sopra 100-200 pmol / min / bene e stato 3 quote> 1500 pmol / min / bene. Se si verifica sopra caricamento, eseguire un esperimento con diverse concentrazioni di proteina mitocondriale (per esempio tra 1 -. 10 mg) per sollecitare OCRs all'interno r dinamicaange della macchina di misura del consumo di ossigeno. Operazioni preliminari e la corretta concentrazione di substrati e degli stock è della massima importanza. Usare sempre la forma di substrati / iniezioni e regolare il pH con idrossido di potassio o HCl; tamponi di sodio / soluzioni non sono raccomandati. Inoltre, i substrati risospendendo / scorte in DMSO o etanolo al 100% si tradurrà in un fallimento o un errore di misura. Assicurarsi di utilizzare il 95% di etanolo dove indicato. E 'comune per palmitoil carnitina per precipitare fuori dalla etanolo al 95% dopo lo scongelamento dello stock congelato, causando grande variabilità. Assicurarsi di scaldare il brodo palmitoil carnitina e vortice bene prima dell'uso. Inoltre, un piruvato / malato risultato saggio altamente variabile può essere dovuto all'essere piruvato magazzino> 2 settimane di vita. Assicurati di rifare aliquote congelate di piruvato ogni 2 settimane. La sessione d'analisi è stato modificato per 2 min misure per garantire altipiani statali mitocondriali. Se si desidera l'osservazione di esaurimento della ADP, il ricercatore puòestendere il tempo di misura nella scheda "Protocollo" sotto il forum "Assay Wizard". Infine, grande variabilità si verifica quando il azionari mitocondriale e mitocondri più substrato soluzioni non sono omogeneizzati completamente prima del carico. Se la variabilità tra i pozzi è alta dopo la sessione d'analisi, assicuratevi di mescolare completamente la soluzione di substrato prima del prossimo esperimento. Mai vortice le soluzioni mitocondri / substrato, piuttosto mescolare, mash, e triturare delicatamente con la punta della pipetta foro allargato.

Ci sono alcuni limiti di questa tecnica che sono degni di nota. In primo luogo, il numero di pozzetti sulla piastra di coltura cellulare utilizzato per questi test è relativamente bassa (cioè., 24 pozzetti e almeno 2 designata per pozzetti di bianco). Se si desidera eseguire tutti 5 di questi saggi su una piastra, il ricercatore è solo in grado di esaminare le risposte da un mouse alla volta. Tuttavia, va notato che gli strumenti 96 e sono disponibili per higheil throughput r. In secondo luogo, ci sono punti di forza e di debolezza insiti nella valutazione disfunzione mitocondriale nei mitocondri isolati rispetto al cellule intatte ^1. Alcune debolezze includono avente rilevanza fisiologica meno rispetto alle cellule intatte e che inducono artefatti dal processo di isolamento. Infine, il successo di questo metodo è subordinato alla qualità del processo di isolamento mitocondriale.

Sebbene alcuni di questi saggi sono stati sia sviluppate in sistemi differenti o sono stati convalidati in altri modelli animali, i metodi qui presentati sono i primi di sintetizzare tutte le saggi suddetti per l'utilizzo ottimale in un multi-well macchina di misura del consumo di ossigeno usando il mouse muscolo scheletrico. È importante sottolineare che tutti e 5 di queste analisi può essere eseguita con la quantità di mitocondri isolati da ~ 75 - 100 mg di topo muscoli scheletrici, fornendo in tal modo un elevato throughput con il materiale minimo. Di grande importanza, la capacità di multi-welltecnologie consumo di ossigeno per eseguire saggi con quantità minime di mitocondri, combinate con un metodo di isolamento ottimizzato, permette al ricercatore di eseguire una moltitudine di altri esperimenti con il resto del tessuto muscolare scheletrico (ad es., western blot, RT-PCR, saggi enzimatici, ecc), che è spesso una lotta con questo modello animale.

In conclusione, i metodi qui presentati forniscono istruzioni passo-passo per l'esecuzione di una raccolta di saggi su micropiastra respirometrici utilizzando quantità minime di topo muscoli scheletrici. Soprattutto, i metodi presentati richiedono minime quantità di tessuto e mitocondri. Una volta masterizzato, le tecniche qui descritte consentiranno ai ricercatori di determinare un potenziale meccanismo di un prodotto composto o gene sul consumo di ossigeno mitocondriale in un modello animale comunemente utilizzato.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccarosio	Sigma Aldrich	S7903	Conservare presso RT
D-mannitolo	Sigma Aldrich	63559	Conservare presso RT
Fosfato di potassio monobasico, minimo 99,0%	Sigma Aldrich	P5379	Conservare presso RT
Cloruro di magnesio esaidrato, reagente ACS, 99,0-102,0%	Sigma Aldrich	M9272	Conservare presso RT
HEPES titolazione	minima del 99,5%Sigma Aldrich	H3375	Negozio presso RT
EGTA	Sigma Aldrich	E4378	Negozio presso RT
Essenzialmente grasso	Sigma Aldrich	A6003	Negozio a 4 gradi Senza acido C
BSA
, 98%	Sigma Aldrich	107360	Conservare a 4 ° C
Acido Succinico	Sigma Aldrich	S9512	Negozio presso RT
L (-) Acido Malico, BioXtra, ≥ 95%	Sigma Aldrich	M6413	Negozio presso RT
Acido L-glutammico	Sigma Aldrich	G1251	Negozio presso RT
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine	Sigma Aldrich	T7394	Negozio presso RT
99%, polvere [TMPD]
Palmitoyl L-carnitina cloruro	Sigma Aldrich	P1645	Negozio a -20 ° C
Oligomicina A, ≥ 95% (HPLC)	Sigma Aldrich	75351	Conservare a -20 C
Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)	Sigma Aldrich	C2920	Conservare a 2 - 8 gradi C
fenilidrazone
≥ 98% (TLC), polvere [FCCP]
Antimicina A da streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674	Negozio a -20 C
Adenosina 5′-difosfato sale monopotassico disidratato [ADP]	Sigma Aldrich	A5285	Conservare a -20 ° C
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875	Negozio presso RT
Pierce™ Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Thermo Scientific	23225	N/A