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Articolo metodologico

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, laterale del setto Nucleus- e Striatum specifici

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⸱

DOI:

10.3791/53303

⸱

18 gennaio 2016

 , 
1TARC (Translational Animal Research Center), University Medical Center, JGU Mainz

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio come trasfettare in modo specifico diverse regioni del sistema nervoso centrale C57BL/6 tramite elettroporazione in utero. Incluso in questo protocollo ci sono istruzioni dettagliate per le trasfezioni delle regioni che si sviluppano nella corteccia, nell'ippocampo, nel talamo, nell'ipotalamo, nel nucleo del setto laterale e nello striato.

Abstract

L'elettroporazione in utero è una tecnica ampiamente utilizzata per la manipolazione spazio-temporale rapida ed efficiente di vari geni nel sistema nervoso centrale dei roditori. La sovraespressione dei geni desiderati è possibile tanto quanto gli studi sulla perdita di funzione mediata da shRNA. Pertanto offre un'ampia gamma di applicazioni. La possibilità di indirizzare particolari cellule in un'area distinta aumenta ulteriormente la gamma di potenziali applicazioni di questo metodo molto utile. Per indirizzare in modo efficiente regioni specifiche, è indispensabile conoscere le sottigliezze, come lo stadio embrionale, la tensione da applicare e, soprattutto, la posizione degli elettrodi.

Qui, forniamo un protocollo dettagliato che consente l'elettroporazione in utero specifica ed efficiente di diverse regioni del sistema nervoso centrale del topo C57BL/6. In particolare viene mostrato come trasfettare le regioni che si sviluppano nella corteccia retrospleniale, nella corteccia motoria, nella corteccia somatosensoriale, nella corteccia piriforme, nel cornu ammonis 1-3, nel giro dentato, nello striato, nel nucleo del setto laterale, nel talamo e nell'ipotalamo. Per queste informazioni sullo stadio embrionale appropriato, viene fornita la tensione appropriata per lo stadio embrionale corrispondente. Soprattutto è raffigurata una mappa angolare, che indica la posizione appropriata del polo positivo. Questo protocollo standardizzato aiuta a facilitare un'efficiente elettroporazione in utero, che potrebbe anche portare a una riduzione del numero di animali.

Introduzione

Dalla prima descrizione nel 2001 da tre gruppi indipendenti 1-3 i n utero elettroporazione è diventato uno strumento standard ampiamente utilizzato per analizzare l'espressione genica nel sistema nervoso centrale dei roditori. Rispetto alla generazione di topi knockout, che è, nonostante le tecniche di continuo miglioramento, ancora di tempo e denaro che consumano, i ricorsi in utero elettroporazione a causa della sua semplicità. Così, in utero elettroporazione consente GAIN- veloce ed efficiente e la perdita di funzione studi 4.

Per trasfettare le regioni cerebrali, la soluzione contenente il plasmide carica negativa viene iniettato in un ventricolo. Durante l'impulso elettrico, il DNA carico negativamente migra verso il polo positivo e quindi la regione trasfettate è selezionabile semplicemente modificando la posizione del polo positivo. E 'stato spesso dimostrato che numerose regioni del sistema nervoso centrale possono essere targeted 3,5-8. Ad esempio, recenti studi dimostrano trasfezioni specifiche del ippocampo, la corteccia piriforme o striato 9-11. Tuttavia, le informazioni sulle posizioni appropriate sono spesso solo poco standardizzato e non sono sempre facili da trasferire a diversi ceppi di topi.

Trasfezione di alcune fasi embrionali è tutt'altro che banale. Molti fattori influenzano devono essere presi in considerazione quando si sceglie il set-up per specifici elettroporazione in utero. In primo luogo, per trasfettare in modo ottimale i rispettivi stadi embrionali, è necessaria la conoscenza delle tensioni del caso. Tensioni elevate riducono il tasso di sopravvivenza, mentre basse tensioni riducono l'efficienza di trasfezione 2,3,12. Anche le dimensioni del paddle dell'elettrodo gioca un ruolo fondamentale, perché l'uso di piastre di elettrodi che sono troppo grandi risultati a ridotta specificità o possono causare la morte per affetto del ritmo cardiaco 4,12,13. La applicatatensione e la dimensione e la posizione della pala dell'elettrodo sono le caratteristiche più importanti da considerare, ma ci sono anche altri fattori che influenzano il risultato della elettroporazione, come la quantità applicata di DNA-soluzione.

Abbiamo sviluppato un protocollo dettagliato che consente trasfezione veloce ed efficiente di varie regioni cerebrali del C57BL / 6 del mouse 12. In questo protocollo informazioni dettagliate sulle tensioni da utilizzare e la dimensione del paddle dell'elettrodo per una maggiore specificità è disponibile. Inoltre, informazioni riguardanti il ​​ventricolo da riempire con raccomandazioni per la quantità di soluzione plasmide e la posizione dell'elettrodo è fornito. L'indicazione delle informazioni dettagliate sulla posizione in una cartina e l'ulteriore visualizzazione di queste posizioni permette specifico semplice ed efficiente in utero elettroporazione della corteccia retrosplenial, la corteccia motoria, la corteccia somatosensoriale, la corteccia piriforme, tegli cornu Ammonis 1-3, il giro dentato, lo striato, il nucleo settale laterali, il talamo e l'ipotalamo.

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Protocollo

Etica Dichiarazione: Il trattamento dei topi e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità agli orientamenti europei, nazionali e istituzionali per la cura degli animali.

1. In Utero Elettroporazione

Nota: In utero elettroporazione è stato eseguito come precedentemente pubblicato 12,14. Pertanto, il metodo è descritto brevemente nel seguito (figura 1).

  1. Preparativi
    1. Preparare veloce verde soluzione priva di endotossine color avanzato trasfezione qualità plasmide (contenente 1,5 pCAGGS) come descritto in precedenza 12.
    2. Tirare e macinare (35 ° angolo) capillari di vetro borosilicato (0,8-0,9 diametro) per preparazioni iniettabili.
    3. Sterilizzare gli strumenti.
  2. Chirurgia
    1. Somministrare analgesici (carprofen, 4 mg / kg di peso corporeo, sc, 24 ore) deposito di almeno 30 minuti prima di iniziare l'intervento chirurgico.
    2. Mantenere la lunghezza dellaanestesia ad un massimo di 35-45 min (Fase III - fase dell'anestesia chirurgici secondo Guedel 15 - massima 25-30 min).
    3. Anestetizzare topi cronometrati in gravidanza con isoflurano (induzione in una camera a 2,8%, la chirurgia tramite maschera: 2,5%). Confermare l'anestesia da non responsività ai piedi-pizzico.
    4. Applicare pomata occhio per prevenire la secchezza oculare durante l'anestesia.
    5. Sterilizzare l'area chirurgica con 7,5% di soluzione Providone-iodio e coprire il mouse con garza sterile (umido con una soluzione allo 0,9% di alcool benzilico soluzione fisiologica), con solo l'area chirurgica esposta.
    6. Tagliare aprire la cavità addominale con un bisturi (incisione cutanea: 1,5-2 cm, incisione muscolo: 1-1,5 cm).
    7. Preservare la cavità addominale aperta da secchi da inumidire con soluzione salina riscaldata alcool benzilico allo 0,9% o altra soluzione isotonica sterile, come indicato dal personale veterinario o del comitato.
    8. Estrarre attentamente corna uterine (con pinze ad anello, non toccare l'utero con le ditaS).
  3. L'iniezione di DNA ed elettroporazione. Nota: I dettagli esatti per il targeting regioni specifiche sono indicati nella sezione 2.
    1. Iniettare lentamente la soluzione di DNA colorato nel ventricolo come indicato nella figura 1 e la sezione 2 tramite i capillari borosilicato preparati.
    2. Applicare la tensione appropriata per il corrispondente stadio embrionale (ad es., 36-38 V per E14) tramite elettrodi specializzati forcipe tipo platino (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, intervallo di pausa 950 msec). Pulse le palette elettroporazione durante l'applicazione della tensione per minimizzare i danni della parete uterina.
  4. Messaggio elettroporazione / assistenza post-operatoria
    1. Ricollocare accuratamente le corna uterine nella cavità addominale.
    2. Suturare il muscolo e l'incisione cutanea separatamente.
    3. Lasciate che il resto del mouse su un dispositivo di supporto per il recupero termico.
    4. Sorvegliare il mouse durante il recupero (comportamento, alimentazione econsumo di acqua), 4 ore, 24 ore e 48 ore dopo l'intervento chirurgico. Se necessario, applicare analgesici supplementari (carprofen, 4 mg / kg di peso corporeo, 24 ore deposito) per altri 2 giorni.

2. Trasfezione di aree cerebrali specifiche

Nota: La posizione del polo positivo è mostrato come l'angolo tra la linea centrale verticale attraverso il ventricolo riempito con la soluzione di DNA (ventricolo destro o terzo) e la posizione del polo positivo. Durante il riempimento del ventricolo sinistro le posizioni sono speculare. In Figura 4 sono mostrate le posizioni primordiale dell'orecchio, che forniscono importanti punti di riferimento.

  1. Trasfezione di aree corticali (Figura 2A, Tabella 1).
    1. Eseguire un intervento chirurgico come descritto nella sezione 1.2. Per l'elettroporazione in utero di aree corticali utilizzare embrioni E14.
    2. Iniettare 1,5-2 microlitri DNA-soluzione contenente 4 mg di DNA nel ventricolo laterale destroattraverso il capillare borosilicato preparati.
      1. Posizionare accuratamente l'embrione utilizzando una pinza ad anello in modo che non ci sono vasi visibili sopra il sito di puntura.
      2. Iniettare lentamente il DNA-soluzione circa 0,75 mm coronale dalla sutura lambdoidal e 0,5 mm lateralmente dalla sutura sagittale (Figura 3). Assicurarsi che la profondità di inserimento è di 1,2 mm (E14, misurata dalla parete uterina). Verificare la presenza di una colorazione blu-verde con una demarcazione tagliente.
    3. Applicare tensione tramite gli elettrodi di platino forcipe tipo specializzati (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, tempo di pausa 950 msec).
      1. Utilizzare un elettrodo pala 3 o 5 mm.
      2. Utilizzare una tensione compresa 36-38 V.
      3. Posizionare il centro degli elettrodi solo anteriori dei primordi dell'orecchio.
      4. Per trasfettare gli angoli uso corteccia retrosplenial 330-0 °, per trasfettare la corteccia motoria 0-40 °, per trasfettare la corteccia somatosensoriale 40-95 °, per trasfettarela corteccia piriforme 95-110 ° (Figura 2A).
    4. Eseguire elettroporazione / assistenza post-operatoria dopo come descritto nel paragrafo 1.4. Sacrifica i topi e analizzare gli embrioni 4 giorni dopo l'elettroporazione (E18), come descritto nella sezione 3.
  2. Transfection dell'ippocampo (Figura 2B, Tabella 1).
    1. Eseguire un intervento chirurgico come descritto nella sezione 1.2. Per l'elettroporazione in utero di formazione dell'ippocampo utilizzare embrioni E15.
    2. Iniettare 2 microlitri DNA-soluzione contenente 4 mg di DNA nel ventricolo laterale destro attraverso il capillare borosilicato preparati.
    3. Applicare tensione tramite gli elettrodi di platino forcipe tipo specializzati (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, tempo di pausa 950 msec).
      1. Utilizzare un elettrodo pala 3 o 5 mm.
      2. Utilizzare una tensione compresa 38-40.
      3. Posizionare il centro del polo negativo appena anteriore del primordio orecchio e il centro of il polo positivo al centro della primordium orecchio.
      4. Per trasfettare giro dentato utilizzano angoli 190-210 °, per trasfettare il Ammonis cornu (CA) 3 210-230 °, per trasfettare il CA2 230-250 °, per trasfettare il CA1 250-275 ° (Figura 2B).
    4. Eseguire elettroporazione / assistenza post-operatoria dopo come descritto nel paragrafo 1.4. Eseguire l'analisi dopo la formazione dell'ippocampo completa (dopo la nascita, p21), come descritto nella sezione 3.
  3. Transfection del laterali nucleo settale e striato (Figura 2C, tabella 1)
    Nota: Gli angoli si sovrappongono con quelli transfecting l'ippocampo. Per trasfettare efficacemente il nucleo settale laterale e striato senza indesiderate ippocampo transfezione fasi precedenti embrionali (E12) devono essere utilizzati.
    1. Eseguire un intervento chirurgico come descritto nella sezione 1.2. Per l'elettroporazione in utero del nucleo settale laterale e striatum utilizzare embrioni E12.
    2. Iniettare 1 ml di DNA-soluzione contenente 4 mg di DNA nel ventricolo laterale destro attraverso il capillare borosilicato preparati.
    3. Applicare tensione tramite gli elettrodi di platino forcipe tipo specializzati (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, tempo di pausa 950 msec).
      1. Utilizzare un elettrodo 0,5 mm.
      2. Utilizzare 33 V.
      3. Posizionare il centro degli elettrodi a livello dei primordi dell'orecchio.
      4. Per trasfettare le uso angoli del setto nucleo laterali 100-170 °, per trasfettare striato 170-240 ° (Figura 2C).
    4. Eseguire elettroporazione / assistenza post-operatoria dopo come descritto nel paragrafo 1.4. Sacrifica i topi e analizzare gli embrioni 6 giorni dopo l'elettroporazione (E18), come descritto nella sezione 3.
  4. Trasfezione del talamo e ipotalamo (Figura 2D, Tabella 1)
    1. Eseguire un intervento chirurgico come descritto nella sezione 1.2. Per l'in utero elettroporazione delle talamo e ipotalamo uso E12-E13 embrioni.
    2. Iniettare 1-1.5-DNA microlitri soluzione contenente 4 mg DNA nel ventricolo laterale (sinistro o destro) attraverso il capillare borosilicato preparati. Attendere 2-3 minuti, fino a quando la soluzione viene diffuso nel terzo ventricolo. In alternativa iniettare direttamente nel terzo ventricolo.
      Nota: Questo migliora la specificità, ma potrebbe causare un tasso di sopravvivenza ridotta (alto rischio di danni).
    3. Applicare tensione tramite gli elettrodi di platino forcipe tipo specializzati (ciclo intervallo di lunghezza 50 msec, tempo di pausa 950 msec).
      1. Utilizzare un elettrodo 0,5 o 3 mm.
      2. Utilizzare una tensione compresa 33-35 V.
      3. Posizionare il centro degli elettrodi appena posteriore i primordi dell'orecchio.
      4. Per trasfettare gli angoli uso talamo 25-40 °, per trasfettare l'ipotalamo 90-180 ° (Figura 2D).
    4. Eseguire posta elettroporazione / assistenza post-operatoria come described nella sezione 1.4. Sacrifica i topi e analizzare gli embrioni 6 giorni dopo l'elettroporazione (E18), come descritto nella sezione 3.

3. Fissazione perfusione

  1. Preparativi
    1. Warm 4% paraformaldeide (PFA) a 37 ° C.
    2. Riempire una siringa da 50 ml con PBS (4 ° C) e una seconda siringa con riscaldato PFA. Evitare le bolle.
    3. Collegare le siringhe a un rubinetto a tre vie. Collegare il terzo fine di un set di infusione alato (farfalla).
    4. Lavare il set di infusione alato con PBS.
  2. Perfusione
    1. Profondamente anestetizzare topi (gravidanza o postnatale trasfettate) con l'applicazione sottocutanea di ketamina cloridrato (60 mg / kg) e xilazina (7,5 mg / kg).
    2. Confermare la fase chirurgica tolleranza refrattarietà ai piedi-pizzico.
    3. Aprire la cavità addominale appena sotto la gabbia toracica.
    4. Tagliare con cautela la membrana.
    5. Aprire con cautela la gabbia toracica mediante un taglio sull'esito ach fino alla clavicola.
    6. Inserire la punta della farfalla nella camera del cuore sinistro (partendo dalla punta del cuore).
    7. Tagliare l'appendice atriale sinistra.
    8. Lentamente profumato il mouse con PBS (circa 10 ml).
    9. Accendere il rubinetto a tre vie.
    10. Profumato il mouse con 5-10 ml 4% PFA.
    11. Decapitare il mouse utilizzando le forbici e sezionare il cervello a partire dalla forame magno. Eseguire la dissezione come precedentemente pubblicato 16.
    12. Postfixate il cervello per 2 giorni a 4% PFA. Mantenere il cervello a 4 ° C al buio.

4. immunoistochimica

  1. Genera 70 sezioni micron (ad esempio, con un vibratome).
  2. Opzionale: incrementare la fluorescenza con l'anticorpo colorazione.
    1. Bloccare le sezioni per 1 ora a RT (0,1-0,2% Triton X-100, siero di capra normale 5%)
    2. Incubare O / N con l'anticorpo appropriata (anti-GFP, 1: 1.000)
    3. Lavare 3-5 Volte con tampone fosfato 0,1 M.
    4. Incubare 3-5 ore con l'appropriato anticorpo secondario fluorescenza coniugato (Alexa Fluor 488 coniugato anti-coniglio IgG, 1: 1.000).
    5. Opzionale: Controcolorare con 4-6-diaminodino-2-fenilindolo (DAPI, 0,2 g / ml in tampone fosfato 0,1 M) per 1 min.
    6. Analizzare fluorescenza con un microscopio a fluorescenza appropriata.

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Risultati

La figura 2 mostra esempi di specifica in utero elettroporazione delle regioni in via di sviluppo nella corteccia retrosplenial, la corteccia motoria, la corteccia somatosensoriale, la corteccia piriforme, il cornu Ammonis 1-3, il giro dentato, lo striato, il nucleo settale laterali , il talamo e l'ipotalamo. I risultati delle trasfezioni sono confrontate con l'angolazione consigliata (Figura 2). Per una migliore visualizzazione degli angoli in vivo la posizion...

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Discussione

Questo protocollo descrive in dettaglio come trasfettare la corteccia retrospleniale, la corteccia motoria, la corteccia somatosensoriale, la corteccia piriforme, il cornu ammonis 1-3, il giro dentato, lo striato, il nucleo del setto laterale, il talamo e l'ipotalamo di topi C75BL/6. Con tutte le informazioni fornite, questo è il primo protocollo, che fornisce tutte le informazioni necessarie per ricreare facilmente le trasfezioni di queste regioni cerebrali nel topo C57BL/6. Le pubblicazioni precedenti si sono per lo pi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Tecnico supportato da Melanie Pfeifer e Nikolai Schmarowski (Istituto di Anatomia Microscopica e Neurobiologia, Centro Medico Universitario di Magonza).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
EndoFree Plasmid Maxi KitQIAGEN12362
Fast GreenRoth0301.1
pCAGGSAddgene
capillari in vetro borosilicato (diametro 0,8-0,9 mm)Wold Precision Instrument Inc.1B100F-4
Isoflurano (Forene)AbbottPZN 4831850
Carprofene (Rimadyl)Pfizer GmbH: 400684.00.00
unguento per gli occhi (Bepanthen Augen und Nasensalbe)Bayer PZN 01578681
0,9% alcool benzilico 0,9% soluzione salinaFarmacia
del Centro medico universitario Garza di Magonza
(ES-Kompressen)Hartmann407835
sterile 5-0 Perma-Hand Silk SutureEthicon Johnson & JohnsonK890H
pinza ad anello 1/ 1,5 mmFine Science Tools11101-09
pinza ad anello 4,8/ 6 mmFine Science Tools11106-09
pinza ad anello 2,2/ 3 mmFine Science Tools11103-09
Pinza Adson-Seghettata dritta 12 cmFine Science Tools1106-12
IrisForbici-Delicata dritta-Affilata/ Smussato 10 cmFine Science Tools14028-10
Forbici Mayo-Stille-Dritto 15 cmFine Science Tools14012-15
Dumont #5 Pinze-InoxFine Science Tools11251-20
Castroviejo Portaago-con bloccaggio-Carburo di tungsteno 14 cmFine Science Tools12565-14
Elektroporator CUY21 SC Nepa Gene Co.
FST 250 Sterilizzatore a tallone caldoStrumenti di scienza fine18000-45
Microgrinder EG-44Narishige
P-97 Estrattore di micropetteSutter Instrument CompanyP-97
Elettrodi in platino 650P 0,5 mmNepageneCUY650P0,5
Elettrodi in platino 650P 3 mmNepageneCUY650P3
Elettrodi di platino 650P 5 mmNepageneCUY650P5
Elettrodi di platino 650P 10 mmNepageneCUY650P10
Sistema di anestesiaRothacher-Medical GmbHCV-30511-3 Vapor 19.3
Piastra riscaldanteRothacher-Medical GmbHHP-1M
Regolatore di temperatura 220V ACRothacher-Medical GmbHTCAT-2LV
Numero di approvazione

Riferimenti

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