A Novel Modello murino di fistola artero-venosa Fallimento: la procedura chirurgica in dettaglio

Sommario

Qui presentiamo un modello murino di insufficienza della fistola arterovenosa (AVF) in cui è incorporata una configurazione anastomotica clinicamente rilevante. Questo modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e per testare possibili interventi terapeutici.

Abstract

La fistola arterovenosa (FAV) soffre ancora di un alto numero di fallimenti causati da un rimodellamento insufficiente e da iperplasia intimale di cui l'esatta fisiopatologia rimane sconosciuta. Al fine di svelare la fisiopatologia è stato sviluppato un modello murino di insufficienza AVF in cui la configurazione dell'anastomosi assomiglia alla situazione preferita in ambito clinico. È stato descritto un modello in cui viene creata una FAV collegando l'estremità venosa del ramo della vena giugulare esterna al lato dell'arteria carotide comune utilizzando suture interrotte. A livello istologico, abbiamo osservato lesioni intimali stenotiche progressive nel tratto di efflusso venoso che si osservano anche nelle FAV umane fallite. Sebbene questa procedura possa essere tecnicamente impegnativa a causa delle piccole dimensioni dell'animale, siamo stati in grado di raggiungere un tasso di successo chirurgico del 97% dopo una formazione sufficiente. Il vantaggio principale di un modello murino è la disponibilità di animali transgenici. Alla luce dei diversi meccanismi proposti che sono responsabili del fallimento della FAV, la disabilitazione dei geni che potrebbero svolgere un ruolo nel rimodellamento vascolare può aiutarci a svelare la complessa fisiopatologia del fallimento della FAV.

Introduzione

Un condotto accesso vascolare funzionale è di vitale importanza per i pazienti con insufficienza renale che dipendono in emodialisi cronica per rimanere in vita. La costruzione di una fistola artero-venosa (AVF) è attualmente la scelta preferita per l'accesso vascolare. Tuttavia, le complicanze legate AVF costituiscono una delle principali cause di morbilità per i pazienti in emodialisi cronica. Nonostante i grandi sforzi scientifici, nessuno dei nuovi approcci per ridurre le complicazioni di accesso legate AVF ha comportato sostanziale miglioramento della AVF durata. Una parte di questo progresso deludente riferisce alla comprensione incompleta della fisiopatologia sottostante del fallimento accesso emodialisi.

Per svelare la fisiopatologia del fallimento accesso AV, i modelli animali che imitano da vicino patologia umana sono della massima importanza. A questo riguardo, non solo le specie animali, ma anche il sito anastomotico, la necessaria terapia anti-coagulatoria e la durata del follow-up dopo l'impulsory dovrebbe essere presa in considerazione ^1. Mentre grandi animali sono i più adatti per studi di intervento finalizzati a sviluppare nuove strategie terapeutiche, modelli murini hanno il maggiore potenziale per ottenere un quadro più chiaro nei meccanismi molecolari alla base mancato accesso AV a causa della disponibilità di topi transgenici. Inoltre, un gran numero di topi può essere utilizzato per questo scopo a costi inferiori rispetto al grande uso animale.

Il primo modello murino di guasto AVF è stata descritta nel 2004 da Kwei e et al. ² In questo modello, FAV sono stati costruiti utilizzando l'arteria carotide e la vena giugulare in modo end-to-end utilizzando un catetere intravascolare. Questo modello potrebbe essere utile per studiare l'adattamento venosa presto FAV sebbene la configurazione end-to-end e la presenza di un catetere intravascolare limitano la validità di questo modello per FAV umani. Un modello AVF migliorato è stato introdotto da Castier e et al. ³ in cui l'estremità dil'arteria carotidea è collegato al lato della vena giugulare. Tuttavia, FAV in pazienti in emodialisi sono solitamente costruiti anatomizza la fine di una vena al lato di un'arteria. La configurazione esatta del AVF è una caratteristica fondamentale di un modello di accesso AV poiché determina il profilo emodinamico nel condotto ^4. Quest'ultimo è un importante contributo alla disfunzione endoteliale e successivo sviluppo di iperplasia intimale (IH) ^5.

Un modello murino romanzo è stato recentemente sviluppato con una configurazione anatomica identica come è utilizzato nell'uomo ^6. In questo modello, AVF vengono creati nella C57BL / 6 topi anastomosing la fine di un ramo della vena giugulare esterna al lato della carotide comune con punti staccati. In questo lavoro, grazie alla procedura microchirurgica di questo modello, al fine di facilitare l'uso diffuso di questo modello murino, mirata a dipanare il complesso fisiopatologiadi errore di accesso emodialisi.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sono stati approvati dalla commissione per il benessere degli animali del Leiden University Medical Center.

1. Preparazione degli animali e Anestesia

1. Anestetizzare il mouse (1-3 mesi) in un continuo camera di induzione anestetica pieno di 3-4% isoflurano.
2. Shave lato ventrale del collo e la parte interna della coscia sinistra utilizzando un rasoio elettrico e utilizzare un pezzo di nastro per rimuovere i peli.
3. Applicare una pomata oculare su entrambi gli occhi.
4. Posizionare l'animale sulla coperta di riscaldamento sul quale è fissata la maschera di ventilazione naso. Fissare la testa alla maschera del naso con del nastro adesivo.
   1. Invia isoflurano ad una concentrazione di 1,5-2,0% utilizzando arricchita di ossigeno set aria alla seguente flusso d'aria 0,3 L / min, 100% di ossigeno 0,2 L / min. Pizzicare la pelle tra le dita per valutare la profondità dell'anestesia e regolare la concentrazione di isoflurano se necessario.
5. Fissare l'animale altermocoperta con nastro adesivo su tutti gli arti che è impostato a circa 37 ° C in posizione supina.
6. Iniettare buprenorfina disciolto in cloruro di sodio (NaCl) 0,9% alla dose di 0,1 mg / kg insieme con 0,5 ml di soluzione sterile di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea nel fianco dell'animale.
7. Applicare clorexidina tintura 0,5% per la zona preparata.

Incisione 2. Pelle

1. Posizionare l'animale sotto il microscopio con la testa verso il chirurgo.
2. Effettuare una incisione longitudinale di circa 1,5 cm la linea mediana del collo ventrale utilizzando un micro forbice.
3. Afferra le ghiandole salivari con una pinza e spostare il diritto ghiandola salivare cranialmente fino a quando è in parte al di fuori della ferita.

3. dissezione e preparazione del Vein

1. Identificare e senza mezzi termini sezionare il ramo dorsomediale del diritto vena giugulare esterna completamente dal suo tessuto perivascolare diffondendo solo unlongside e nella direzione del vaso sanguigno.
2. Posizionare un ciclo (10.0 di sutura) intorno alla vena sezionato e applicare un nodo senza bloccarlo.

4. Rimozione del muscolo sternocleidomastoideo

1. Utilizzando pinze, senza mezzi termini sezionare il muscolo sternocleidomastoideo destro dal suo ambiente, diffondendo lungo il confine. Mettere un paio di pinze aperte sotto il muscolo isolata e legare lo prossimale e distale con una sutura 6.0. Successivamente, accise il muscolo utilizzando un cauterizer.

5. dissezione e preparazione del carotide comune

1. Identificare e sezionare il diritto arteria carotide comune con pinze. Inserire un filo 6.0 sutura intorno all'arteria per aiutare nella manipolazione dell'arteria.
2. Applicare pinze vascolari come distalmente e prossimalmente possibile.
3. Effettuare una incisione longitudinale nel mezzo dell'arteria di 1 mm circa utilizzando micro forbice specializzata.
4. Sciacquare ilarteria con una soluzione di eparina [100 UI / ml] finché l'imbarcazione non chiara di sangue.
5. Misurare e regolare la lunghezza dell'incisione se necessario in base alla larghezza del morsetto vascolare [1.1 mm].

6. legatura della vena

1. Applicare una pinza vascolare prossimale della vena già preparato e mettere un filo di sutura intorno alla vena.
2. Applicare leggera trazione caudale alla vena con un emostatico che viene immesso sul filo di sutura e legare la vena come distalmente possibile utilizzando il 10.0 di sutura che è stato posto in precedenza.
3. Tagliare la vena con una forbice appena prossimale alla legatura.
4. Utilizzando pinze vascolari, aprire delicatamente il lume della vena e sciacquare con una soluzione di eparina [100 UI / ml].

7. Creazione di anastomosi Parte 1

1. Collegare la vena per l'arteria con una sutura interrotta (10,0) con 2 nodi quadrati in posizione ore dodici seguita da una sutura a sei o 'posizione di orologio. Assicurarsi di collegare la vena all'arteria senza farlo ruotare attorno al proprio asse. Ruotare l'animale al fine di migliorare l'esposizione chirurgica.
2. Posizionare un filo di sutura intorno alla vena e applicare la trazione laterale dolce con un emostatico.
3. Utilizzando gli stessi punti staccati, completare l'anastomosi mettendo circa 3-4 suture supplementari su lato ventrale visibile della anastomosi.

8. somministrazione di eparina

1. Ruotare riscaldamento coperta di 180 ° e mettere a fuoco il microscopio sulla gamba in alto a sinistra.
2. Identificare il femorale fascio vena / arteria / nervo con la ricerca di una struttura vascolare che corre longitudinalmente nella parte mediale della coscia e può essere visto attraverso la pelle. Fare un'incisione con il micro forbice di circa 1 cm direttamente sopra la vena femorale in modo longitudinale.
3. sezionare con cura il tessuto perivascolare di vena femorale e iniettare eparina a dosi of 0.2 UI / g di peso corporeo nella vena femorale.

9. Creazione di anastomosi Parte 2

1. Ritorna alla zona del collo e rimuovere il filo di sutura che è stato messo intorno alla vena.
2. Collocare un filo di sutura (6.0) che passa successivamente sotto l'arteria carotide, sopra la vena e ancora sotto l'arteria carotidea. (Figura 1L)
3. Rimuovere la fascetta vascolare venosa.
4. Successivamente, ruotare il mezzo completato fistola artero 180 ° lungo l'asse della carotide in senso orario ruotando contemporaneamente entrambe le pinze vascolari e applicare la trazione mediale alle estremità del filo di sutura.
5. Completa l'anastomosi nello stesso modo come descritto nel passaggio 7.2.

Rimozione 10. vascolare morsetto

1. Rimuovere il filo di sutura e ruotare il vascolare morsetti di 180 ° in senso antiorario.
2. Rimuovere il morsetto vascolare distale seguita dalla pinza vascolare prossimale.
3. Valutare la pervietà delle anastomosi occludendo delicatamente il tratto di efflusso venoso con le pinze vascolari. In caso di anastomosi di brevetto, la sezione venosa pre-occlusivo si espanderà in modo pulsatile. Riposizionare il diritto ghiandola salivare alla sua posizione usando anatomiche pinze originali.

11. Pelle Chiusura e postoperatoria cura

1. Chiudere la pelle della gamba superiore con una sutura ininterrotta (6.0).
2. Chiudere la pelle del collo con una sutura ininterrotta (6.0).
3. Rimuovere l'animale dalla coperta di riscaldamento e iniettare 0,5 ml di NaCl allo 0,9% per via sottocutanea.
4. Posto l'animale in una gabbia buia che viene riscaldata con una lampada di riscaldamento e lasciate riprendersi completamente. Quando un animale non riprendersi completamente, assicurarsi che non soffre di uno shock emodinamico a causa di sanguinamento nella zona chirurgica. Cercare segni come un collo gonfio e la fuoriuscita di sangue.
5. Dopo circa 6 ore dopo la prima iniezione di buprenorphine, iniettare una dose singola di una formulazione a rilascio prolungato di buprenorfina per via sottocutanea in una dose che è raccomandato dal costruttore, al fine di fornire un'adeguata analgesia per un ulteriore 72 hr.

12. Tessuto raccolta

1. Anestetizzare l'animale con un anestetico miscela contenente midazolam (5 mg / kg), medetomidina (0,5 mg / kg) e fentanyl (0,05 mg / kg) somministrato per via intraperitoneale.
2. Fissare l'animale in posizione supina con l'inserimento di aghi attraverso le zampe e le guance in una stuoia di silicio non riscaldata.
3. Fare un'incisione di circa 1,5-2,0 centimetri sopra la cicatrice al collo con il micro forbice.
4. Sezionare il AVF, e inserire fili di sutura (6,0) in tutto il proximal-, arteria distale e del tratto di efflusso venoso per una facile identificazione.
5. Valutare la pervietà del AVF come descritto nel paragrafo 10.3 del protocollo.
6. Aprire la cavità peritoneale eseguendo una laparotomia mediale ucantare la micro forbice.
   1. Tagliare la gabbia toracica ventrale destra e sinistra con un paio di forbici a partire caudalmente nella linea medioclavicolare. Utilizzando un micro forbice, transetto il diaframma che è collegato alla parte centrale della gabbia toracica ventrale e successivamente spostare questa sezione craniale con pinze.
   2. Individuare la vena cava inferiore e transetto con un micro forbice.
7. Inserire un ago calibro 23 ago nel ventricolo sinistro e profumato con PBS ad una pressione di circa 100 mmHg finché il fluido intravasale praticamente limpida.
8. Senza rimuovere l'ago, ormai profumato con formalina 4% per 10 min ad una pressione di circa 100 mmHg.
9. Accise L'AVF da sezionare sia le arterie e le vene con il micro forbice e immergerlo in una soluzione di formalina O / N 4%.

13. Tessuto di rivestimento e di sezionamento

1. Elaborare il tessuto di paraffina secondo le protoco della produzionel. Il protocollo applicato si analizzano come segue:
   1. Immergere in etanolo 70% per 1 ora a RT. Ripetere 2x.
   2. Immergere in etanolo 96% per 1 ora a RT. Ripetere 2x.
   3. Immergere in etanolo 99,5% per 1 ora a RT. Ripetere una volta.
   4. Immergere in etanolo 99,5% per 1,5 ore a temperatura ambiente.
   5. Immergere in xilene 100% per 1 ora a RT. Ripetere una volta.
   6. Immergere in Parafin per 1 ora a 62 ° C. Ripetere 2x.
2. Incorpora l'AVF in paraffina in modo che il tratto di efflusso venoso è orientato perpendicolarmente alla cassetta incorporamento.
3. Utilizzando un microtomo, creare 12 sezioni seriali ognuno composto da 30 sezioni con spessore 5 micron. Poi di ogni sezione seriale, posizionare una sezione su un solo bicchiere di montaggio a partire dalla posizione uno fino a dodici in modo ordinato a partire dalla zona più vicina al anastomosi.

Risultati

Dopo la creazione della anastomosi (figura 1), la pervietà deve essere valutata a breve occludendo il tratto di efflusso venoso con una pinza vascolare. Quando l'anastomosi è brevetto, il prossimale tratto vascolare all'occlusione dovrebbe chiaramente espandere in modo pulsatile. Inoltre, la pervietà è confermata mediante fluoroscopia vicino infrarosso (NIRF) che funziona efficacemente come angiografia (Figura 2). Un errore nella procedura chirurgica può portare ad una occlusion...

Discussione

L'AVF è considerato come il tallone d'Achille 'nel trattamento di emodialisi. Purtroppo, l'AVF soffre ancora da un elevato numero di guasti ^8-10. Nonostante le ampie ricerche sui meccanismi sottostanti, la fisiopatologia esatta non è nota. Numerosi modelli murini per la mancata AVF sono già stati descritti in letteratura ^2,3,11,12. Tuttavia, nessuno di questi modelli incorporano una estremità venosa alla configurazione anastomosi lato arterioso che è più utilizzato nella situazione ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Microsocpe da dissezione	Leica	M80
Pinza	Medicon	07.61.25
Pinza vascolare	S& T	JFL-3D.2
Pinze vascolari	S& T	D-5a.2
Pinze	Roboz	SS/45
Micro forbice lama da 5 mm	Strumenti per la scienza fine	15000-08
Micro forbice Lama da 2 mm	Strumenti per la scienza fine	15000-03
Forbice	Medicon	05.12.21
Clip applier 1	S& T	CAF-4
Morsetto vascolare 1	S& T	B-1V
Clip applier 2	BBraun	FE572K
Morsetto vascolare 2	BBraun	FE740K
Pinza emostatica	BBraun	BH110
10.0 suture	BBraun	G1117041
Cauterizzatore	Strumenti per la scienza	18010-00
Porta aghi	Medicon	11.82.18
Unguento oculare	Pharmachemie	41821101
Tintura di clorexidina 0,5%	Leiden University Medical Center	NA
Eparina	Leo Pharma	012866-08
Buprenorfina	RB Pharmaceuticals
Isoflurano	Pharmachemie	45,112,110
Maschera per anestesia	Università di Maastricht	misura
Midazolam	Actavis	AAAC6877
Dexmedetomidina	Orion	141-267
Fentanyl	Bipharma	15923002
Camera di induzione anestetica continua	Soluzioni Vet-tech	AN010R

6.0 suture BBraun 768464 283732 su