Articolo metodologico

Rilevazione di intracellulare genica in cellule vive di murini, umana e suina origine utilizzando nanoparticelle di fluorescenza marcata

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DOI:

10.3791/53268

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13 novembre 2015

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1Department of Cardiovascular Surgery, German Heart Center Munich, Technische Universität München, 2Institute for Medical Microbiology, Immunology, and Hygiene, Technische Universität München, 3Clinical Cooperation Groups: "Antigen-specific Immunotherapy" and "Immune Monitoring", Helmholtz Center Munich (Neuhererg), Technische Universität München, 4DZHK (German Center for Cardiovascular Research) – Partner site Munich Heart Alliance

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto descrive una nuova tecnica che permette il rilevamento dell'espressione genica intracellulare dopo l'endocitosi di nanoparticelle marcate con fluorescenza direttamente in cellule vive. Il metodo non richiede la manipolazione delle cellule e non è limitato rispetto al gene o alla specie bersaglio.

Abstract

La riprogrammazione di cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) è stata eseguita con successo in diverse specie di mammiferi tra cui topo, ratto, uomo, maiale e altri. La verifica dei cloni iPS si basa principalmente sulla rilevazione dell'espressione endogena di diversi geni di pluripotenza. Questi geni rappresentano principalmente fattori di trascrizione che si trovano nel nucleo cellulare. Tradizionalmente, la prova della loro espressione endogena è fornita dalla colorazione immunoistochimica dopo la fissazione delle cellule. Questo approccio richiede la replica delle colture di ciascun clone in questa fase iniziale per preservare i cloni convalidati per ulteriori esperimenti. Il presente protocollo descrive un approccio con nanoparticelle gene-specifiche che consente la valutazione dell'espressione genica intracellulare direttamente in cellule vive mediante fluorescenza. Le nanoparticelle sono costituite da una particella d'oro centrale accoppiata a un filamento di cattura che trasporta una sequenza complementare all'mRNA bersaglio e da un filamento reporter estinto. Queste nanoparticelle sono attivamente endocitose e l'mRNA bersaglio sposta il filamento reporter che inizia quindi a emettere fluorescenza. Pertanto, l'espressione di un gene bersaglio specifico può essere rilevata direttamente al microscopio. Inoltre, la fluorescenza emessa consente l'identificazione, l'isolamento e l'arricchimento di cellule che esprimono un gene specifico mediante citometria a flusso. Questo metodo può essere applicato direttamente alle cellule vive in coltura senza alcuna manipolazione delle cellule bersaglio.

Introduzione

Nel 2006, un nuovo approccio è stato descritto per riprogrammare le cellule somatiche in uno stato pluripotente. Dopo preselezione di una serie di fattori di potenziale riprogrammazione fibroblasti murini potrebbero essere convertiti con successo alle cosiddette cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) di trasduzione retrovirale e sovraespressione di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Successivamente questa tecnica è stata efficacemente riprodotto utilizzando cellule somatiche di diverse specie di mammiferi, tra cui gli esseri umani 2, scimmie 3, ratti, cani 4 5 6, pecore e maiali 7. Inoltre, modificati i protocolli omettendo o sostituzione del fattore di trascrizione potenzialmente oncogenico c- MYC sono stati pubblicati 8, 9.

Indipendentemente dalla riprogrammazione iniziale avvicinarsi al vero pluripotenza crescita di colonie deve essere confermata, un'operazione laboriosa e richiede molto tempo. Un grave inconvenientedella maggior parte di queste analisi è che non possono essere eseguite su cellule vive. Fattori pluripotenza affermati come OCT4, SOX2, Nanog o REX1 rappresentano fattori di trascrizione si trova nel nucleo e la loro rilevazione richiede la fissazione delle cellule prima di immunoistochimica o lisi cellulare per RT-PCR analisi. 10 - 12 In seguito, queste cellule sono perse per il futuro esperimenti che richiedono culture repliche di ciascuna colonia.

Così, una tecnologia per analizzare pluripotency su cellule vive è altamente desiderabile. Diversi approcci possono infatti essere eseguite direttamente sulle cellule vive utilizzando anticorpi diretti contro antigeni basato membrana (ad es. TRA-1-60, SSEA4) 12, fluorescente riferito coloranti per rilevare fosfatasi 13 o piccole molecole alcaline che specificamente etichettano staminali embrionali (ES) e cellule iPS 14. Tuttavia, gli anticorpi possono tuttavia alterare le cellule e ogni method è limitato a un solo marcatore pluripotenza. Infine, segnali molecolari fluorescenti, oligonucleotidi antisenso doppia forcella con strutture che consentono colorazione vivo di cellule, sono stati descritti 15. Sebbene questo approccio può essere applicato a molti geni, la tecnica richiede nucleofection di una sospensione di cellule singole, che non è applicabile alle crescenti iPS colonie.

Un paio di anni fa nanoparticelle gene-specifici sono stati descritti per analizzare l'espressione survivina in SKBR3 cellule di carcinoma mammario umano 16. Questo manoscritto descrive un approccio innovativo romanzo di individuare marcatori pluripotenza in ES live e le cellule iPS attraverso l'utilizzo di nanoparticelle d'oro coniugati. Queste nanoparticelle costituite da una particella centrale oro con un filo di cattura accoppiato trasporta la sequenza di RNA complementare e una ciocca giornalista Cy3-marcato. Il segnale fluorescente del filamento giornalista si spegne dalla particella oro centrale. Inoltre, appropriatananoparticelle servono come controlli negativi e positivi, rispettivamente (Figura 1). Per un'applicazione nanoparticelle sono semplicemente aggiunti al mezzo di coltura (Figura 2) ed entrano nelle cellule tramite endocitosi (Figura 3). Se RNA bersaglio è espresso sposta il filamento giornalista che poi emette un segnale fluorescente. Questo metodo non richiede la manipolazione della cellula bersaglio e l'espressione del gene bersaglio può essere monitorato otticamente sotto un microscopio a fluorescenza direttamente in cellule vive. Inoltre, la tecnologia può essere applicata a qualsiasi gene bersaglio desiderato tra le specie nel caso di cellule iPS e quindi può essere impiegato in molte aree di ricerca diverse. Infine, citometria a flusso analizza consentire l'identificazione e l'arricchimento di cellule positive Cy3.

Protocollo

1. Preparazione dei Media, Reagenti e cellulare Cultura Condizioni

  1. HEK umano 293 cellule renali di embrioni
    1. Cultura HEK 293 cellule (CRL-1573, ATCC) in F-12 a medio DMEM / di Ham integrato con 5% FCS, L-glutammina (2 mm), e la penicillina (100 U / ml) / streptomicina (100 mg / ml).
    2. Per il passaggio delle cellule, lavare le cellule una volta con PBS, aggiungere 0,05% tripsina / EDTA e incubare per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm (300 x g) e trasferire circa 5x10 5 cellule in un pallone di coltura fresco T25.
  2. Fibroblasti embrionali murini (MEF)
    1. Aggiungere 1 ml di una soluzione di gelatina 0,1% ai singoli 6-pozzetti ed incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 ora. Aspirare liquido e conservare a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
    2. Culture MEF in DMEM supplementato con 10% FCS, L-glutammina (2 mM), L-glucosio (4,5 g / l), piruvato di sodio (1 mM), e la penicillina (100 U /ml) / streptomicina (100 mcg / ml) su piastre da 6 pozzetti rivestiti di gelatina.
    3. Distribuire MEF in 6 pozzetti e farli crescere fino a confluenza. Aggiungere mitomicina (5 mg / ml) per 2,5 ore per arrestare cellule. Aspirare il terreno, lavare le cellule due volte con media MEF completo e aggiungere 3 ml di mezzo MEF per ogni 6-bene. Queste cellule servono come alimentatore strati per cellule murine e IPS suina.
  3. Cultura di ES murine e cellule iPS
    1. Per preparare topo ES terreno di coltura, integrare terreno DMEM con 15% FCS, L-glutammina (2 mM), L-glucosio (4,5 g / l), aminoacidi non essenziali MEM (1X), β-mercaptoetanolo (0,1 mM) e fattore inibitorio della leucemia (1.000 U / ml).
    2. Sciacquare 6-pozzetti con MEFs crescita arrestato una volta con DMEM senza siero, aggiungere 2 ml di topo ES medio e cellule iPS murine (20% delle cellule di un piatto confluenti). Ogni giorno le cellule lavare una volta con DMEM senza siero e aggiungere 2 ml di mouse fresco ES medie.
    3. Per il passaggio delle cellule, lavare i pozzetti una volta con DMEM senza siero, aggiungere 0.25% Tripsina / EDTA e incubare per 3 minuti a 37 ° C e 5% CO 2. Trasferire le cellule in un tubo 15 ml, centrifugare per 5 min a 1.200 giri (300 x g), Risospendere le cellule in 500 microlitri topo ES medio e aggiungete 100 ml di sospensione di 2 ml di topo ES medie un nuovo 6-bene con una MEF alimentatore-layer.
  4. Cultura di maiale cellule ips
    1. Per preparare maiale iPS medio, integrare DMEM / Ham F-12 di media con il siero del 20% a eliminazione diretta, L-glutammina (2 mm), aminoacidi non essenziali MEM (1X), β-mercaptoetanolo (0,1 mm), e la penicillina (100 U / ml) / streptomicina (100 mcg / ml). Filtrare attraverso un filtro di 0,22 micron e conservare a 4 ° C per 2 o 3 settimane. Al primo utilizzo, aggiungere bFGF (10 ng / ml concentrazione finale).
    2. Sciacquare 6-pozzetti con MEFs crescita arrestato una volta con DMEM senza siero / Ham F-12 e aggiungere 1,5 ml di maiale iPS medie e suina cellule ips (il 10% delle cellule di un piatto confluenti). Ogni giorno Lavare le cellule una volta con DMEM senza siero / Ham F-12 e aggiungere 1,5 ml di maiale fresca iPS medie.
    3. Per preparare tampone di dissociazione aggiungere 2,5% tripsina, collagenasi IV (10 mg / ml), siero knockout (20%) e CaCl 2 (1 mM) per Ca 2+ -free PBS. Lavare le cellule due volte con PBS e incubare con tampone di dissociazione per 5 min a 37 ° C e 5% CO 2. Trasferire le cellule in una provetta 15 ml, centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm (300 x g).
    4. Risospendere le cellule iPS suina in 500 microlitri suine fresche iPS medio e aggiungete 50 ml di sospensione di 1,5 ml maiale iPS medie un nuovo 6-bene con un alimentatore MEF-layer. Ogni giorno Lavare le cellule una volta con DMEM senza siero / F-12 e aggiungere 1,5 ml di prosciutto di maiale fresco iPS media.
  5. Cultura libera-Feeder di cellule iPS umane
    1. Scongelare il flacone originale contenente la preparazione membrana basale a 4 ° C e diluire con gelida senza siero DMEM / Ham F-12 a 8 mg / ml, aliquota e conservare a -20 ° C fino a nuovo uso.
    2. Scongelare una aliquota di basezione preparazione membrana a 4 ° C e diluire con DMEM / F12 ghiacciata senza siero di Ham (90 mcg / ml). Pipettare 1 ml di questa soluzione in 3 cm capsule di Petri e miscelare delicatamente per assicurare che l'intera superficie è coperta. Sigillare piatti con parafilm e conservare a 4 ° C per un massimo di una settimana. Prima l'uso di colture cellulari incubare piatti per 30 min a 37 ° C o 3 ore a temperatura ambiente per permettere la polimerizzazione del preparato membrana basale.
    3. Aspirare medio dai piatti rivestito con la preparazione membrana basale e lavare due volte con DMEM senza siero / Ham F-12. Aggiungere 1,5 ml E8 medio piatto cultura e cellule iPS umane (10% delle cellule di un piatto confluenti). Ogni giorno Lavare le cellule una volta con DMEM senza siero / F-12 e aggiungere 1,5 ml di mezzo E8 fresco di Ham.
    4. Per il passaggio delle cellule, lavare i piatti due volte con PBS e aggiungere 1 ml di PBS / EDTA 0,5 mm. Incubare i piatti per 5 minuti a temperatura ambiente. Monitorare le cellule al microscopio. Nota: Quando le colonie cominciano a radunare e APPEar di avere buchi che sono pronti per il trasferimento.
    5. Aspirare il liquido, aggiungere 1,5 ml E8 medio e staccare le cellule pipettando gentilmente su e giù. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml, centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm (300 x g), risospendere in 500 microlitri E8 medio e aggiungere 50 ml di sospensione di 1,5 ml E8 medio in un piatto di coltura fresco rivestito con la preparazione membrana basale .

2. Progettazione di target sequenze tra le specie Borders

  1. Selezionare umano di riferimento, murino e sequenze di cDNA suina dei geni bersaglio (GAPDH, Nanog, GDF3) ed eseguire un allineamento CLUSTAL analisi multi-sequenza.
    Nota: Questo indicherà le sequenze omologhe tra le specie.
    1. Utilizzare le seguenti impostazioni per l'allineamento multiplo: gap penalty (fisso) 10, gap penalty (variabile) 5, la transizione ponderazione dello 0, gamma divario pena di separazione 8% di identità per il ritardo di 40, massimo numero di iterazioni da eseguire 3.
  2. Invia sequenze target desiderati al produttore (vedi Tabella dei Materiali) per la progettazione e la produzione della sonda.
    Nota: Il produttore sarà quindi confermare la compatibilità di sequenza desiderata con la tecnologia. Se sequenza desiderata non è compatibile, il produttore suggerisce sequenze alternative.
    1. Assicurarsi che le regioni omologhe che possono essere usati come potenziali sequenze di acquisizione dei filamenti hanno una lunghezza di 27 bp.
      Nota: Si consiglia di ordinare diversi nanoparticelle con diversi filoni di cattura per un gene bersaglio selezionato come solo il vero esperimento cellulare darà una prova definitiva della funzionalità di una sequenza individuale. Quindi, due sequenze differenti per GAPDH e GDF3 stati valutati mentre tre differenti nanoparticelle sono stati testati per valutare l'espressione NANOG. La loro posizione e le sequenze esatte sono state pubblicate altrove 17. Il produttore produce commercialmente il nanoparticoli con le sequenze desiderate e li fornisce in formato liofilizzato.

3. Ricostituzione di nanoparticelle e aggiunta di colture cellulari

  1. Conservare nanoparticelle liofilizzati sulla ricevuta a 4 ° C al buio.
  2. Ricostituire nanoparticelle mediante aggiunta di 50 microlitri di acqua bidistillata che dà una concentrazione finale di 100 nM. Una volta ricostituito negozio nanoparticelle a RT al buio. Nota: In questa condizione sono stabili per almeno un anno. Conservazione dei campioni ricostituiti a 4 ° C può influire negativamente sulla loro stabilità.
  3. Pre-diluire la soluzione di nanoparticelle magazzino con PBS a una concentrazione di 2 (cellule HEK 293) o 8 Nm (iPS e le cellule ES), il giorno di applicazione. Nota: Questa concentrazione è di 20 volte superiore alla concentrazione finale nel piatto cultura. Nelle cellule ES e le cellule iPS, 400 pM di nanoparticelle indotto un segnale fluorescente facilmente rilevabile sotto il microscopio. Per HEK 293 cellule, aconcentration di 100 pM è sufficiente.
  4. Dispensare 12.5 ml di nanoparticelle prediluiti a un 24-pozzetti contenenti 237,5 ml terreno di coltura cellulare completo. Per i pozzi di dimensioni diverse, regolare i volumi di conseguenza. Agitare accuratamente la piastra per garantire un'equa distribuzione delle nanoparticelle. Incubare le cellule overnight (O / N) a 37 ° C e 5% di CO 2 in atmosfera umidificata.
  5. Il giorno dopo l'analisi di colture cellulari per gene-specifico Cy3 fluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 546 nm (emissione 575-640 nm) sotto un microscopio a fluorescenza. Nota: Il tempo necessario per ottenere un sufficiente forte fluorescenza può dipendere dal tipo di cellula e il gene bersaglio. In questi esperimenti, questa è stata osservata tra 16 e 20 ore dopo l'applicazione della sonda.

4. Identificazione di Cy3 positivi cellule popolazioni mediante citometria di flusso

  1. Crescere HEK 293 o cellule ES murine utilizzando le condizioni di cui al punto 1.1 o 1.3, respectively. Un giorno prima della FACS aggiungere GAPDH nanoparticelle specifico d'a diverse concentrazioni di cellule HEK 293 (vedere Figura 6A) e a 400 pM murino cellule ES. Incubare le cellule O / N a 37 ° C e 5% di CO 2 in atmosfera umidificata.
  2. Analizzare colture cellulari per specifici gene della fluorescenza indotta Cy3 al microscopio a fluorescenza.
  3. Staccare HEK 293 cellule, come specificato al punto 1.1.2. Centrifuga, il trasferimento in una provetta da 1,5 ml e risospendere in 200 ml ghiacciata PBS / 0,5% BSA / 2 (tampone FACS) mm EDTA. Mantenere celle buie in ghiaccio fino citometria a flusso.
  4. Staccare cellule ES murine come specificato al punto 1.3.3. Centrifuga, il trasferimento in una provetta da 1,5 ml e risospendere in 200 ml ghiacciata PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA. Mantenere celle buie in ghiaccio fino citometria a flusso.
  5. Premere le cellule attraverso un filtro 30 micron a prevenire l'aggregazione cellulare e aggiungere ioduro di propidio (concentrazione finale 2 mg / ml) 2 minprima dell'analisi FACS di escludere le cellule morte.
  6. Per analizzare le cellule Cy3-positive primo set cancelli gerarchici sul FSC-A / SSC-A sottoinsieme, il FSC-H / FSC-W-sottogruppo e il sottoinsieme SSC-H / SSC-W. Utilizzare l'attaccante e la dispersione lato di escludere detriti cellulari e le cellule che non sono sparsi. Escludere le cellule morte dalla loro colorazione ioduro di propidio visualizzazione PE verso PE-Texas Red. Eseguire il cancello sorta finale sulle cellule positive Cy3-PE (Figura 4).

Risultati

In un primo tentativo di verificare ed accertare la rilevazione intracellulare dell'espressione genica specifica in cellule vive utilizzando nanoparticelle abbiamo deciso di condurre esperimenti pilota con un house-keeping costitutivamente espresso gene (GAPDH) di HEK 293 cellule umane. La concentrazione di nanoparticelle utilizzati in questi esperimenti è stata scelta secondo le raccomandazioni del fabbricante. L'aggiunta di una sonda -specific GAPDH al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 100 pM indotta una chiara Cy3 fluorescenza in queste cellule, che era visibile sotto un microscopio a fluorescenza dopo O / N incubazione (Figura 5A). Due controlli sono stati inclusi in questi esperimenti per dimostrare il risultato. Uno di controllo comprende un cosiddetto nanoparticelle "scramble" dove il filamento giornalista non ha una sequenza corrispondente in cellule di mammifero o eucariotiche. Il nanoparticelle "scramble" determina lo sfondo non specifico fluorescence causa di possibile degradazione della sonda o tempra incompleta della fluorescenza. L'aggiunta della sonda scramble prodotto un unico segnale marginale fluorescente, che è trascurabile (Figura 5B). Un controllo "assorbimento" permanentemente fluorescente aiuta a determinare la capacità delle cellule di incorporare le nanoparticelle per endocitosi che può variare tra i diversi tipi cellulari. Queste particelle controllo positivo ha prodotto un segnale fluorescente in cellule HEK 293 (Figura 5C). Così, è stata confermata la fattibilità della tecnologia per registrare un segnale fluorescente specifica di un gene intracellulare con un segnale di fondo trascurabile. Va detto che la differenza tra il segnale di fondo e la fluorescenza specifica diminuisce nel tempo. Lo sfondo incrementi per sondare il degrado o tempra incompleta mentre la fluorescenza specifica sfuma gradualmente (Figura 5D). Le stesse nanoparticelle specifico d'GAPDH hannostato testato in colture primarie di fibroblasti di topo, suina e ovina di origine 17. Queste cellule producono un segnale di fondo molto più alto di cellule HEK 293 mentre la fluorescenza specifica-bersaglio è piuttosto debole, probabilmente a causa della relativamente bassa capacità proliferativa di queste culture.

Questi esperimenti pilota ci hanno spinto a utilizzare questa tecnologia per la rilevazione dell'espressione genica pluripotenza in iPS derivate da specie diverse. A tale scopo NANOG e GDF3 stati analizzati, entrambi i quali sono noti per essere espresso in cellule pluripotenti 18. Alle prime cellule iPS derivate da fibroblasti coda punta di un Nkx2.5 enhancer cardiaco topo transgenico linea 19 sono stati studiati. Per entrambi i geni un forte segnale fluorescente è stato ottenuto (Figura 6A) e una trascurabile Cy3 fluorescenza del controllo scramble (dati non mostrati). Risultati simili sono stati ottenuti in cellule iPS umane e suine (Figura 6B e C). È importante sottolineare che il segnale di fluorescenza è stata limitata alle colonie IP e non etichettare i fibroblasti utilizzati come strato alimentatore per mouse e iPS suina (vedi frecce nella Figura 6A e C). L'analisi dell'espressione genica Nanog ha anche rivelato che non tutte le sequenze previsto in silico di essere "buona" finalmente è funzionale. Uno dei tre progetti di un NANOG nanoparticelle specifico d'indotti quasi nessun segnale fluorescente paragonabile a quella del controllo scramble nonostante una corrispondenza sequenza 100% in cellule iPS murine (Figura 6D). Un risultato simile è stato ottenuto sulle cellule iPS umane e origine suina con questa sonda (dati non mostrati). Così, le nanoparticelle possono essere utilizzati per rilevare l'espressione del gene attraverso pluripotency specie confini mentre la funzionalità di ogni singola sonda progettata deve essere valutata in anticipo.

I risultati promettenti del in situl'etichettatura di cellule vive in piatti di coltura cellulare ci ha spinto ad analizzare l'espressione genica quantitativamente mediante citometria a flusso. A tal fine GAPDH nanoparticelle specifico d'sono stati aggiunti a concentrazioni graduate per HEK 293 monostrati al fine di confrontare l'efficienza di etichettatura all'interno della popolazione di cellule bersaglio. Come valutati da un microscopio a fluorescenza maggiore fluorescenza Cy3 indotta è stato visto con la concentrazione più bassa rispetto alle cellule che non hanno ricevuto le nanoparticelle. Concentrazioni crescenti di nanoparticelle indotto una concentrazione dipende chiaramente fluorescenza delle cellule HEK 293 in situ (Figura 7A). Sottoporre queste cellule per l'analisi di citometria di flusso confermato il dipendente efficienza etichettatura concentrazione. La frequenza di cellule positive Cy3 significativamente aumentato (più di sette volte) quando la più alta concentrazione di nanoparticelle è stata applicata (Figura 7B). In ulteriori esperimenti ES cellule dal cardiaco Nkx2.5enhancer transgenici linea di topi 19 sono stati utilizzati per analizzare l'espressione dei geni pluripotenziali mediante citometria di flusso. Esperimenti pilota con 400 pM del controllo assorbimento positivo hanno prodotto chiaramente Cy3 positivi ES vivo colonie sotto il microscopio e citometria a flusso rilevati quasi il 40% di cellule positive Cy3 (Figura 7C). In contrasto, paragonabile a cellule non trattate circa 0,1% di cellule trattate con scramble macchiato positivo (dati non mostrati). Allo stesso modo l'aggiunta di nanoparticelle specifici per GAPDH, Nanog e GDF3 indotto un segnale di fluorescenza distinta in colonie individuali nel piatto di coltura cellulare. La frequenza di cellule positive Cy3 per GAPDH come determinato mediante citometria di flusso era paragonabile a quello visto per entrambi i geni pluripotenza (Figura 7C). Questo risultato è prevedibile come sono anche pensato Nanog e GDF3 essere espresso costitutivamente in cellule ES pluripotenti. Quindi, questi dati chiaramente indiCate che cellule esprimenti un gene particolare possono essere identificati tramite analisi citofluorimetrica, qualitativamente e dalla loro quantità relativa.

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Figura 1: Rappresentazione schematica della struttura delle nanoparticelle. (A) Struttura di una nanoparticella gene-specifico. (B) nanoparticelle Scramble (controllo negativo). (C) Assorbimento nanoparticelle (controllo positivo). Adattato da Lahm et al. 17, ristampato con il permesso di Wiley.

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Figura 2: Applicazione delle nanoparticelle to Cell Cultures Una soluzione diluita di nanoparticelle correttamente viene pipettato semplicemente nel mezzo di coltura.. Dopo O / cellule specifiche del gene incubazione N fluorescenti sono visibili sotto af Microscopio luorescent.

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Figura 3:. Uptake attivo di nanoparticelle da parte delle cellule tramite endocitosi (A) Le cellule fagocitare attivamente le nanoparticelle per endocitosi (B) target mRNA si lega al filo di cattura e sposta il reporter fluorescente..

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Figura 4: strategia di gating per citometria a flusso. (A) strategia per HEK 293 cellule. (B) Strategia per le cellule embrionali murine. I dati sono stati acquisiti tramite dispositivo 1 per HEK 293 cellule o dispositivo 2 per le cellule embrionali murine e sono stati successivamente analizzati mediante uno strumento software (vedi Tabella dei Materiali).

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Figura 5:. Analisi di GAPDH -expression in cellule HEK 293 A GAPDH nanoparticella -specific inserito le cellule a 100 PM (concentrazione finale) e la fluorescenza è stata registrata dopo O / N incubazione (A) GAPDH nanoparticelle -specifica (B.. ) Scramble (controllo negativo). (C) Assorbimento (controllo positivo). (D) Cinetica di corsa e di controllo assorbimento. La fluorescenza è stata determinata nei punti temporali indicati dopo l'aggiunta di nanoparticelle specifico d'GAPDH. Barre di scala rappresentano 50 micron.

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Figura 6:. Analisi di pluripotenza genica in cellule iPS di differenti specie nanoparticelle specifico per Nanog o GDF3 sono stati aggiunti alle cellule a 400 PM (conce finalentration) e la fluorescenza è stata registrata dopo O / N incubazione. (A) cellule murine iPS. (B), le cellule iPS umane. (C), le cellule iPS Suini. Frecce in (A) e (C) designano cellule feeder-layer di fibroblasti non marcato. (D) fluorescenza nelle cellule iPS murine dopo aggiunta del NANOG-design SF3 nanoparticelle. Barre di scala rappresentano 50 micron.

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Figura 7: Nanoparticle etichetta cellule vive può essere identificato mediante citometria di flusso. (A) Vista microscopica di Cy3 HEK positivo 293 cellule dopo l'aggiunta di diverse concentrazioni di nanoparticelle. (B) Frequenza di cellule positive Cy3 determinati mediante citometria a flusso. (C) diretta colorazione murine colonie di cellule ES e determinazione della frequenza di Cy3 positiva cellule. Sono stati aggiunti Nanoparticellead una concentrazione finale di 400 pM. Barre di scala rappresentano 50 micron.

Discussione

Il presente lavoro descrive l'uso di fluorescenza etichettati nanoparticelle che consentono la valutazione affidabile dell'espressione genica intracellulare direttamente in cellule vive di diverse specie di mammiferi con diversa origine istogenetica sotto un microscopio a fluorescenza. Questo approccio ha un paio di vantaggi rispetto ad altri metodi pubblicati. Innanzitutto il ricercatore non è limitato in relazione sia gene bersaglio o tipo cellulare. Tutti i metodi di rilevamento di anticorpi base sono limitati a un singolo epitopo. Sebbene beacon molecolari fluorescenti possono anche essere progettati per un ampio spettro di geni, questo metodo richiede la dissociazione delle cellule e la successiva nucleofection 15. Al contrario, l'applicazione di nanoparticelle gene-specifici non richiede alcuna manipolazione della cellula bersaglio che avvolge le nanoparticelle attivamente per endocitosi. Durante la successiva passaging le particelle d'oro gradualmente lasciano le cellule e la cultura possono essere utilizzati in downstream esperimenti.

Tuttavia, anche la tecnologia presenta ancora alcuni limiti. Alcuni marcatori non sono ovviamente rilevabili causa della loro natura di carboidrati come SSEA-1 o TRA-1-81 20. Attualmente, una vasta gamma di nanoparticelle è disponibile in commercio. Queste particelle sono state pre-testato per la loro funzionalità in esperimenti cellulari. L'obiettivo del presente lavoro è stato quello di progettare sonde personalizzate che possono essere utilizzati tra le specie delle frontiere. Quando si seguono un tale approccio o quando si progetta una sonda per un romanzo un gene bersaglio deve essere consapevoli del fatto che la funzionalità di un in silico predetto sonda deve essere attentamente valutata in vitro. La sonda Nanog-SF3 che ha mostrato una omologia del 100% per l'omologia sequenza non ha funzionato affatto, mentre Nanog-SF1 con una base non corrispondenti nel murino e la sequenza suina ha prodotto un segnale di bel fluorescenza. Un'altra questione riguarda l'assorbimento efficiente delle nanoparticelle. Le particelle entranole cellule per endocitosi, un processo che è influenzata dalle dimensioni delle nanoparticelle 21, il tipo di cellula e lo stato di differenziazione 22 e la capacità cellulare per eseguire phago- e macropinocitosi 23. La concentrazione ottimale per ottenere un segnale di fluorescenza soddisfacente deve essere testati per ogni singola applicazione o linea cellulare. A tal fine, il primo esperimento deve sempre essere l'applicazione del controllo assorbimento di valutare la compatibilità delle sonde all'interno dei tipi di cellule e condizioni di coltura prima di passare rilevazione dell'espressione genica specifica destinazione.

Un punto critico per ottenere risultati affidabili quando si applica questo protocollo per una linea cellulare romanzo o popolazione di cellule è l'inclusione di controlli adeguati. Il controllo assorbimento mai fluorescenti fornirà una indicazione che le concentrazioni di nanoparticelle indurranno un segnale fluorescente sufficiente nella popolazione di cellule bersaglio. La fluorescenza deve essere valutared il giorno successivo, il segnale si esaurirà con il tempo 17. Allo stesso tempo, il controllo corsa senza un omologo nel genoma eucariotico applicata ad una concentrazione identica deve indurre un segnale di fondo trascurabile. Come terzo controllo è consigliabile utilizzare una nanoparticella specifica per un gene housekeeping (GAPDH esempio, β-actina). Queste nanoparticelle servono come controllo positivo che l'approccio può essere utilizzato per rilevare l'espressione genica specifica nella popolazione di cellule bersaglio selezionato. Se questi controlli risultano una soddisfacente si può aspettare di ottenere segnali fluorescenti specifiche affidabili utilizzando nanoparticelle specifici per altri geni bersaglio. La concentrazione delle nanoparticelle applicate può anche essere critico come hanno dimostrato di down-regolare la sequenza bersaglio 24. Tuttavia, questo effetto richiede concentrazioni molto più elevate (5 nM) rispetto alle concentrazioni usate negli esperimenti qui presentati (400 pM). A questa concentrazione il nanoflares non influiscono gene bersaglio mRNA o livelli di proteine ​​e concentrazioni elevate come 2 nm non compromettere la proliferazione di HEK293 e cellule ES murine 17. Inoltre, tutta una analisi di espressione del genoma non ha rivelato cambiamenti significativi nell'espressione genica 25. Pertanto, a concentrazioni fino a 1 nM le nanoflares non devono presentare alcun effetto avverso importanti.

Un'applicazione molto promettente di questa tecnologia è la possibilità di etichettare qualsiasi popolazione di cellule che è caratterizzato da un gene specifico. Recentemente, nanoparticelle gene-specifici sono stati utilizzati con successo per colorare selettivamente miociti ventricolari in diretta 26, sottopopolazioni di cellule di melanoma 27, 28 e monociti cellulari cerebellare culture 29. Tali popolazioni di cellule fluorescenza marcati possono essere ordinati e purificati mediante citometria a flusso delle cellule come vive. Nel campo dell'oncologia è immaginabile per isolare le cellule tumorali metastatiche vivo in modelli animalisulla base della loro espressione di CEA, più prezioso per la ricerca del potenziale metastasi promuovere geni o strutture bersaglio. Abbiamo recentemente dimostrato che veramente riprogrammati murine iPS colonie possono essere identificati in situ con Nanog nanoparticelle specifico d'basati sulla fluorescenza rilevata 17. Pertanto, l'identificazione delle colonie IPS veramente riprogrammati potrebbe essere eseguita su piattaforme high throughput, che utilizzano il rilevamento della fluorescenza robotica e dispositivi di prelievo per identificare le colonie più promettenti. Questa tecnologia sembra essere adatto in molte aree di ricerca per selezionare sottopopolazioni cellulari specifici e sembra possibile applicare le nanoparticelle nelle piattaforme high throughput. In conclusione, questo protocollo rappresenta un nuovo approccio con fluorescenza etichettati nanoparticelle che permette la rilevazione dell'espressione genica intracellulare direttamente in cellule vive. Questa tecnologia può essere un valido strumento per purificare, espandere e ulteriore carattereize sottopopolazioni cellulari rare in molte aree di ricerca.

Dichiarazioni

HL ha ricevuto le nanoparticelle da Merck Millipore Corporation gratuitamente. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Lynette Henkel per il suo eccellente supporto nell'esecuzione dell'analisi citofluorimetrica. Ringraziamo il Dr. Don Weldon e il Dr. Victor Koong (Temecula, CA) per la lettura critica del manoscritto e per gli utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione tedesca per la ricerca, KR-3770-7/1 e KR-3770-9/1 (M. K.), dalla Deutsche Stiftung für Herzforschung, F/37/11 (M. K.), dal Dr. Rusche Research Grant 2014 dalla Deutsche Stiftung für Herzforschung e dalla Deutsche Gesellschaft für Thorax-, Herz- und Gefässchirurgie (M.-A. D.), e il Deutsches Zentrum für Herz- und Kreislaufforschung Säule B Projekt, DZHK B 13-050A e DZHK B 14-013SE (M. K.).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/Ham's F12 medium con glutammina stabileBiochrome GmbHFG4815
Siero fetale di vitelloLife TechnologiesSV30160.03
Penicillina/Streptomicina (100x)MilliporeA2213
Piruvato di sodio (100x)Life Technologies11360-039
DMEM alto glucosio con glutammina stabileBiochrome GmbHFG0435
Mitomicina CRoche10 107 409 001previene la divisione cellulare degli
aminoacidi non essenziali MEM MEM (100x)Life Technologies11140-050
b-MercaptoetanoloSigmaM3148
Fattore inibitorio della leucemia (107 U/ml)MilliporeESG1107fattore di crescita per cellule ES e iPS mure, previene la differenziazione
0,25% Tripsina/EDTA (1x)Life Technologies25200-056stacca le colture cellulari aderenti
Siero knockoutIntegratore Invitrogen10828-028per colture cellulari iPS umane e suine
bFGFPeprotech100-18Bfattore di crescita per cellule iPS umane e suine
Collagenasi IVWorthingtonLS004188dissociazione di cellule iPS di maiale
MatrigelCorning354277superficie efficace per la coltura senza alimentatore di cellule iPS umane, indicata come membrana di preparazione basale nel manoscritto
E8 mediumStem Cell Technologies05940terreno definito per la coltura senza feeder di cellule iPS umane su Matrigel
EDTA 0.5 MInvitrogen15575-038
SmartFlare ProbesEMD Millipore Corporationpersonalizzato l'identificazionedell'espressione genica intracellulare in cellule vive, denominate nanoparticelle nel manoscritto
Microscopio a fluorescenzaZeissAxiovert 200M
HeraCell 150i CO2 IncubatoreThermo Scientific51026282
Gelatina (da pelle suina)SigmaG6144migliora l'attaccamento dei MEF in superficie
Ioduro di propidio (1 mg/ml)SigmaP4864marcatura le cellule morte nelle analisi citofluorimetriche
BD FACS Aria IlluBecton DickinsonA4544indicato come dispositivo 1 nella Figura 4
NaviosBeckman Coulter775213indicato come dispositivo 2 nella Figura 4
FloJo vX 10.0.7r2Treestarper l'analisi dei dati di citometria a flusso
ha Software

Riferimenti

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