Articolo metodologico

Turbativa Anti-virulento di patogeni biofilm utilizzando Engineered Quorum-tempra Lactonases

DOI:

10.3791/53243

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1 gennaio 2016

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1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, 2Department of Chemistry, University of Utah, 3Synthetic Biology Research Consortium, National University of Singapore

In questo articolo

Sommario

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Gli enzimi di estinzione del quorum sono opzioni anti-virulente e anti-batteriche che possono mitigare la patogenesi senza il rischio di incorrere in resistenza, impedendo l'espressione di fattori di virulenza e geni associati alla resistenza agli antibiotici e alla formazione di biofilm. In questo studio, riportiamo un metodo che dimostra l'efficacia degli enzimi quorum-quenching nella disgregazione del biofilm batterico.

Abstract

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La rapida comparsa di batteri multiresistenti ai farmaci ha accelerato la necessità di nuovi approcci terapeutici per contrastare le infezioni potenzialmente letali. La persistenza dell'infezione batterica è spesso associata alla formazione di biofilm mediata dal quorum-sensing. Pertanto, l'interruzione di questo circuito di segnalazione presenta un'interessante strategia anti-virulenza. È stato riportato che le lattonasi che estinguano il quorum sono efficaci interferenti dei circuiti quorum-sensing. Tuttavia, ci sono state pochissime segnalazioni dell'uso efficace di questi enzimi nell'interrompere la formazione del biofilm batterico. Questo protocollo descrive un metodo per interrompere la formazione di biofilm in un ceppo clinicamente rilevante di A. baumannii S1 attraverso l'uso di una lattonasi ingegnerizzata per estinguere il quorum. L'Acinetobacter baumannii è un importante patogeno umano implicato in gravi infezioni nosocomiali a livello globale e la sua virulenza è attribuita principalmente alla tenacia del suo biofilm. Il trattamento ingegnerizzato con lattonasi ha ottenuto una significativa riduzione del biofilm di A. baumannii S1. Questo studio ha anche mostrato la possibilità di utilizzare enzimi ingegnerizzati per l'estinzione del quorum nel futuro trattamento delle malattie batteriche mediate da biofilm. Infine, il metodo può essere utilizzato per valutare la competenza di promettenti enzimi di estinzione del quorum.

Introduzione

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Le opzioni di trattamento per le malattie infettive sono state complicate dal rapido aumento di batteri multiresistenti che sono immuni a una vasta gamma di farmaci antibiotici 1. Con l'alta morbilità e mortalità da infezioni batteri mediata resistenti, vi è la necessità di intensificare i processi di sviluppo di droga e / o esplorare alternative migliori antibatterici per migliorare le opzioni terapeutiche. Ultimamente, l'approccio anti-virulenza sta guadagnando interesse dato il suo potenziale nella prevenzione virulenza attraverso media non battericida, quindi mitigare i rischi del meccanismi di resistenza 2.

Quorum-sensing è un 'interruttore generale' nella virulenza batterica e la rottura di questo fenomeno di segnalazione è un metodo anti-virulenza promettente contro patogenesi 3. L'insorgenza della virulenza richiede l'accumulo di molecole quorum nell'ambiente extracellulare dopo aver raggiunto una densità di popolazione batterica critica. Come quomolecole rum diffondono nella matrice intracellulare, legandosi con i loro recettori cognate porta all'attivazione di fattori di virulenza e geni associati con resistenza agli antibiotici e formazione di biofilm 4. In generale, l'interruzione del quorum sensing comporta inibendo molecola quorum e recettore senza influenzare le principali vie metaboliche. Quindi, non ha alcuna implicazione diretta sulla crescita cellulare. Dal momento che il fitness non è compromessa, c'è minima pressione selettiva per i batteri ad evolversi e acquisire resistenza contro tali trattamenti 5. Inoltre, l'interruzione quorum-sensing può interferire con i meccanismi di protezione batterici intrinseci, come nel caso della formazione del biofilm, che fornisce protezione dagli agenti antibatterici e risposta immunitaria.

Si stima che il 99% dei microbi sulla Terra esiste in matrici complesse come biofilm, le conferisce dei vantaggi di sopravvivenza fondamentali per i microrganismi che vivono all'interno thstrutture ESE 6. Ancora più importante, la formazione di questi domini sessili è la causa della maggior parte delle infezioni persistenti e croniche nosocomiali 7. Acinetobacter baumannii è uno dei principali agenti patogeni umani che è associato a infezioni contratte in ospedale globali e la sua virulenza è in gran parte attribuito al quorum sensing formazione di biofilm mediata 8. Enzimi tempra quorum sono stati utilizzati con successo in interrompere quorum mediata trasduzione del segnale di mira un gruppo di composti noti come N -acyl lattoni Homoserine (AHLs) che sono prodotte da batteri Gram-negativi 9. Diversi studi hanno inoltre ampliato sull'uso di questi enzimi per bloccare patogenesi batterica attraverso la riduzione dei numeri di espressione fattore di virulenza e di cella in biofilm 10,11. Purtroppo, permane una mancanza di manifestazione palpabile di un uso efficace di enzimi-quorum tempra contro la formazione di biofilm da batteri patogeni. Ilre sono stati tentativi di utilizzare gli inibitori del quorum (analoghi AHL), invece di enzimi quorum-tempra, di interrompere A. baumannii biofilm formazione 12. Anche se questo metodo di utilizzo di piccole molecole inibitori è un valido approccio, sostenendo la sua biodisponibilità negli usi traslazionali può essere una sfida. Al contrario, l'utilizzo di enzimi quorum tempra catalitici potrebbe aggirare il problema biodisponibilità come enzimi sono più suscettibili verso l'immobilizzazione su superfici di dispositivi biomedicali per effetti terapeutici.

Qui, descriviamo una valutazione degli effetti della ingegnerizzati-quorum tempra lactonases da Geobacillus kaustophilus (GKL) 13 sulla formazione di biofilm batterico, utilizzando colorazione cristallo viola e microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Questo studio è il primo dimostrazione riuscita di interruzione biofilm in una clinicamente rilevante A. ceppo baumannii S1 utilizzando enzimi quorum-tempra. I metodi descrittiin questo studio sono utili per valutare l'efficacia di altri enzimi quorum tempra nei successivi sforzi di sviluppo terapeutici contro i batteri Gram-negativi patogeni.

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Protocollo

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1. cristallo viola Quantificazione di formazione di biofilm in A. baumannii S1

  1. Grow una cultura 5 ml di A. baumannii S1 in lisogenia brodo (LB) (triptone 10 g / L, estratto di lievito 5 g / L) a 30 ° C in un incubatore scuotimento (220 rpm) per 16 ore.
  2. Regolare la cultura della A. baumannii S1 ad una OD 600 di 0,8 desiderato. Utilizzando una piastra a 96 pozzetti, inoculare la coltura batterica (diluizione 1: 100) in fresco LB contenente 10 ml di enzima purificato GKL (40 mg / ml); volume finale della nuova cultura è 100 l.
  3. Preparare una coltura di controllo pure; questo non conterrà alcun enzima. Ripetere condizioni simili a cedere il numero desiderato di repliche.
  4. Coprire la piastra con un coperchio e metterlo in un contenitore di plastica 10 L sigillato. Incubare la piastra a 30 ° C per 3 ore prima di rimuovere delicatamente il supporto.
  5. Aggiungere altri 100 ml di mezzo fresco LB al pozzetto ed incubare la piastra per 21 ore a 30 ° C.
  6. Dopo il secondo periodo di incubazione, rimuovere delicatamente tutti i media. Lavare il cellulare dei batteri planctonici con 200 ml di acqua sterile. Assicurarsi che vi sia solo il minimo disturbo alle cellule durante il lavaggio.
  7. Aggiungere 100 ml di soluzione al cristalvioletto 1% ad ogni pozzetto ed incubare per 15 minuti a RT. Rimuovere la soluzione cristalvioletto lavando il bene con 200 microlitri di acqua sterile. Ripetere il lavaggio per altre due volte.
  8. Aggiungere 100 ml di 33% di acido acetico ad ogni pozzetto e incubare per 15 minuti agitando delicatamente; questo si dissolverà il colorante.
  9. Quantificare la quantità di biofilm formata misurando l'assorbanza di cristalvioletto a 600 nm. La quantità di cristalvioletto è proporzionale alla quantità di biofilm formato.

2. Microscopia confocale a scansione laser di A. baumannii S1 biofilm

  1. Grow una cultura 5 ml di A. baumannii S1 in LB a 30 ° C in un incubatore scuotimento (220 rpm) per 16 ore.
  2. Anno Dominisolo la cultura di A. baumannii S1 ad una OD 600 di 0,8 desiderato. Utilizzando un fondo di vetro μ-Dish 35 mm, inoculare la coltura batterica (diluizione 1: 100) in fresco LB contenente 30 ml di purificata GKL enzima (40 mg / ml); volume finale della nuova cultura è di 1 ml.
  3. Coprire il μ-Piatto con un coperchio e metterlo in un contenitore di plastica sigillato 10 L. Incubare la μ-Dish a 30 ° C per 3 ore prima di rimuovere delicatamente il supporto. Aggiungere 30 ml di enzima purificato GKL e mezzo fresco, portando ad un volume totale di 1 ml. Incubare per 21 ore a un'altra 30 ° C.
  4. Ripetere il passaggio 2.3 e incubare la μ-Dish per un altro 24 ore a 30 ° C. Quindi, rimuovere il supporto delicatamente.
  5. Aggiungere 500 pl di 5 mg / ml Alex Fluo 488-coniugato agglutinina di germe di grano (WGA) disciolto in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a μ-piatto e incubare a 37 ° C per 30 min; questo si macchia il biofilm formato. Rimuovere la soluzione colorante e lavare tegli μ-Piatto con 2 ml di HBSS. Ripetere la fase di lavaggio ancora una volta.
  6. Aggiungere 500 ml di 3,7% di formaldeide sciolto in HBSS e incubare a 37 ° C per 30 min; questo risolverà il biofilm sul μ-Dish. Lavare il μ-piatto una volta con 2 ml di HBSS e quindi rimuovere completamente la soluzione. La μ-Dish fissa con biofilm può essere conservato al buio a 4 ° C prima di imaging CLSM.
  7. Per CLSM di imaging e di analisi, utilizzare 63 ingrandimenti per generare 97 pile per immagine con un intervallo di 0,21 micron per stack.

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Risultati

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Nell'esperimento quantificazione cristallo viola, due enzimi quorum-tempra sono stati usati per dimostrare la fattibilità a interrompere la formazione di biofilm: wild-type GKL e una migliore doppio mutante GKL (E101G / R230C). Entrambi gli enzimi sono stati indicati per dimostrare l'attività lactonase contro 3-idrossi-L-decanoil-omoserina lattone (3-OH-C 10 -HSL), la principale molecola quorum utilizzato da A. baumannii S1 14. Per valida la valutazione di ...

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Discussione

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In entrambe le serie di esperimenti, A. baumannii S1 è stato coltivato in LB media senza NaCl come concentrazione di sali può ridurre la quantità di biofilm formato dai batteri 15. La presenza di tale manufatto potrebbe sottovalutare la quantità di biofilm formato, nonché gli effetti degli enzimi-quorum tempra attraverso diverse condizioni di trattamento. L'uso di un enzima cataliticamente inattiva è importante come controllo negativo per eliminare i possibili effetti di enzima sequestro.

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Fondo per la Ricerca Accademica del Ministero dell'Istruzione, dal National Medical Research Council e dalla National Research Foundation, Singapore.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Triptone BD211705
Estratto di lievitoBD212750
Piastra a 96 pozzettiCostar3596
Crystal VioletSigma-AldrichC6158
Acido acetico ScansionelaboratorioPLA00654XAttenzione: Piatto infiammabile
Ibidi80136
Alex Fluo 488-coniugato WGAInvitrogenW11261
Hank' s soluzione salina bilanciata Invitrogen141475095
FormaldeideSigma-AldrichF8775Attenzione: Corrosivo 
Lettore di micropiastre Synergy HTBioTek
1X-81 Microscopio a fluorescenza invertitaOlympus
di

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Nature reviews. Microbiology. 6, 17-27 (2008).
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