Articolo metodologico

Da costrutti a cristalli - Verso Struttura Determinazione della β-canna esterna proteine ​​di membrana

DOI:

10.3791/53245

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4 luglio 2016

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1Department of Biological Sciences, Markey Center for Structural Biology, Purdue University, 2National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), National Institutes of Health, 3National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), National Institutes of Health

In questo articolo

Sommario

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β' le proteine della membrana esterna (OMP) svolgono molte funzioni all'interno delle membrane esterne di batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti. Qui, speriamo di alleviare un noto collo di bottiglia negli studi strutturali presentando protocolli per la produzione di OMP a β cilindri in quantità sufficienti per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X o spettroscopia NMR.

Abstract

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Le proteine di membrana svolgono importanti funzioni nelle cellule come il trasporto dei nutrienti, la motilità, la segnalazione, la sopravvivenza e la virulenza, ma costituiscono solo ~1% per cento delle strutture conosciute. Esistono due tipi di proteine di membrana, α-elicoidali e β-barrel. Mentre le proteine di membrana a α elicoidale possono essere trovate in quasi tutte le membrane cellulari, le proteine di membrana a β cilindri possono essere trovate solo nelle membrane esterne dei mitocondri, dei cloroplasti e dei batteri Gram-negativi. Un collo di bottiglia comune negli studi strutturali delle proteine di membrana in generale è ottenere una quantità sufficiente di campione puro per l'analisi. Nella speranza di aiutare coloro che sono interessati a risolvere la struttura della loro proteina di membrana esterna (OMP) preferita a β-barrel, vengono presentati protocolli generali per la produzione di OMP a β-barrel target a livelli utili per la determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X e/o spettroscopia NMR. Qui, delineiamo il design del costrutto sia per l'espressione nativa che per l'espressione in corpi di inclusione, la purificazione utilizzando un tag di affinità e la cristallizzazione utilizzando tecniche di screening detergente, bicelle e fase cubica lipidica. Questi protocolli sono stati testati e si sono dimostrati efficaci per la maggior parte degli OMP da batteri Gram-negativi; Tuttavia, ci sono alcuni bersagli, in particolare per i mitocondri e i cloroplasti, che possono richiedere altri metodi per l'espressione e la purificazione. Pertanto, i metodi qui riportati dovrebbero essere applicabili alla maggior parte dei progetti che coinvolgono OMP da batteri Gram-negativi, ma i livelli di espressione e la quantità di campione purificato variano a seconda dell'OMP target.

Introduzione

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β-barile OMP si possono trovare solo nelle membrane esterne di mitocondri, cloroplasti, e batteri Gram-negativi 1-3. Mentre servono ruoli simili come proteine ​​alfa-elica, hanno una piega molto diversa costituito da un dominio β-barrel membrana incorporato centrale vanno da 8-26 anti-paralleli beta trefoli con ciascun trefolo essendo intimamente collegato ai due fili adiacenti (figure 1 e 2). Il primo e l'ultimo fili di dominio β-barile poi interagiscono tra loro, quasi esclusivamente in modo antiparallelo (eccetto VDAC mitocondriale), per chiudere e sigillare il dominio β-barile dalla membrana circostante. Tutti OMP β-barile hanno loop extracellulari di diversa sequenza e lunghezza che svolgono un ruolo importante nelle interazioni ligando e / o contatti proteina-proteina, con questi loop talvolta essere grande come 75 residui, come trovato in Neisserial transferrina vincolante proTEIN A (TBPA) 4. β-barile OMP possono avere anche le estensioni periplasmatiche N-terminale o C-terminale che servono domini come ulteriori per scopo funzionale della proteina (ad esempio, Bama 5-7, FimD 8,9, Fadl 10). Mentre esistono molti tipi di OMP β-botte 11, due dei tipi più comuni sono descritti di seguito come esempi per quelli meno familiarità con il campo, (1) trasportatori TonB-dipendente e (2) automezzi.

Trasportatori TonB-dipendenti (ad esempio, FEPA, TBPA, BTub, Cir, etc.) sono essenziali per l'importazione di nutrienti e contengono un dominio spina N-terminale costituito da ~ 150 residui che si trova nascosto all'interno di un C-terminale di 22-bloccati β- dominio barilotto incorporato nella membrana esterna 12 (figura 3). Anche se questo dominio spina impedisce supporto a partire da liberamente passando per il dominio barile, legame del substrato induce un cambiamento conformazionale all'interno del dominio spina °in porta a poro formazione (sia per spina riarrangiamento o parziale / totale espulsione del tappo), che possono poi facilitare il trasporto del substrato attraverso la membrana esterna in periplasma. Trasportatori TonB-dipendenti sono particolarmente importanti per la sopravvivenza di alcuni ceppi patogeni di batteri Gram-negativi, come Neisseria meningitidis che si sono evoluti trasportatori specializzati che si impadroniscono nutrienti come il ferro direttamente da proteine ​​ospite umani 4,13,14.

Automezzi appartengono al tipo di sistema di secrezione V di batteri Gram-negativi e sono OMP beta-barile che consistono di un dominio β-barile (tipicamente 12-fili, come con ESTA e ESPP) e un dominio del passeggero che è o secreti o presentati al superficie della cellula 15,16 (figura 3). Questi OMP β-barile servono spesso ruoli importanti nella sopravvivenza cellulare e virulenza con il dominio passeggero che serve sia come proteasi, adhesin, e / o altri effector che media patogenesi.

metodi strutturali come la cristallografia a raggi X, la spettroscopia NMR, e la microscopia elettronica (EM) ci permettono di determinare modelli per le OMP a risoluzione atomica, che può a sua volta essere utilizzati per decifrare esattamente come funzionano all'interno della membrana esterna. Queste informazioni preziose può quindi essere utilizzato per lo sviluppo di farmaci e vaccini, se applicabile. Per esempio, il legame transferrina proteina A (TBPA) si trova sulla superficie del Neisseria ed è necessario per la patogenesi perché si lega direttamente transferrina umana e poi estrae ed importa il ferro per la propria sopravvivenza. Senza TBPA, Neisseria non può pulire il ferro da ospite umano e sono resi non patogeni. Dopo che la struttura cristallina della transferrina umana legato al TBPA 4 è stato risolto, è diventato molto più chiaro come le due proteine ​​associate, quali regioni della TBPA mediata interazione, ciò residui erano importanti per l'estrazione ferro TBPA, ecome si potrebbe sviluppare terapie contro Neisseria di targeting TBPA. Pertanto, data l'importanza di OMP β-barile nei batteri Gram-negativi per la sopravvivenza e la patogenesi, nonché nei mitocondri e funzione cloroplasti, e la necessità di informazioni strutturali aggiuntive su questa classe unica di proteine ​​di membrana e sistemi in cui funzionano , protocolli generali vengono presentati con l'obiettivo generale di esprimere e purificare OMP bersaglio ad alti livelli per la caratterizzazione con metodi strutturali.

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Protocollo

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1. Clonazione ed espressione

Nota: Per abilitare studi strutturali, quantità sufficienti di proteina altamente purificata devono essere preparati, e questo in genere inizia con la clonazione e la sovraespressione della proteina della membrana esterna di destinazione β-barile (OMP) in E. coli (Figura 4). Fino ad oggi, tutte le strutture OMP β-botte, tra cui quelle strutture per VDAC mitocondriale, sono stati derivati ​​da batteri espresso proteina 11. Qui, i protocolli generali sono presentati per clonaggio e l'espressione OMP β-barile per (1) espressione nativo direttamente nelle membrane batteriche e (2) l'espressione in corpi inclusioni in vitro ripiegamento 17.

  1. La progettazione di una costruzione Expression
    1. Ottenere o acquistare il gene bersaglio OMP codone ottimizzato.
    2. Acquisto o ottenere un vettore di espressione T7 (i) contenente una sequenza segnale di localizzazione periplasmic, un tag 6x-istidina N-terminale,e un sito proteasi TEV 4,18,19 per l'espressione in vivo alla membrana o (ii) senza una sequenza segnale di localizzazione periplasmic per l'espressione di corpi di inclusione per ripiegamento in vitro.
      Nota: Un proteasi N-terminale cleavable tag 6x o 10x-istidina fornirebbe un metodo facile per la purificazione. Come con proteine ​​solubili, variare la scelta dei tag di affinità (istidina, Strep, GST, ecc), la posizione del tag di affinità, e l'inclusione di un sito proteasi (TEV, enterokinase, trombina, etc.) per la successiva rimozione tag .
    3. PCR amplificare la sequenza bersaglio con primer e subclone appropriata nel vettore di espressione. Utilizzare legatura clonazione indipendente (LIC) 20,21 o convenzionali tecniche di clonazione (enzimi di restrizione / legatura) per subcloning. Tuttavia, LIC può facilitare throughput elevato, consentendo un vasto numero di vari costrutti (troncamenti, varietà di etichette, varietà di promotori) da clonare in parallelo piùfacilmente.
  2. In Expression Vivo a membrana mirati
    1. Utilizzare l'analisi di sequenziamento per verificare la destinazione β-barile OMP viene clonato a valle e nel telaio con una sequenza di segnali (cioè, pelB, OmpA) nel costrutto di espressione.
      Nota: La sequenza di segnali dirige la catena nascente al translocon Sec per la secrezione nel periplasma e successivo montaggio nella membrana esterna.
    2. Trasformare il costrutto in un ceppo di batteri espressione di espressione pipettando 1,0 ml di plasmide in 50 ml di BL21 (DE3) cellule chimicamente competenti e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Incubare in ghiaccio per 30 min.
    3. impulso di calore a 42 ° C per 30 sec con un bagno di acqua e poi rimetterlo in ghiaccio per 1 min.
    4. Aggiungere 1 ml di supporti pre-riscaldato SOC e agitare a 37 ° C per 1 ora a 1.000 giri al minuto con un incubatore da banco shaker.
    5. Piatto 100 ml di cellule su piastre di agar LB contenente un adeguato antibiotic e incubare una notte a 37 ° C invertita.
    6. Eseguire test di espressione su piccola scala inoculando un + cultura antibiotico 5 ml LB con una singola colonia. Ripetere per 5-10 colonie.
      Nota: A causa della potenziale tossicità di un OMP β-botte e la dipendenza da livelli di espressione basali, la variabilità colonia-to-colonia è talvolta osservato. Pertanto, lo screening più colonie è raccomandato per ciascun costrutto in prova. Per i test su piccola scala di espressione, piuttosto che convenzionali 5 ml culture, in crescita di 25 ml culture in 125 ml sconcertato beute è suggerito. Queste condizioni spesso meglio riflettono ciò che accadrà in una crescita su grande scala. Inoltre, è una buona idea per schermare anche vari tipi di mezzi di coltura (TB, LB, 2xYT, M9, ecc), poiché vari livelli di successo sono stati riportati seconda proteina bersaglio.
      1. Crescere a 37 ° C con agitazione ad una OD 600 di ~ 0.6.
      2. Indurre l'espressione della OMP bersaglio dall'inserzionistading 5 ml di 1 M isopropilico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a ciascuna provetta cultura e permettono di far crescere un ulteriore 1-2 ore.
      3. Confronto livelli di espressione per tutte le colonie per centrifugazione 1 ml di ciascuna coltura (OD 600 di ~ 0,6) per 1 min a 15.000 xg usando una microcentrifuga.
      4. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 200 ml di tampone di caricamento 1x SDS-PAGE. Termico a 100 ° C per 5 minuti, quindi si centrifuga di nuovo a 15.000 xg per 5 min.
      5. Analizzare i campioni utilizzando SDS-PAGE pipettando 20 microlitri in ciascun pozzetto di un gel 10%. Eseguire il gel per 35 min a 200 V. costante
        Nota: Sarebbe utile a questo punto essere in grado di determinare se la proteina target venga correttamente ripiegata o meno. Questo spesso può essere realizzato facendo purificazioni su piccola scala o analizzando per modificabilità del calore.
    7. Selezionare la colonia che mostra la migliore espressione ed eseguire espressione su larga scala utilizzando 12-24 L del mezzo.
      Nota: I metodi convenzionali di solito si sviluppano le culture a 37 ° C con agitazione ad una OD 600 di ~ 0.6 e quindi inducono con un induttore appropriata (ad esempio, 0,1-1 mm per IPTG o ~ 0,2% per arabinosio) per un ulteriore 2-4 ore . Se lo si desidera, prima della induzione, ridurre la temperatura a partire da 20 ° C e prolungare il tempo di induzione.
      1. Per il metodo di espressione che perde, crescono a 25 ml inoculare cultura a 37 ° C in terreno LB contenente l'antibiotico appropriato (s) fino OD 600 raggiunge ~ 0,6. Quindi, aggiungere 1 ml di inoculare a dodici 1 L fiaschi di media TB più antibiotici (s) e crescere a 20 ° C a saturazione (~ 3 giorni).
    8. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min.
    9. Procedere alla fase di purificazione Sezione 2.1 o congelare il pellet cellulare in azoto liquido per la conservazione a lungo termine a -80 ° C.
  3. Espressione di corpi di inclusione in vitro Refolding
    1. Utilizzare analisi di sequenziamento per verificare il costrutto di espressione non contiene una sequenza segnale. L'assenza di una sequenza segnale dirigere la proteina bersaglio ad accumularsi nel citosol come corpi di inclusione.
    2. Trasformare il costrutto di espressione in un ceppo di batteri espressione di espressione. Per espressione corpi inclusi, è meglio controllare l'espressione per induzione (vale a dire, IPTG, arabinosio, etc.) per ridurre al minimo i possibili effetti di tossicità.
    3. Piastra 100 ml di cellule trasformate su piastre di agar LB contenenti un antibiotico appropriato e incubare una notte a 37 ° C invertita.
    4. Eseguire test di espressione su piccola scala inoculando un + cultura antibiotico 5 ml LB con una singola colonia.
    5. 1.3.4 passo Ripetere per 2-4 colonie supplementari.
    6. Crescere a 37 ° C con agitazione ad una OD 600 di ~ 0.6.
    7. Indurre con un induttore appropriato per 1-2 ore.
    8. Confronta i livelli di espressione per ogni tegli colonie attraverso l'analisi utilizzando SDS-PAGE (vedere il punto 1.2.6). Selezionare la colonia che mostra la migliore espressione ed eseguire espressione su larga scala utilizzando 12-24 L di mezzo.
      1. Crescere le cellule a 37 ° C ad una OD 600 di 0,6-0,8 e indurre a 37 ° C per 3-5 ore. Mentre l'espressione di corpi di inclusione è più robusto rispetto ad altri tipi di espressione, come per tutti gli esperimenti di espressione proteica, espressione può essere migliorata variando mezzo di crescita, il tempo di induzione, la temperatura di induzione, e la concentrazione dell'agente indurre.
    9. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min.
    10. Procedere alla fase di purificazione sezione 2.2 o congelare il pellet cellulare in azoto liquido per la conservazione a lungo termine a -80 ° C.

2. Purificazione

  1. Isolamento da membrana Frazioni
    Nota: A differenza di proteine ​​solubili, proteine ​​di membrana integrali sono incorporati nel doppio strato lipidico e quindirichiedono detergenti per estrarre loro per ulteriore purificazione ed analisi (Figura 5). Dopo l'espressione, il primo passo nella purificazione di un OMP β-barilotto è estrazione della frazione di membrana.
    1. Risospendere le cellule in Lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 50 ug / ml AEBSF, 5 ug / ml DNasi I) in un rapporto di pasta cellulare 5 ml / g.
    2. Lyse le cellule utilizzando una pressa francese o omogeneizzatore cellulare. Spin le cellule lisate a 15.000 xg per 30 min a 4 ° C per rimuovere le cellule non lisate e detriti cellulari.
    3. Trasferire il surnatante in una provetta pulita e centrifugare di nuovo ad alta velocità (200.000 xg) per 1 ora a 4 ° C. Il pellet risultante è la frazione di membrana che contiene la proteina di interesse.
    4. Utilizzando un omogeneizzatore Dounce, risospendere la frazione di membrana, prima di trasferire le membrane e poi l'aggiunta di buffer di solubilizzazione (50 mm KH 2 PO 4 pH 7,5, 200 mM NaCl, 20 mM imidazolo, PH 8,0) (50 ml per 20 celle g) a concentrazione 2x, senza detergente.
    5. Versare le membrane risospese in un piccolo becher e aggiungere il detersivo (cioè, n-dodecil-β-D-maltoside (DDM), lauryldimethylamine-N-ossido (LDAO), n-ottil-β-D-glucopiranoside (OG), Triton X-100, etc.) lentamente ad una concentrazione finale di ~ 10x concentrazione micellare critica (CMC).
    6. Riempire con acqua fino a una concentrazione finale di 1x tampone di solubilizzazione. Mescolare per 0,5-16 ore a 4 ° C, a seconda di quanto facilmente la proteina bersaglio viene estratta dalle membrane.
      Nota: detersivo viene utilizzato per solubilizzare lentamente le membrane per estrarre la proteina bersaglio. Ci sono 3 tipi di detergenti che possono essere utilizzati qui: ionico (SDS, acido deoxycholic), non ionici (Elugent, Tween, Triton X-100, OG, DDM), e zwitterionici (LDAO, CHAPS). Un complesso proteina-detergente che è stabile e monodisperse durante la fase di purificazione sarà di grande aiuto per il successo di crystallizat proteina di membranaionico. Ulteriori informazioni su detergenti, le loro proprietà, informazioni CMC, e il loro uso nella purificazione di proteine ​​di membrana e altre applicazioni possono essere trovate sui siti fornitori commerciali.
    7. Centrifugare il campione solubilizzato a 300.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Il surnatante ora contiene la destinazione β-barile OMP detergente-solubilizzato.
    8. Procedere con Sezione 2.3 come indicato di seguito.
  2. Ripiegamento da corpi di inclusione
    Nota: Per ripiegamento in vitro, l'obiettivo β-barile OMP è espressa direttamente in corpi di inclusione. Un vantaggio è che queste proteine ​​possono essere prodotti a livelli elevati. Tuttavia lo svantaggio è che refolding è spesso inefficiente e varia da un esperimento ripiegatura a quella successiva. Eppure, ci sono molti esempi di proteine ​​che sono state ripiegate con successo per studi strutturali. A seguito di espressione in corpi di inclusione, si deve ora isolare i corpi di inclusione per ripiegamento esperimentoS.
    1. Risospendere le cellule in Lysis buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 200 mM NaCl, 10 mM MgCl 2, 50 ug / AEBSF ml, 5 mg / ml DNasi I, 4 mM 2-mercaptoetanolo (BME)) (5 ml per pasta di cellule g). Lyse utilizzando una pressa, sonicazione, o omogeneizzatore cellule francese.
    2. Pellet corpi di inclusione di una rotazione a bassa velocità a 6.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    3. Lavare i corpi di inclusione dalla risospensione in 25 ml di 1,0 M di urea usando un omogeneizzatore Dounce. Pellet di nuovo da una centrifuga a bassa velocità a 6.000 xg per 10 minuti a 4 ° C.
    4. Ripetere il punto 2.2.3, se necessario.
    5. Risospendere le corpi di inclusione lavati ad una concentrazione finale di 10 mg / ml utilizzando tampone contenente 8,0 M di urea (o 6,0 M guanidina cloridrato (GdCl)) più detergente (cioè, DDM o LDAO) a 2x CMC o superiore.
      Nota: Se lo si desidera, per target di proteine ​​di membrana che contengono un tag istidina, immobilizzato in metallo-cromatografia di affinità (IMAC) di purificazione può essere eseguita utilizzando denaturazione colli operativi (in 8.0 M urea o 6.0 M GdCl) come un primo passo simile a quello descritto di seguito nella sezione 2.3.
    6. Eseguire la reazione refolding lentamente (durante la notte) rimuovendo il denaturante per dialisi in tampone privo del denaturante.
      Nota: Si può richiedere diverse modifiche del buffer di dialisi per raggiungere questo obiettivo. In alternativa, se i corpi di inclusione vengono prima tenuti ad una colonna IMAC, si può fare la reazione refolding mentre ancora legato alla colonna scambiando lentamente buffer per rimuovere il denaturante. In entrambi i casi, ricordate che questa è una proteina di membrana, di conseguenza, detersivo deve essere presente per stabilizzare il bersaglio. Inoltre, se il detersivo utilizzato sia dializzabile, deve essere aggiunto al tampone di dialisi (s) pure.
    7. Spin i campioni ripiegate a 200.000 xg per 1 ora a 4 ° C. Il surnatante contiene il ripiegata bersaglio β-barile OMP detergente-solubilizzato.
    8. Procedere con Sezione 2.3 come indicato di seguito.
  3. Purificazione ImpiegoMAC, a scambio ionico, e gel filtrazione
    Nota: Supponendo che la proteina è stato progettato con un tag istidina, sia nativo esprime o ripiegata usando metodi in vitro, poi immobilizzato cromatografia metallo affinità (IMAC) viene eseguita per la purificazione molto simile per Istidina etichettato proteine ​​solubili, tranne detersivo deve essere tenuto in tutti i tamponi successivi per mantenere la porta OMP β-barile solubilizzati e stabile.
    1. Preparare una colonna 1-5 ml IMAC o utilizzare una colonna preconfezionato. Eseguire successive fasi di cromatografia a 4 ° C. Sciacquare con acqua per rimuovere eventuali tracce di conservanti. Se si utilizza un sistema di depurazione automatizzato, installare la colonna secondo le istruzioni del produttore.
    2. Preparare 500 ml di IMAC tampone A (50 mM K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM) e 250 ml di IMAC tampone B (50 mM K 2 HPO 4, pH 7.5, 200 mM NaCl, 0,1% DDM, e 1,0 M imidazolo).
      Nota: Altri detergenti che possono essere utilizzati iNCLUDE Cymal-6 (0,05%), Triton X-100 (0,03%), e LDAO (0,05%).
    3. Equilibrare la colonna IMAC con 10 volumi di colonna di IMAC tampone A.
    4. Aggiungere imidazolo al campione ad una concentrazione finale di 25 mM e mescolare. Caricare il campione attraverso la colonna IMAC equilibrata a 2 ml / min. Raccogliere il flusso attraverso.
    5. Lavare la colonna IMAC con 5 volumi di colonna ciascuno di concentrazioni crescenti di imidazolo con tampone B (cioè, 25 mM, 50 mM, 100 mM). Raccogliere i lavaggi in 2 ml frazioni.
    6. Eluire il campione con una concentrazione finale di 250 mM per 5 volumi di colonna. Raccogliere il campione eluito in 2 ml frazioni.
    7. Analizzare il flusso attraverso le frazioni di lavaggio e le frazioni di eluizione utilizzando l'analisi SDS-PAGE (vedi punto 1.2.6) in base alla loro assorbanza a 280 nm. In comune le frazioni contenenti il ​​OMP bersaglio β-barile come verificato mediante analisi SDS-PAGE.
    8. Rimuovere il tag 6x-istidina con l'aggiunta di TEV proteasi al campione pooled (secondoil protocollo del produttore) e incubando overnight a 4 ° C con dolce dondolio.
    9. Caricare la soluzione campione / proteasi su una colonna IMAC di nuovo per separare il target OMP β-barile (passare attraverso) dai tag clivati ​​e qualsiasi campione uncleaved. Il flusso attraverso conterrà il campione spaccati manca il tag.
      Nota: Questo sarebbe anche eliminare ogni proteasi come TEV-His, che ha anche un tag 6x-istidina non scindibile in sé. Altrimenti, saranno necessari altri metodi per rimuovere la proteasi dopo la digestione.
    10. Facoltativamente, effettuare cromatografia a scambio ionico per purificare ulteriormente il campione. Seguire le istruzioni del produttore per la colonna da utilizzare, essendo sicuri di includere il detersivo in tutti i buffer.
    11. Per preparare la cristallizzazione, caricare il campione su una colonna di gel filtrazione in un tampone contenente il detersivo da utilizzare per la cristallizzazione, ad esempio 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 200 mM NaCl, 1% OG.
    12. Raccogliere 1 ml frazioni e analizzare USIAnalisi ng SDS-PAGE (vedi Passaggio 1.2.6) basato sul loro assorbanza a 280 nm. frazioni piscina con assorbanza a 280 nm in quanto contengono la proteina bersaglio. Concentrato a ~ 10 mg / ml.
      Nota: Se lo si desidera, una corretta piegatura può essere valutata mediante un saggio di modificabilità di calore come indicato di seguito.
  4. Calore Modificabilità Assay
    Nota: Un metodo per monitorare il corretto ripiegamento del purificato β-barile OMP è quello di eseguire test di modificabilità di calore con un semi-nativo SDS-PAGE 22. Qui, i campioni non riscaldati venga piegato correttamente in genere migrare in modo diverso da quelli che sono denaturato calore. Questa proprietà è unica per beta-barile OMP e ampiamente utilizzati per studiare questa famiglia di proteine ​​di membrana.
    1. Prima di preparazione dei campioni, montare l'apparato gel. Per iniziare, posizionare il serbatoio di accumulo in un secchio di ghiaccio e circondare completamente di ghiaccio. Inserire un cast in-house o gel commerciale gradiente nativo nel supporto e inserire nel serbatoio. riempire tegli serbatoio completamente con 1x freddo MES tampone di corsa (50 mm 2- [N-morfolino] acido etansolfonico, 50 mm di base Tris, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,3).
    2. Pipettare 0,25 ml di campione (10 mg / ml) in due provette da 1,5 ml microcentrifuga. Etichettare uno come 'bolliti' e l'altro come 'RT'.
    3. Aggiungere 9,75 ml di tampone campione per ogni e mescolare pipettando. Per entrambi i campioni, aggiungere 10 ml di tampone 2x SDS di carico (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 0,2% bromofenolo blu, e il 20% glicerolo) e mescolare delicatamente pipettando.
    4. Far bollire il campione 'bollito' a 95 ° C per 5 minuti, lasciando il campione 'RT' a temperatura ambiente. Gira la 'bollito' brevemente campione.
    5. Carico 20 ml di entrambi i campioni sul gel nativo preassemblato. Eseguire per 60 min a 150 V. costante Rimuovere il gel e ammollo nella soluzione colorante per visualizzare i risultati.

3. Cristallizzazione

Nota: per la cristallizzazione di entrambibersagli proteici solubili e di membrana, è protocollo standard per massimizzare la purezza del campione e stabilità (cioè, migliore detergenti, ligandi, cofattori, ecc). Metodologia corrente per cristallizzare obiettivi proteina di membrana, in generale, comprende tre approcci principali che soddisfano i requisiti anfifilici di proteine ​​doppio strato-embedded: (1) detersivi, (2) bicelle, e (3) fase cubica lipidica (LCP) (Figura 6) 23. L'uso di un robot nanolitro cristallizzazione viene fortemente raccomandato quando possibile, al fine di aumentare il numero di condizioni che possono essere esaminati per un dato volume di campione, così come, utilizzando recenti progressi strumenti volti a facilitare la determinazione della struttura (Figura 7).

  1. Cristallizzazione utilizzando detergenti
    1. Ottenere un campione di proteine ​​solubilizzato detergente è a ~ 10 mg di concentrazione / ml. Facoltativamente, aggiungere l'additivo 1,2,3-heptanetriol direttamente al campione ad una concentrazione finale del 3% per ridurre detergdimensioni micelle ent.
    2. Filtrare il campione utilizzando un filtro centrifugo 0,22 micron per rimuovere le particelle e le precipitazioni.
    3. Utilizzando un robot cristallizzazione, eseguire un'ampia cristallizzazione matrice screening utilizzando disponibili in commercio 96 schermi e da una impiccagione o seduti metodo di vaporizzazione goccia con gocce composte da ~ 200 del campione della proteina nl e ~ 200 buffer di cristallizzazione nl.
    4. Incubare le piastre di cristallizzazione a ~ 21 ° C. Ispezionare le piastre settimanali per la crescita dei cristalli utilizzando uno stereomicroscopio.
    5. Ottimizzare lead cristallizzazione variando componenti della condizione di cristallizzazione in modo sistematico (crescente / decrescente sale o concentrazioni precipitanti, a pH, temperatura di incubazione, e la concentrazione / o proteine).
  2. Cristallizzazione Utilizzando bicelle
    Nota: Una dimostrazione più dettagliata delle tecniche bicelle è già stato descritto da Ujwal e Abramson 24.
    1. Preparare o acquistare un 3Miscela bicelle 5% composto di DMPC: CHAPSO con un rapporto di 2,8: 1 secondo protocolli pubblicati 25. Altre concentrazioni possono essere dosati, nonché, altri lipidi e detergenti, come necessario.
    2. Ottenere un campione di proteine ​​solubilizzato detergente è a ~ 10 mg di concentrazione / ml.
    3. Aggiungere la miscela bicelle, su ghiaccio, con un rapporto di partenza di 4: 1 v / v (proteina: bicelle) (ad esempio, aggiungere 10 ul di miscela bicelle a 40 microlitri di proteine ​​e miscelare rapidamente pipettando).
    4. Incubare in ghiaccio 30-60 min.
      Nota: La proteina: soluzione bicelle dovrebbe rimanere per lo più chiaro, ma spesso può girare leggermente opaco. Tuttavia, se la proteina: bicelle soluzione diventa bianco latte, indicando precipitazione, poi altre variabili devono essere analizzati (cioè, detersivo, tampone, ecc). Per i nuovi campioni, facendo test su piccola scala (proteina 8 ml e 2 bicelle microlitri) si consiglia di verificare la stabilità prima di scalare fino a impedire la perdita del campione inutili.
    5. Utilizzando un robot cristallizzazione, eseguire un'ampia cristallizzazione matrice screening utilizzando disponibili in commercio 96 schermi e da una impiccagione o seduti metodo di vaporizzazione goccia con gocce composte da ~ 200 del campione della proteina nl e ~ 200 buffer di cristallizzazione nl.
    6. Incubare le piastre di cristallizzazione a ~ 21 ° C. Ispezionare le piastre settimanali per la crescita dei cristalli utilizzando uno stereomicroscopio.
    7. Ottimizzare lead cristallizzazione variando componenti della condizione di cristallizzazione in modo sistematico (crescente / decrescente sale o concentrazioni precipitanti, a pH, temperatura di incubazione, e la concentrazione / o proteine).
  3. Cristallizzazione Utilizzando fase cubica lipidica (LCP)
    Nota: Una dimostrazione più dettagliata delle tecniche di LCP è già stato descritto da Liu e Cherezov 26,27.
    1. Ottenere un campione di proteine ​​solubilizzato detergente è a ~ 20 mg di concentrazione / ml.
    2. Pre-caldo il monoolein a ~ 40 ° C. Caricare60 ml monoolein in una siringa 100 microlitri a tenuta di gas e 40 ml campione di proteine ​​in un altro.
    3. Utilizzando un accoppiatore miscelazione, collegare le siringhe, facendo attenzione a non introdurre l'aria.
    4. Mescolare delicatamente applicando pressione alternata sui pistoni siringa spingendo la miscela da una siringa all'altra completamente fino a quando il campione diventa trasparente ed omogenea.
    5. Utilizzando un robot progettato per cristallizzazione metodi LCP, eseguire un'ampia cristallizzazione matrice screening utilizzando disponibili in commercio 96 schermi e con piastre di cristallizzazione panino-stile (0,1 mm di spessore bene) con gocce composto da 100 campioni proteina nl e 750 buffer di cristallizzazione nl.
      Nota: i rapporti di goccia possono essere regolati in caso di necessità. Inoltre, coperchi solidi (cioè, vetro o plastica di spessore) sono raccomandate che supportano le gocce ben anziché film sottili, che tendono a consentire le gocce di muoversi pozzo quando le piastre vengono gestiti.
    6. Incubare la cristallizzazione ptardive a ~ 21 ° C. Ispezionare le piastre settimanali per la crescita dei cristalli utilizzando uno stereomicroscopio.
    7. Ottimizzare lead cristallizzazione variando componenti della condizione di cristallizzazione in modo sistematico (crescente / decrescente sale o concentrazioni precipitanti, a pH, temperatura di incubazione, e la concentrazione / o proteine).

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Risultati

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Yiur è un TonB trasportatore di ferro dipendente che è un bersaglio del vaccino putativo contro Yersinia pestis. E 'stato originariamente identificato utilizzando un test di microarray. Qui, i passi che sono state prese per determinare la struttura di yiur mediante cristallografia a raggi X sono delineati (Figura 9). Per la clonazione, la sequenza di DNA di yiur (meno il segnale sequenza N-terminale) è stato amplificato mediante PCR dal DNA genomico e subclonato...

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Discussione

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β-barile OMP servono ruoli essenziali nel batteri Gram-negativi, mitocondri e cloroplasti e sono obiettivi importanti per l'analisi strutturale che offrono una ricchezza di informazioni sui meccanismi molecolari essenziali a membrane esterne di queste rispettive organelli. Tuttavia, producendo abbastanza campione per l'analisi strutturale non è sempre agevole e, pertanto, una condotta generale è presentato per la produzione di quantità sufficienti di bersaglio OMP β-barile per la determinazione della struttura, ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Herve Celia del CNRS per aver fornito le immagini UV e Chris Dettmar e Garth Simpson del Dipartimento di Chimica della Purdue University per aver fornito le immagini SONICC. Vorremmo ringraziare il finanziamento del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases e del Programma di ricerca intramurale presso il National Institutes of Health. Inoltre, vorremmo riconoscere ulteriori finanziamenti da parte del National Institute of General Medical Sciences (AMS e CJ), del National Institute of Allergy and Infectious Diseases (N.N. 1K22AI113078-01) e del Dipartimento di Scienze Biologiche della Purdue University (N.N.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Robot di cristallizzazioneTTP Labtech, Art Robbins-Qualsiasidovrebbe funzionare qui, ad eccezione del
termociclatore PCREppendorf, BioRad-Media
ShakerNew Brunswick, Infors HT-UV-vis
spettrometro
apparecchioBioRad1645050, 1658005
SDS-PAGE e gel nativiBioRad, Life Technologies4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA PrimeGEHealthcare-AkTA
Eppendorf-Centrifuge
(bassa-media velocità)Beckman-Coulter-Ultracentrifuge
(alta rotoreBeckman-Coulter-SS34
Sorvall-Type
45 TiRotore Beckman-Coulter-Type
70 Ti
Fisher Scientific06 435C
EmulsiflexAvestin-Dialysis
tubingStrumenti LCP SigmaD9652
Hamilton, TTPLabtech-VDX
Piastre a 24 pozzettiHampton ResearchHR3-172
Piastre sandwichHampton Research, dimensioni molecolariHR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Fogli di cristallizzazione GraceBio-Labs875238
colonna HiPrep S300 HRGE Healthcare17-1167-01
Colonna Q-SepharoseGE Healthcare17-0510-01
Schermi di cristallizzazioneHampton Research, Qiagen, Dimensioni molecolari-Siringa
a tenuta di gas (100 ml)Hamilton 
di cristallizzazione LCP Eppendorf-SDS-PAGE Purifier GE Healthcare-Microcentrifuge Rotore Omogeneizzatore

Riferimenti

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