Articolo metodologico

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

DOI:

10.3791/53261

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16 ottobre 2015

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1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In questo articolo

Sommario

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Viene presentato un protocollo per lo screening di piccoli farmaci molecolari basato sulla sintesi in situ di nanocluster d'oro fluorescenti ultrapiccoli (Au NCs) utilizzando proteine caricate con farmaci come modello. Questo metodo è semplice per determinare l'affinità di legame dei farmaci a una proteina bersaglio mediante un segnale fluorescente visibile emesso dalle NC Au modellate con

proteina.

Abstract

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Si dimostra un nuovo metodo di screening di farmaci per determinare l'affinità di legame di piccole molecole farmaceutiche per una proteina bersaglio formando nanocluster fluorescenti oro (Au NC) all'interno della proteina-droga caricata, sulla base del segnale di fluorescenza emessa dal differenziale Au NC. Proteine ​​albumina come l'albumina sierica umana (HSA) e albumina sierica bovina (BSA) sono selezionati come le proteine ​​modello. Quattro piccole farmaci molecolari (ad esempio, l'ibuprofene, il warfarin, fenitoina, e sulfanilamide) di diverse affinità di legame alle proteine ​​albumina sono testati. Si è constatato che il tasso di formazione di fluorescenti Au CN all'interno farmaco caricata albumina in condizioni denaturanti (cioè, 60 ° C o in presenza di urea) è più lenta di quella formata nella proteina intatta (senza farmaci). Inoltre, l'intensità fluorescente del CN ​​come formata è risultato essere inversamente correlato alle affinità di legame di questi farmaci alle proteine ​​albumina. In particolare,maggiore è l'affinità di legame farmaco-proteina, più lenta è la velocità di formazione Au NC, e quindi una minore intensità di fluorescenza della risultante Au NC viene osservata. L'intensità di fluorescenza della risultante Au NC fornisce quindi una misura semplice della forza di legame relativa di diversi farmaci testati. Questo metodo è anche estensibile per misurare la costante legame specifico farmaco-proteina (K D) semplicemente variando il contenuto droga precaricato nella proteina ad una concentrazione proteica fissa. I risultati misurati corrispondono bene con i valori ottenuti con altri metodi di prestigio ma più complicati.

Introduzione

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Albumine siero come albumina sierica umana (HSA) e albumina di siero bovino (BSA) sono la proteina più abbondante nel plasma e svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della pressione osmotica del comparto sangue. Sono inoltre riconosciuti come proteine ​​di trasporto per le piccole molecole di bassa solubilità in acqua, come gli steroidi, acidi grassi, ormoni tiroidei, e una vasta gamma di farmaci. L'associazione di proprietà (ad esempio, siti di legame, affinità o la forza vincolante) di queste molecole di siero albumine costituisce un tema importante nella farmacocinetica. 1-4 diversi metodi analitici sono stati sviluppati per studia....

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Protocollo

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Attenzione: consultare le schede di sicurezza (SDS) di tutte le sostanze chimiche coinvolte prima dell'uso. L'esperimento screening di stupefacenti prevede la sintesi e la manipolazione dei nanomateriali, che possono avere rischi aggiuntivi rispetto alla loro controparte massa. Si prega di verificare le misure di controllo necessarie per essere praticato tutto l'esperimento, compreso l'uso di controlli tecnici (cappa) e dispositivi di protezione individuale (DPI, ad esempio, i pantaloni di lunghezza di sicurezza, scarpe chiuse, guanti resistenti ai prodotti chimici, e occhiali di protezione).

1. Preparazione dei rea....

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Risultati

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Protein dispiegarsi un importante metodo per la formazione di proteina-templated Au NC perché gruppi funzionali più reattivi (per esempio, residui di tirosina di una proteina) possono essere esposti per ridurre gli ioni Au incapsulati e accelerare il tasso di formazione di Au NC così. Agenti di riscaldamento e di denaturazione esterno sono due mezzi comuni per promuovere il processo di svolgimento delle proteine. La Figura 1 mostra l'effetto di riscaldamento e l'aggiunta di agenti di denaturazi.......

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Discussione

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Ci sono diversi passaggi critici che devono essere evidenziate in questo metodo. Nel protocollo di screening della affinità di legame relativo dei diversi farmaci molecolari piccoli passi 3.1.2, 3.1.3, 3.1.4 e sono fondamentali per ottenere buoni risultati mostrano tendenza coerente per la forza vincolante relativa. In queste fasi, le azioni di aggiunta di sostanze chimiche e disegno di soluzioni di reazione per la misura dovrebbe essere il più rapidamente possibile per minimizzare l'effetto ritardo e la stessa sequ.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Y.N.T. ringrazia l'Agenzia per la Scienza, la Tecnologia e la Ricerca (A*STAR) di Singapore per il sostegno finanziario nell'ambito della sovvenzione JCO CDA 13302FG063.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione di cloruro d'oro (III), 30%Sigma-Aldrich484385Corrosivo, irritante
Albumina sierica umana, 96%Sigma-AldrichA1887
Albumina sierica bovina, 96%Sigma-AldrichA2153
Ibuprofene, 98%Sigma-AldrichI4883
warfarin, 98%Sigma-AldrichA2250
fenitoinaSigma-AldrichPHR1139
sulfanilamide, 99%Sigma-AldrichS9251
dimetil solfossidoSigma-AldrichD8418
ureaSigma-AldrichU5128
Idrossido di sodioSigma-Aldrich
Agitatore magneticoIKART5
Lettore di micropiastreTecanInfinite M200
Piastra a 384 pozzettiCorning
Pipetta a spostamento d'aria da 5 mlEppendorf
1.000 μ l. pipetta a spostamento d'ariaEppendorf
100 μ l pipetta a spostamento d'ariaEppendorf
5.000 μ l Punte
1.000 μ l Punte
100 μ l. Puntali
provetta da 1,5 mlEppendorf
Fiala in vetro da 20 ml con tappo
Fiala in vetro da 4 ml con tappo
221465EppendorfEppendorfEppendorf Micro a vite a vite

Riferimenti

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  1. Flarakos, J., Morand, K. L., Vouros, P. High-Throughput Solution-Based Medicinal Library Screening against Human Serum Albumin. Anal. Chem. 77, 1345-1353 (2005).
  2. Vuignier, K., Veuthey, J. -L., Carrupt, P. -A., Schappler, J.

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Fluorescent Gold NanoclustersProtein Targeting Drug ScreeningBinding Affinity MeasurementHuman Serum AlbuminFluorescence Intensity AnalysisGold Nanocluster FormationDrug Protein Binding ConstantMicroplate Reader EmissionTemperature Denaturing ConditionsUrea Denaturation Method

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