Stabile ed efficiente Modificazione genetica di cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi di cellule staminali neurali autonoma ed effetti non autonomi

Sommario

Qui descriviamo una procedura basata sull'uso di particelle lentivirali per la modificazione genetica a lungo termine delle cellule staminali neurali e/o delle loro cellule ependimali adiacenti nella nicchia neurogenica ventricolare-subventricolare adulta che consente l'analisi separata degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali.

Abstract

Relativamente cellule staminali somatiche quiescenti sostenere il rinnovamento cellulare per tutta la vita nella maggior parte dei tessuti adulti. Le cellule staminali neurali nel cervello dei mammiferi adulti sono limitate a due specifiche nicchie neurogena: la zona subgranulare del giro dentato dell'ippocampo e la zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ, chiamato anche zona subependimale o SEZ) nelle pareti del laterali ventricoli. Lo sviluppo di strategie in vivo di trasferimento genico per le popolazioni di cellule staminali adulte (cioè quelli del cervello dei mammiferi) con conseguente espressione a lungo termine di transgeni desiderati nelle cellule staminali e la loro progenie derivata è uno strumento cruciale nella corrente ricerca biomedica e biotecnologica. Qui, un metodo diretto in vivo è presentato per la modificazione genetica stabile di cellule di topo adulto V-SVZ che sfrutta la cella infezioni ciclo-indipendente LV e la citoarchitettura altamente specializzato della nicchia V-SVZ. In particolare, l'attuale protocollo comportas l'iniezione di LV vuoti (controllo) o LV codificanti cassette specifica espressione del transgene nelle memorie V-SVZ sé, per in vivo di targeting di tutti i tipi di cellule nella nicchia, o nel lume ventricolo laterale, per l'orientamento dei ependimali solo le cellule. cassette di espressione vengono poi integrati nel genoma delle cellule trasdotte e proteine ​​fluorescenti, codificate anche dal LV, permettere la rivelazione delle cellule trasdotte per l'analisi di cellule, effetti autonomi e non autonomi nicchia-dipendente sulle cellule marcate e loro progenie.

Introduzione

La zona ventricolare-subventricular murino (V-SVZ), nelle pareti del ventricolo laterale rivolta verso lo striato, è una regione germinale molto attivo in cui un processo continuo di replicazione delle cellule progenitrici e differenziazione risultati nella produzione persistente bulbo olfattivo (OB ) interneuroni e oligodendrociti corpo calloso ^1. La generazione per tutta la vita di queste cellule sembra essere sostenuta dalla presenza in questa regione di cellule neurali staminali (NSC; anche chiamate cellule B1), che esprimono l'antigene astrociti proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) e gambo marcatori di cellule, come nestina, Id1 e Sox2 ^2....

Protocollo

ETICA DICHIARAZIONE: Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Valencia in conformità con la direttiva europea 2010/63 / UE.

1. Generazione di LV per In Vivo marcatura studi (si veda la Figura 1a)

ATTENZIONE: La procedura qui descritta è livello di biosicurezza 2, eseguire quindi tutte le seguenti procedure in una cappa di rischio biologico. Assicurare che il personale di ricerca sono adeguatamente qualificato e preparato in tutte le procedure. Indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui abito, guanti doppie e protezione per gli occhi adatto. Infine, a fondo deconta....

Risultati

Sistema di erogazione gene LV-mediata può essere utilizzato per il lungo termine in vivo trasduzione di cellule nel topo adulto V-SVZ, permettendo loro di inseguimento e modificazione genetica durante la proliferazione, la migrazione e la differenziazione. L'infezione e l'espressione sono altamente efficaci e producono numerose cellule che possono essere facilmente distinta tra le altre cellule non infette con l'espressione del reporter incluso. Abbiamo finora visualizzato cellule trasdotte con i gi.......

Discussione

LV offrono importanti vantaggi rispetto ad altri sistemi virali per la modificazione genetica degli adulti NSC ^16,18. consegna stereotassica del lentivirus alla nicchia V-SVZ rappresenta un metodo efficace per etichettare e tracciare rado dividendo B1-NSC superare i limiti di altri metodi di uso comune come BrdU, che è diluito dopo molteplici divisioni cellulari, o retrovirus, che prendono di mira solo le cellule che proliferano al momento dell'applicazione. LV, insieme con adenovirus, può infettare le ce.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Parte 1: Generazione di LV per la consegna in vivo.
Attrezzature:
Ultracentrifuga	Beckman Coulter	Optima XL-100K
Rotore per ultracentrifuga	Beckman Coulter	SW-28
Ultracentrifuga rotore	Beckman Coulter	SW-55
Provette per ultracentrifuga	Beckman Coulter	358126	da 25 mm x 89 mm
	Beckman Coulter	326819	13 mm x 51 mm
	Beckman Coulter	358156
piastra a 6 pozzetti	SPL	PLC-30006
piastra a 24 pozzetti	SPL	PLC-30024
piastra da 10 cm	SPL	PLC-20101	100 x 20
	Afora	DE400800	12 mm x 75 mm, 5 ml
Filtro FACS sterile a tazza	BD	340626	30 & m
Filtro nitrocellulosico	Millipore	SCGPU05RE	0,22 μ m
Citometro a flusso	BD	LSR Fortessa	Laser blu 488 nm
Filtro Steritop	Biofil	FPE-204-500	0,22 µ
mReagenti:
plasmide pMDLg/pRRE	Addgene	#12251
Plasmide pRSV.REV per l'imballaggio del nucleo	Addgene	#12253	Plasmide
pMD2G plasmide	Addgene	#12259	Plasmide a busta
pRRL-SIN-PPT.PGK.EGFP.Wpre plasmide	Addgene	#12252	Trasferisci il plasmide
vettoriale Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Biowest	L0101-500	Per la coltura cellulare HeLa
Il terreno di Dulbecco modificato di Iscove	Life technologies	12440-053	Per colture cellulari 293T
Tris-EDTA (TE)			Tris-HCl (sigma, T5941), 0,1 mM EDTA (sigma, E5134), pH 7,6,  Senza DNAsi/RNAsi, 0,2 µ m filtrato sterile
2x HBS			0,28 M NaCl (Sigma, S7653), 0,05 M HEPES (Sigma, H7523), 1,5 mM anidro Na2HPO4 (Sigma, S7907) in dH2O (preferibilmente non MilliQ). Regolare il pH a 7,0 con la soluzione di NaOH (Calbiochem, 567530).
Siero fetale bovino (FBS)	Biowest	S181B-500	Soluzione madre a 100x, utilizzato per preparare il terreno di coltura HeLa e 293T a una concentrazione finale di 10x.
Glutammina	Sigma-Aldrich	G7513-100	Soluzione madre a 200 mM, utilizzata per preparare il terreno di coltura HeLa e 293T a una concentrazione finale di 6 mM.
Piruvato di sodio	Life technologies	11360-039	Soluzione madre a 100 mM, utilizzata per preparare il terreno di coltura HeLa e 293T a una concentrazione finale di 1 mM.
GlutaMAX Supplement	Life technologies	35050-061	Utilizzato per preparare il terreno di coltura 293T a una concentrazione finale dell'1%.
Penicillina/streptomicina	Sigma-Aldrich	P4458	La soluzione madre contiene 5.000 unità/ml di penicillina e 5 mg/ml di streptomicina. Utilizzato per preparare terreni di coltura HeLa e 293T a una concentrazione finale dell'1%.
Trypsin-EDTA	Life Technologies	25200-056	Con rosso fenolo, contiene 2,5 g di tripsina suina e 0,2 g di EDTA 4Na/L HBSS.
Soluzione salina tamponata con fosfato  (PBS)	Sigma-Aldrich	D1408	Senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio, 10x, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari. Soluzione madre utilizzata per preparare 1x PBS in acqua per colture cellulari.
Polibrene (bromuro di esadimetrina)	Sigma-Aldrich	H9268	Polvere. Preparare una soluzione madre 1.000x a 8 mg/ml in dHO
Paraformaldeide grado EM 16%	EM Sciences	15710
Name	Company	Numero di catalogo	Comments
Parte 2: Iniezione steratassica di LV nella ZES vera e propria o nel ventricolo laterale.
Attrezzatura:
Vernier strumento stereotassico	NeuroLab, Leica	39463001	http://www.leicabiosystems.com/
Cunningham mouse e adattatore per ratto neonatale	NeuroLab, Leica	39462950
Portasiringa	KD Scientific	KDS-311-CE
Siringa calibro 33	Hamilton	P/N      84851/00	#85RN
Trapano elettrico	Fine Science Tool	98096
Coperta termica	Ufesa	AL5512/01	230-240 V, 100-110 W, tipo C_AL01
Rasoio	Jata	MP373N	Modello: bellezza, 3 V, 300 mA, tipo HT-03.
Reagenti:
Medetomidine	Esteve	DOMTOR	Soluzione commerciale a 1 mg/ml.
Ketamina	Merial	Imalgene 500	Soluzione commerciale a 50 mg/ml
		di medetomidina/ketamina	Preparare una miscela di lavoro di medetomidina a una concentrazione finale di 0,2 mg/ml di diluizione e ketamina a una concentrazione finale di 15 mg/ml in soluzione salina. Utilizzare come anestesia, iniettando un volume per ottenere una concentrazione finale di 0,5-1 mg di medetomidina per kg di peso corporeo e 50-75 mg di ketamina per kg di peso corporeo
Butorphanol	Pfizer	, soluzione madre torbugesica	a 10 mg/ml. Usato come analgesia a 1 mg/ml in soluzione salina.
Atipamezolo	Esteve	Antisedan	soluzione madre a 5 mg/ml, utilizzato in una concentrazione finale di 0,5 mg/ml in soluzione salina per uscire dall'anestesia.
Soluzione salina allo 0,9%	Braun	13465412
Histoacryl	Braun	1050052	Adesivo topico per la pelle
HydroGel	Clear H2O	70-01-5022
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120	11 cm x 21 cm
Candeggina/Virkon	Dupont
Pennarello chirurgico	Staedler	313-9	permanente lumocolor
		SICCAFLUID	0,5 g/dosis, carbomer 974P
Povidone-iodio	Betadine	694109.6	10% povidone-iodio
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Parte 3: Analisi istologica.
Attrezzature:
Pompa peristaltica automatica	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07524-55	Masterflex L/S variatore di velocità, 1,6-100 giri/min, 230 V
Testa pompa	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-07518-00	Testa pompa Masterflex L/S Easy-Load per tubi di precisione; Alloggiamento in PSF, rotore CRS
Tubo in silicone	Cole-Parmer Inst. Co.	HV-96410-16	Platinum L/S 16
Set di vene del cuoio capelluto	Vygon V-green	70246.05T	25 G, lunghezza del tubo 30 cm
Vibratomo	Leica	VT1000
Microscopio confocale	Olympus	FluoView FV10i
Piastra riscaldante	Tehtnica	SHP-10
Reagenti:
Tampone fosfato (PB)			0,2 M PB: 0,2 M Na2HPO4 (Sigma, S7907) e 0,2 M NaH2PO4 (Panreac, 141965.1211) in dH2O, regolare il pH a 7,2-7,4
Paraformaldeide (PFA)	Panreac	141451.1211	Preparare fresco ogni volta. Calore dH2O fino a 55– 60 ° C utilizzando una piastra riscaldante posta in una cappa aspirante e versare la polvere di PFA mescolando per ottenere una soluzione all'8%. La soluzione è di colore bianco torbido poiché il PFA non si dissolve facilmente. Aggiungere 1N NaOH goccia a goccia fino a quando la soluzione non si chiarisce. Raffreddare, filtrare la carta Whatman e aggiungere un volume equivalente di 0,2 M PB.
Soluzione			0,9% NaCl in dH2O
Supercolla	LOCTITE	767547
Sodio azide	Panreac	122712.1608
Glicina	Sigma-Aldrich	G7126-100
Siero di capra normale	Millipore	S30-100
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	Detergente
Anticorpo anti-GFP di coniglio	ROCKLAND	600-401-215	Utilizzare a una diluizione 1:500
Alexa Fluor 488 Asino Anticorpo IgG (H+L) di coniglio	Sonde molecolari	A-21206	Utilizzare a una diluizione 1:750
6-Diamindino-2-fenilindolo dicloridrato idrato (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542	Colorazione nucleare fluorescente. Utilizzare a 2 mg/ml in ddH2O. Conservare al buio a 4 °C.
Fluoromount-G	EM Sciences	17984-25	Mezzo di montaggio per preparazioni fluorescenti

provette per ultracentrifuga adattatori per ultracentrifuga provette FACS Miscela , Lubrificante oftalmico salina