Gli enzimi di estinzione del quorum sono opzioni anti-virulente e anti-batteriche che possono mitigare la patogenesi senza il rischio di incorrere in resistenza, impedendo l'espressione di fattori di virulenza e geni associati alla resistenza agli antibiotici e alla formazione di biofilm. In questo studio, riportiamo un metodo che dimostra l'efficacia degli enzimi quorum-quenching nella disgregazione del biofilm batterico.
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Articolo metodologico
Turbativa Anti-virulento di patogeni biofilm utilizzando Engineered Quorum-tempra Lactonases
In questo articolo
Sommario
Abstract
La rapida comparsa di batteri multiresistenti ai farmaci ha accelerato la necessità di nuovi approcci terapeutici per contrastare le infezioni potenzialmente letali. La persistenza dell'infezione batterica è spesso associata alla formazione di biofilm mediata dal quorum-sensing. Pertanto, l'interruzione di questo circuito di segnalazione presenta un'interessante strategia anti-virulenza. È stato riportato che le lattonasi che estinguano il quorum sono efficaci interferenti dei circuiti quorum-sensing. Tuttavia, ci sono state pochissime segnalazioni dell'uso efficace di questi enzimi nell'interrompere la formazione del biofilm batterico. Questo protocollo descrive un metodo per interrompere la formazione di biofilm in un ceppo clinicamente rilevante di A. baumannii S1 attraverso l'uso di una lattonasi ingegnerizzata per estinguere il quorum. L'Acinetobacter baumannii è un importante patogeno umano implicato in gravi infezioni nosocomiali a livello globale e la sua virulenza è attribuita principalmente alla tenacia del suo biofilm. Il trattamento ingegnerizzato con lattonasi ha ottenuto una significativa riduzione del biofilm di A. baumannii S1. Questo studio ha anche mostrato la possibilità di utilizzare enzimi ingegnerizzati per l'estinzione del quorum nel futuro trattamento delle malattie batteriche mediate da biofilm. Infine, il metodo può essere utilizzato per valutare la competenza di promettenti enzimi di estinzione del quorum.
Introduzione
Le opzioni di trattamento per le malattie infettive sono state complicate dal rapido aumento di batteri multiresistenti che sono immuni a una vasta gamma di farmaci antibiotici 1. Con l'alta morbilità e mortalità da infezioni batteri mediata resistenti, vi è la necessità di intensificare i processi di sviluppo di droga e / o esplorare alternative migliori antibatterici per migliorare le opzioni terapeutiche. Ultimamente, l'approccio anti-virulenza sta guadagnando interesse dato il suo potenziale nella prevenzione virulenza attraverso media non battericida, quindi mitigare i rischi del meccanismi di resistenza 2.
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Protocollo
1. cristallo viola Quantificazione di formazione di biofilm in A. baumannii S1
- Grow una cultura 5 ml di A. baumannii S1 in lisogenia brodo (LB) (triptone 10 g / L, estratto di lievito 5 g / L) a 30 ° C in un incubatore scuotimento (220 rpm) per 16 ore.
- Regolare la cultura della A. baumannii S1 ad una OD 600 di 0,8 desiderato. Utilizzando una piastra a 96 pozzetti, inoculare la coltura batterica (diluizione 1: 100) in fresco LB contenente 10 ml di enzima purificato GKL (40 mg / ml); volume finale della nuova cultura è 100 l.
- Preparare una coltura di controllo pure; questo non conterrà alcun ....
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Risultati
Nell'esperimento quantificazione cristallo viola, due enzimi quorum-tempra sono stati usati per dimostrare la fattibilità a interrompere la formazione di biofilm: wild-type GKL e una migliore doppio mutante GKL (E101G / R230C). Entrambi gli enzimi sono stati indicati per dimostrare l'attività lactonase contro 3-idrossi-L-decanoil-omoserina lattone (3-OH-C 10 -HSL), la principale molecola quorum utilizzato da A. baumannii S1 14. Per valida la valutaz.......
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Discussione
In entrambe le serie di esperimenti, A. baumannii S1 è stato coltivato in LB media senza NaCl come concentrazione di sali può ridurre la quantità di biofilm formato dai batteri 15. La presenza di tale manufatto potrebbe sottovalutare la quantità di biofilm formato, nonché gli effetti degli enzimi-quorum tempra attraverso diverse condizioni di trattamento. L'uso di un enzima cataliticamente inattiva è importante come controllo negativo per eliminare i possibili effetti di enzima sequestro.
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Fondo per la Ricerca Accademica del Ministero dell'Istruzione, dal National Medical Research Council e dalla National Research Foundation, Singapore.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Triptone | BD | 211705 | |
| Estratto di lievito | BD | 212750 | |
| Piastra a 96 pozzetti | Costar | 3596 | |
| Crystal Violet | Sigma-Aldrich | C6158 | |
| Acido acetico Scansione | laboratorio | PLA00654X | Attenzione: Piatto infiammabile |
| Ibidi | 80136 | ||
| Alex Fluo 488-coniugato WGA | Invitrogen | W11261 | |
| Hank' s soluzione salina bilanciata | Invitrogen | 141475095 | |
| Formaldeide | Sigma-Aldrich | F8775 | Attenzione: Corrosivo |
| Lettore di micropiastre Synergy HT | BioTek | ||
| 1X-81 Microscopio a fluorescenza invertita | Olympus |
Riferimenti
- Alanis, A. J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? Archives of medical research. 36, 697-705 (2005).
- Cegelski, L., Marshall, G. R., Eldridge, G. R., Hultgren, S. J. The biology and future prospects of antivirulence therapies. Na....
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Ristampe e permessi
