Questo protocollo descrive l'uso di preparati di tessuto intestinale asportati o "sacche intestinali" come modello ex vivo della funzione della barriera intestinale. Questo modello può essere utilizzato per valutare l'integrità sia della barriera epiteliale che dello strato di gel mucoso in specifici siti intestinali in modelli animali di malattia digestiva.
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Articolo metodologico
Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale
In questo articolo
Sommario
Abstract
La barriera epiteliale è la prima difesa innata del tratto gastrointestinale e regola selettivamente trasporto dal lume ai compartimenti sottostanti, limitare il trasporto di molecole più piccole attraverso l'epitelio e quasi completamente vieta epiteliale trasporto macromolecolare. Questa selettività è determinata dallo strato di gel mucoso, che limita il trasporto di molecole lipofile ed entrambi i recettori apicali e stretti complessi proteici giunzionali dell'epitelio. Modelli in vitro su colture di cellule dell'epitelio sono convenienti, ma come un modello, non hanno la complessità delle interazioni tra microbiota, muco-gel, epitelio e il sistema immunitario. D'altra parte, la valutazione in vivo dell'assorbimento intestinale o permeabilità può essere eseguita, ma questi test misurare il grado di assorbimento gastrointestinale, senza alcuna indicazione di specificità del sito. Ex vivo saggi permeabilità utilizzando "sacche intestinali"; sono un metodo rapido e sensibile per misurare sia l'integrità intestinale globale o il trasporto comparativa di una molecola specifica, con l'ulteriore vantaggio di specificità del sito intestinale. Qui si descrive la preparazione di sacche intestinali per gli studi di permeabilità e il calcolo della permeabilità apparente (P app) di una molecola attraverso la barriera intestinale. Questa tecnica può essere utilizzata come un metodo di valutazione assorbimento del farmaco, o per esaminare disfunzione barriera epiteliale regionale in modelli animali di malattia gastrointestinale.
Introduzione
La barriera epiteliale intestinale del tratto gastrointestinale è una superficie mucosa stimato a 400 m 2 nel umano adulto. Di conseguenza, si è costantemente esposto a sfidare da microbi, farmaci ingeriti, nutrienti e tossine batteriche. L'host non solo deve distinguere tra batteri commensali tollerabili e potenziali patogeni, ma deve impedire queste specie e loro molecole secrete di attraversare la barriera epiteliale, mentre allo stesso tempo permette l'assorbimento dei nutrienti. Pertanto, il ruolo dell'epitelio intestinale è di agire come barriera selettiva al contenuto luminale 1. Questo risultato è ottenuto, in parte, dal sist....
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Protocollo
Tutti i lavori degli animali in questo protocollo viene eseguita con la stretta aderenza alle Università di Newcastle comitato etico degli animali procedure approvate.
1. Preparazione degli strumenti, Cultura Media e Piatti
- Pre-caldo media 199 (TC199) o Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) supporti a 37 ° C. Pre-ossigenare il supporto facendo gorgogliare con il 95% O 2/5% di CO 2. Verificare che il mezzo ha un pH finale di 7,3.
- Preparare sutura tagliando due sezioni 5 cm per ogni uscita. Loop i punti di sutura in un nodo non chiusa.
2. dissezione e p....
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Risultati
Questo protocollo può essere utilizzato per esaminare i cambiamenti regionali in funzione di barriera intestinale in modelli animali di malattie gastrointestinali. Misurando il flusso di una sonda paracellular sulla superficie mucosa in diverse aree del tratto gastrointestinale 7, l'integrità delle giunzioni strette epiteliali può essere valutata. Inoltre, variando la natura della sonda paracellular per dimensione (Figura 2) o idrofobicità (Figura .......
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Discussione
Qui, abbiamo descritto l'isolamento e la preparazione di sacche intestinali per valutare la funzione barriera della mucosa ex vivo. preparazioni sac intestinali sono principalmente utilizzati nella ricerca farmaceutica, esaminando l'assorbimento di farmaci candidati attraverso l'intestino. Tuttavia, questo test è ugualmente adatta per lo studio della malattia intestinale. La permeabilità intestinale può variare notevolmente da regione a regione e la valutazione specifica del sito di permeabilità per.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal National Health and Medical Research Project Grant APP1021582 e da una sovvenzione dell'Hunter Medical Research Institute sponsorizzata da Sparke Helmore/NBN Triathlon e dall'Estate del compianto Leslie Kenneth McFarlane.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dekantel Sutura in seta non assorbibile | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | Nessun rosso fenolo in quanto interferisce con la fluorescenza |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | Nessun rosso fenolo in quanto interferisce con la fluorescenza |
| N-acetilcisteina | Sigma Aldrich | Utilizzare a 10 mM in terreni | |
| Catetere vascolare per piccoli animali: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Destrano 4.400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Destrano 20.000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Destrano 70.000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
Riferimenti
- Goggins, B. J., Chaney, C., Radford-Smith, G. L., Horvat, J. C., Keely, S. Hypoxia and Integrin-Mediated Epithelial Restitution during Mucosal Inflammation. Frontiers in immunology. 4, 272(2013).
- Otte, J. M., Kiehne, K., Herzig, K. H. Antimicrobia....
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Ristampe e permessi
