Riportiamo miglioramenti significativi per la misurazione riproducibile delle mutazioni somatiche delle cellule staminali del colon dopo l'esposizione di topi a potenziali agenti dannosi per il DNA.
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Articolo metodologico
Quantificazione del colon le mutazioni delle cellule staminali
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali è un potente strumento per quantificare in una popolazione di cellule critico se, e in quale misura, una sostanza chimica può indurre mutazioni che potenzialmente portano al cancro. L'uso di un saggio enzimatico per quantificare mutazioni di cellule staminali nel gene di glucosio-6-fosfato deidrogenasi X-linked è stata riportata in precedenza. 1 Questo metodo richiede la preparazione di sezioni congelate e incubazione del tessuto sezionato con una miscela di reazione che produce un colore blu se le cellule producono funzionale glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) enzima. In caso contrario, le cellule appaiono biancastro. Abbiamo modificato la miscela di reazione utilizzando ottimali di taglio Temperatura composto (OCT) media al posto di alcool polivinilico. Ciò facilita la misura di pH, aumenta solubilizzazione dei componenti colorazione G6PD e limita la diffusione dell'enzima G6PD. Per dimostrare che una mutazione si è verificata in una cellula staminale, l'intera cripta deve mancare G6PD enzimaticaattività. Solo se una cellula staminale ospita una mutazione G6PD fenotipica saranno tutti della progenie nella cripta mancano attività enzimatica G6PD. Per identificare cripte con una mutazione di cellule staminali, quattro sezioni congelate adiacenti consecutivi (un livello) sono stati tagliati a 7 micron di spessore. Questo approccio di effettuare tagli adiacenti fornisce conformazione che una cripta era completamente mutato in quanto la stessa cripta mutato sarà osservato in sezioni adiacenti. Vetrini con campioni di tessuto che sono stati più di 50 micron a parte erano pronti a valutare un totale di> 10 4 cripte per mouse. La frequenza di mutazione è il numero di mutanti (bianco) cripte osservati ÷ per il numero di tipo selvatico (blu) cripte in un gruppo di trattamento.
Introduzione
Il cancro del colon è pensato di coinvolgere l'esposizione ad agenti ambientali e componenti della dieta che possono danneggiare il DNA e produrre l'attivazione di mutazioni somatiche in oncogeni (per esempio, ß-catenina) o mutazioni inattivanti in geni oncosoppressori (ad esempio, APC). Si presume che queste mutazioni critiche si verificano in cellule staminali del colon. A causa dell'architettura cripta unica dell'epitelio del colon, è possibile misurare mutazioni di cellule staminali nel colon dopo l'esposizione a sostanze chimiche animali associati carcinogenesi del colon. Diversi enzimi X-linked possono servire come indicato....
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Protocollo
Le procedure sperimentali e trattamento etico degli animali è stato approvato dal l'Università di Pittsburgh IACUC (protocollo # 1.104.674).
1. Preparazione di G6PD colorazione Miscela
NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di ogni reagenti è il seguente; 5 mM di glucosio-6-fosfato (G6P); 2 NADP mM, 5 mM MgCl 2, NBT mM 0,35 mm 1-metossi-5-metil methylphenazinium solfato (MMPMS) e 0,8. 1,8,9 Per ogni reagente la concentrazione iniziale è stata derivata per 40 ml di volume finale. Soluzioni sono state preparate al momento e utilizzati ogni giorno.
- Aggiungere 2 ml di 200 mM pH 7,4 tampone ....
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Risultati
La capacità di misurare mutazioni di cellule staminali del colon negli animali fornisce un modo unico per correlare le mutazioni a induzione di cancro. Normalmente, si presume che il passaggio critico nella carcinogenesi comporta mutazioni attivanti in oncogeni e / o inattivazione mutazioni in geni oncosoppressori. Abbiamo iniettato Topi C57BL / 6 con 200 microlitri di PBS o 10 mg / kg AOM in 200 ml di PBS. AOM è un agente cancerogeno del colon conosciuto. 5-7 A 90 giorni i due punti sono stati analizzati per.......
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Discussione
Spesso l'effetto genotossico di un composto è determinata dalla sua capacità di modificare il DNA. Questo avviene normalmente isolando il tessuto e misurando il livello globale di addotti di DNA. Per AOM, ciò comporterebbe la quantificazione O 6 -methylguanine addotti nel colon. Utilizzando queste informazioni approccio sui danni entro specifici tipi cellulari, come ad esempio nella nicchia delle cellule staminali, è perduto. Inoltre, un addotto DNA non è la stessa come una mutazione in quanto solo un pic.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno riconoscimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| reagenti: | |||
| nitroblu, tetrazolio, | |||
| NADP | |||
| glucosio-6-fosfato | |||
| 1-metossi-5-metilfenazinio metil solfato | |||
| dimetil formammide | |||
| fosfato, tampone (pH 7,4 | |||
| Composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) | |||
| Attrezzatura | |||
| microscopio ottico dotato di camera | |||
| criostato | |||
| camera calda |
Riferimenti
- Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
- Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D.
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Ristampe e permessi
