Questo protocollo descrive la decellularizzazione dei reni di ratto Sprague Dawley mediante perfusione anterograda di detergenti attraverso il sistema vascolare, producendo matrici extracellulari renali acellulari che fungono da modelli per il ripopolamento con cellule epiteliali renali umane. La ricellularizzazione e l'uso del saggio di perfusione della resazurina per monitorare la crescita vengono eseguiti all'interno di bioreattori di perfusione appositamente progettati.
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Articolo metodologico
Ripopolamento cellule epiteliali e preparazione di roditori matrice extracellulare Ponteggi per lo sviluppo del tessuto renale
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Dettagli Questo protocollo la generazione di acellulare, ancora biofunzionali, renali matrice extracellulare (ECM) ponteggi che sono utili come piccoli substrati del modello di sviluppo tessuto dell'organo scala. Sprague Dawley reni di ratto sono cannulati inserendo un catetere nell'arteria renale e perfusi con una serie di detergenti bassa concentrazione (Triton X-100 e sodio dodecil solfato (SDS)) su 26 hr derivare intatte, impalcature intero renali con intatta vascolarizzazione perfusable, glomeruli e tubuli renali. Dopo decellularization, l'impalcatura renale si deposita in un recipiente perfusione bioreattore progettati su misura, e l'arteria renale cateterizzato è collegato ad un circuito di perfusione costituito da: una pompa peristaltica; tubi; e sonde opzionali per pH, ossigeno disciolto, e la pressione. Dopo la sterilizzazione il ponteggio con acido peracetico ed etanolo, e del bilanciamento del pH (7,4), il ponteggio rene viene preparato per la semina tramite perfusione di terreno di coltura in un large capacità incubatore mantenuto a 37 ° C e 5% CO 2. Quaranta milioni corticale epiteliali tubolari (RCTE) cellule renali vengono iniettate attraverso l'arteria renale e rapidamente perfusi attraverso scaffold sotto alto flusso (25 ml / min) e pressione (~ 230 mmHg) per 15 min prima di ridurre la portata ad una frequenza fisiologica (4 ml / min). Cellule RCTE popolano soprattutto la ECM nicchia tubolare all'interno della corteccia renale, proliferano e formano strutture epiteliali tubulari oltre sette giorni di coltura perfusione. Una soluzione resazurina 44 micron in terreno di coltura è perfuso attraverso il rene per 1 ora durante gli scambi medi per fornire un fluorimetrico, basato redox-valutazione metabolica di vitalità e proliferazione cellulare durante tubulogenesi. Il bioreattore perfusione renale consente campionamento non invasivo di media per la valutazione biochimica, e molteplici luci di immissione permettono semina retrograda alternativo attraverso la vena renale o dell'uretere. Questi protocolli possono essere usati per recellularize scaffold renali convarietà di tipi cellulari, tra cui cellule endoteliali vascolari, epiteliale tubulare, e fibroblasti stromali, per la valutazione rapida all'interno di questo sistema.
Introduzione
Poiché il numero di pazienti affetti da insufficienza renale all'ultimo stadio continua ad aumentare, vi è una carenza grave e crescente nel numero di donatori reni disponibili per il trapianto. L'incapacità di soddisfare la richiesta di un numero sempre crescente di candidati wait-vendita per il trapianto di rene ha spinto la ricerca in ingegneria organo rene con l'obiettivo finale di sviluppare su misura, innesti renali impiantabili su richiesta 1,2. Costruire funzionante tessuto renale dalle stesse cellule del paziente eliminerebbe la necessità di immunosoppressione per tutta la vita, diminuire la quantità di tempo che i pazienti trascorrono....
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Protocollo
ETICA DICHIARAZIONE: Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida approvate dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale della Northwestern University.
1. Rene Decellularization
- Preparare soluzioni decellularization. Preparare i seguenti volumi di reagenti per ciascun rene da decellularized, più un volume aggiuntivo (ad esempio, per 4 reni, preparare 5.000 ml Triton X-100 per passo 1.1.3.):
- Preparare 500 ml di acqua di osmosi inversa (ROH 2 O). Nota: In alternativa, l'acqua deionizzata può essere utilizzato in fasi in cui è indicato ROH....
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Risultati
I reni sequenzialmente perfusi con acqua e diluire soluzioni detergenti (1% Triton X-100, 0,1% SDS) secondo una precedentemente stabilito, protocollo ottimale decellularization (vedere Figura 1A, B) 7, diventa progressivamente più trasparente su un periodo di 26 ore, come mostrato nella Figura 2A. La risultante impalcatura rene acellulare è privo di cellule e mantiene un ECM renale coesa supportato da una capsula renale intatta, che è intatto seguendo il protocollo di perfusi.......
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Discussione
Il protocollo descritto decellularization produce costantemente una ECM rene completamente acellulare che serve da modello 3D per coltura di cellule umane renali corticali tubulari epiteliali (sia prossimale e distale del tubulo-derivato), in aggiunta a cellule endoteliali vascolari 7,17. Il sistema vascolare renale cannulata serve come elemento chiave per la consegna uniforme dei reagenti e cellule in tutto il ponteggio all'interno di un bioreattore set-up, permettendo così la perfusione decellularizatio.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il supporto della Zell Family Foundation. Riconosciamo il sostegno della Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, dell'American Society of Transplant Surgeon's Faculty Development Grant e di una sovvenzione di ricerca per il giovane ricercatore della National Kidney Foundation dell'Illinois. Ringraziamo la Robert R. McCormick Foundation. Questo lavoro è stato supportato anche da NIDDK K08 DK10175 a J.A.W. I nuclei di imaging e istologia utilizzati per questa ricerca sono supportati dal Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, dall'Electron Probe Instrumentation Center (EPIC) e dal Simpson Querrey Instit....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| TRITON X-100, grado proteomico, AMRESCO | VWR | M143-4L | |
| Soluzione di sodio dodecil solfato, BioUltra, per biologia molecolare, 20% in H2O | Sigma-Aldrich | 05030 | |
| Soluzione di acido peracetico, purum, ~ 39% in acido acetico (RT) | Sigma-Aldrich | 77240 | Il peracetico è infiammabile e corrosivo. Preparare all'interno di una cappa aspirante utilizzando adeguati dispositivi di protezione individuale (ad es. guanti, occhiali). |
| 200 proof etanolo | VWR | V1001TP | |
| Sigmacote, reagente siliconato per vetro e altre superfici | Sigma-Aldrich | SL2 | Per il trattamento dei serbatoi dei bioreattori. Indicato nel testo come reagente siliconizzante. |
| Supporti DMEM/F12 Life | Technologies | 11320-033 | |
| Corning cellgro Siero fetale bovino Premium, Mediatech | Corning | 35-010-CV | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina, 100X 10.000 U.I. Penicillina 10.000 &; g/mL Streptomicina | Corning | 30-002-CI | |
| TrypLE Express (1X), Phenol Red | Life Technologies | 12605-028 | Indicato nel testo come enzima dissociatore cellulare. |
| Trypan Blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Resazurin sale sodico | Sigma-Aldrich | R7017 | |
| Attrezzatura: | |||
| Masterflex L/S Digital Drive, 600 giri/min, 115/230 VAC | Cole-Parmer | EW-07522-20 | |
| Masterflex L/S cartucce grandi per teste pompa 07519-05 e -06. | Cole-Parmer | EW-07519-70 | Indicato nel testo come cartuccia a pompa grande. |
| Testa della pompa a cartuccia Masterflex L/S a 8 canali, 4 rulli. | Cole-Parmer | EW-07519-06 | |
| Pinza per campioni dritta da 6", seghettata | VWR | 82027-438 | |
| *Bioreattore di perfusione renale | WilMad Labglass | *Disegni personalizzati | I bioreattori sono prodotti come descritto da WilMad Labglass. I disegni sono stati descritti in modo approfondito in una precedente pubblicazione. |
| per circuiti di perfusione | |||
| 24 G x 0,75 pollici Catetere IV schermato BD Insyte Autoguard (0,7 mm x 19 mm) realizzato in biomateriale BD Vialon. Ha l'ago dentellato. (50/sp, 200/ca) | BD Biosciences | 381412 | indicato nel testo come catetere calibro 24. |
| Tubo Masterflex PharMed BPT, L/S #14, 25' | Cole-Parmer | HV-06508-14 | Indicato nel testo come tubo per pompa peristaltica. |
| Tubo in silicone polimerizzato con perossido, 1/16" ID x 1/8" OD, 25 piedi/confezione | Cole-Parmer | HV-06411-62 | Indicato nel testo come tubo in gomma siliconica ID 1/16". |
| Tubo in silicone Masterflex platinico, L/S 14, 25 ft. | Cole-Parmer | HV-96410-14 | Indicato nel testo come tubo in gomma siliconica ID da 1/16" a pareti spesse. |
| Tubi in silicone VWR, 1/4" ID x 0,5" OD | VWR | 89068-484 | |
| Filtri di sfiato Acro 50, Pall Life Sciences | VWR | 28143-558 | Indicato nel testo come filtro di sfiato da 0,2 micron. |
| Adattatori Luer Cole-Parmer, Luer Lock maschio a 1/8" ID, Nylon, 25/pz | Cole-Parmer | T-45505-11 | Indicato nel testo come Luer lock maschio a 1/8" adattatore spinato. |
| Cole-Parmer Luer Accessorio, Maschio Luer Plug, Nylon, 25/pz | Cole-Parmer | EW-45505-58 | |
| Adattatore luer femmina x luer femmina, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-22 | Indicato nel testo come adattatore Luer femmina x Luer femmina. |
| Cole-Parmer Luer Accessorio, Femmina Luer Cap, Nylon, 25/pz | Cole-Parmer | EW-45502-28 | |
| Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Stopcocks # MX4311L - Rubinetto Hi-Flo a 3 vie con Luer Lock maschio esteso, formulazione non DEHP, senza lattice (LF), resistente ai lipidi, non PVD, 50/cs | Careforde Healthcare | 10254821 | Smiths Medical (venditore) il numero di catalogo è #MX4311L. |
| Siringa | |||
| monouso BD Luer-Lok da 5 ml con punta BD Luer-Lok™. | BD Biosciences | 309646 | |
| Piatto di coltura Easy Grip da 35 mm x 10 mm | BD Biosciences | 353001 | utilizzato per aspirare la sospensione cellulare in una siringa per la semina cellulare. |
Riferimenti
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current opinion in nephrology and hypertension. 23, 399-405 (2014).
- Soto-Gutierrez, A., Wertheim, J. A., Ott, H. C., Gilbert, T. W.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 3/03/2017. Citeable Link.
An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.
The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line. Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).
