L'immunità adattativa è controllata da 'sinapsi immunologiche' dinamiche formate tra le cellule T e le cellule presentanti l'antigene. Questo protocollo descrive i metodi per studiare le cellule endoteliali sia come APC fisiologiche poco studiate sia come un nuovo tipo di "modello di APC cellulare planare".
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Articolo metodologico
Un modello cellule endoteliali Planar for Imaging immunologiche Synapse Dynamics
In questo articolo
Sommario
Abstract
Immunità adattativa è regolata da interazioni dinamiche tra cellule T e cellule presentanti l'antigene ('APC') denominati «sinapsi immunologica. All'interno di queste interfacce cellula-cellula intime discrete sub-cellulari cluster di MHC / Ag-TCR, F-actina, adesione e molecole di segnalazione si formano e rimodellano rapidamente. Queste dinamiche si pensa siano fattori determinanti sia per l'efficienza e la qualità delle risposte immunitarie che sviluppano e quindi di protezione contro l'immunità patologica. Attuale comprensione delle sinapsi immunologiche con fisiologica APC è limitata dalla inadeguatezza della risoluzione delle immagini ottenibili. Anche se i modelli substrato artificiale (ad esempio, doppi strati lipidici planari) offrono un'eccellente risoluzione e sono stati strumenti estremamente utili, essi sono intrinsecamente non-fisiologica e semplicistica. Cellule endoteliali vascolari e linfatiche sono emersi come un importante tessuto periferico (o stromale) Vano di 'semi-professionaleAl APC '. Questi APC (che esprimono la maggior parte del macchinario molecolare di professionisti APC) hanno la caratteristica unica di formare superficie cellulare praticamente piana e sono immediatamente transfectable (ad esempio, con i giornalisti proteina fluorescente). Qui un approccio di base per l'attuazione cellule endoteliali come un romanzo e fisiologica 'planare modello APC cellulare' per migliorare l'imaging e l'interrogazione dei processi di segnalazione antigeniche fondamentali sarà descritto.
Introduzione
Linfociti T sono un ramo del sistema immunitario adattativo caratterizzato dalla capacità di riconoscere efficientemente antigene peptide (Ag) vincolato al complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) molecole attraverso i recettori delle cellule T (TCR) 1. Linfociti naïve costitutivamente migrano e Scan 'Ag cellule presentanti professionali »(APC, ad esempio, cellule dendritiche) all'interno dei linfonodi, mentre le cellule di memoria / T effettrici devono sorvegliare efficacemente una gamma estremamente ampia di APC e potenziali cellule bersaglio all'interno dei tessuti periferici.
Nel min seguente iscri....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono condotte con cellule T umane primarie e disponibili in commercio cellule endoteliali umane primarie (per via cutanea o microvascolare polmone EC) .Any protocollo di ricerca che coinvolge soggetti umani deve essere approvato da un comitato istituzionale di revisione e consenso informato scritto deve essere fornita da ogni donatore di sangue. Esperimenti condotti utilizzando questo protocollo è stato approvato dal IRB di Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Preparazione cellule CD4 + Th1 umana Effector / T di memoria
- Applicare laccio emostatico al braccio del donatore, pulire ve....
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Risultati
Un nuovo approccio di imaging utilizzando cellule endoteliali e combinando i vantaggi risoluzione della planare bistrati lipidici modello con la complessità fisiologica e deformabilità professionale APC stato sviluppato (Figura 1). La Figura 2 fornisce esempi di migrazione tipica, flusso di calcio e dinamiche topologici osservato con questo approccio. In assenza di SAG in endotelio, SAG-specifici linfociti CD4 + Th1 rapidament.......
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Discussione
Nel complesso, questo protocollo descrive i metodi per indagare le cellule endoteliali come i) understudied APC fisiologici e ii) come un nuovo tipo di 'planare cellulare modello APC'. Per quanto riguarda il primo, è diventato sempre più apprezzato che APC non ematopoietiche periferiche (o 'stromali') svolgono, un ruolo non ridondanti critici (ad esempio, rispetto a ematopoietiche APC) nel modellare le risposte immunitarie adattive 16-18. Tra tali 'semi-professionale' APC, vas.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Peter T. Sage per la sua assistenza nella generazione di alcune delle immagini rappresentative. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH R01 al C.V.C. (HL104006).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BD Vacutainer stretch latex free tourniquet BD | Biosciences | 367203 | |
| tamponi imbevuti di alcol BD | Biosciences | 326895 | |
| BD Vacutainer Safety-Lok | BD Biosciences | 367861 | K2 EDTA |
| BD Vacutainer Set per la raccolta del sangue a pulsante | BD Biosciences | 367335 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R8758-1L | |
| Ficoll-Paque | Sigma-Aldrich | GE17-1440-02 | Portare a RT prima dell'uso |
| FCS-Optima | Atlanta Biologics | s12450 | |
| Penicillina-Streptomicina | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | |
| stafilococco enterotossina B | Tossina Tecnologia | BT202RED | Soluzione madre 1 mg/ml nella |
| tossina 1 | della tossina della sindrome | PBS TT606RED | Soluzione madre 1 mg/ml in |
| PBS IL-15 R | & D Systems | 247-IL-025 | Soluzione madre 50ug/ml in PBS |
| PBS | Life Technologies | 10010-049 | |
| Fibronectina | Life Technologies | 33016-015 | Soluzione madre 1mg/ml in H20 |
| HMVEC-d Ad-Dermal MV Endo Cells | Lonza | CC-2543 | Possono essere utilizzate altre EC microvascolari umane, ad esempio HLMVECs |
| EGM-2 MV bullet kit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T-4174 | Soluzione madre 10x, diluito in PBS |
| amaxa-HMVEC-L Kit nucleofector | Lonza | vpb1003 | Kit richiesto per la fase 4 |
| IFN-g | Sigma-Aldrich | I3265 | Soluzione madre 1mg/ml in H20 |
| TNF-alfa 10ug, Human | Life Technologies | PHC3015 | Soluzione madre 1mg/ml in fenolo H20 |
| HBSS senza rosso | Life Technologies | 14175-103 | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP299-100 | |
| Cloruro di calcio | Sigma-Aldrich | C1016-100G | Soluzione madre 1M in H20 |
| Cloruro di magnesio | Sigma-Aldrich | 208337 | Soluzione madre 1M in H20 |
| Siero umano albumina | Sigma-Aldrich | A6909-10ml | |
| Immersol 518 F olio da immersione senza fluorescenza | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Fura-2 AM 20x50ug | Life Technologies | F1221 | Soluzione madre 1mM in DMSO |
| pEYFP-Mem (Mem-YFP) | Clontech | 6917-1 | |
| pDsRed-Monomero (DsRed citoplasmatico solubile) | Clontech | 632466 | |
| pDsRed-Monomer Membrane (Mem-DsRed) | Clontech | 632512 | |
| pEGFP-Actin | Clontech | 6116-1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Soluzione di formaldeide 37% | Fisher Scientific | BP531-500 | Tossico, utilizzare la cappa di aspirazione |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-5ML | |
| Provette da centrifuga coniche Falcon 15mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| Provette da centrifuga coniche Falcon 50mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fiasche trattate con coltura tissutale Falcon T25 | Fisher Scientific | 10-126-9 | |
| Fiasche trattate con coltura tissutale Falcon T75 | Fisher Scientific | 13-680-65 | |
| Coltura cellulare Corning trattata T175 | Fisher Scientific | 10-126-61 | |
| Vetrini coprioggetti | Fisher Scientific | 12-545-85 | Diametro 12 mm |
| Piastre per colture tissutali Falcon a 24 pozzetti | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Piastre Delta-T | Bioptechs | 04200415B | |
| Pipette Pasteur monouso Wheaton | Fisher Scientific | 13-678-8D | |
| 1,5 ml provetta Eppendorf | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| ICAM1 topo anti-umano | BD Biosciences | 555509 | |
| HS1 topo anti-umano | BD Biosciences | 610541 | |
| Anti-umano CD11a (LFA-1alfa) Purificato | ebioscience | BMS102 | |
| Anti-umano CD3 Alexa Fluor® 488 | ebioscience | 53-0037-41 | |
| Anticorpo anti-MHC di classe II | Abcam | ab55152 | |
| Anticorpo anti-Talin 1 | Abcam | ab71333 | |
| Anticorpo anti-PKC theta | Abcam | ab109481 | |
| fosfotirosina (4G10 platino) | Millipore | 50-171-463 | |
| Nucleofector II | Amaxa Biosystems | Elettroporatore richiesto per la fase 4 | |
| Zeiss Axiovert | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss LSM510 | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| Zeiss Software Axiovison | Carl Zeiss MicroImaging | ||
| NU-425 (Serie 60) Cabina di sicurezza biologica | NuAIRE | Nu-425-600 | |
| Forma STRCYCLE 37 ° C, Incubatore per colture cellulari al 5% di CO2 | Fisher Scientific | 202370 | |
| Centrifuga 5810 | Eppendorf | EW-02570-02 | |
| Emocitometro | Sigma-Aldrich | Z359629 | Emocitometro Bright-Line |
| Isotemp Bagnomaria modello 202 | Fisher Scientific | 15-462-2 |
Riferimenti
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-cell function and migration. Two sides of the same coin. N. Engl. J. Med. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Springer, T. A. Adhesion receptors of the immune system. Nature. 346 (6283), 425-434 (1990).
- Shaw, A. S., Dustin, M. L.
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Ristampe e permessi
