Articolo metodologico

Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA

DOI:

10.3791/53307

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26 dicembre 2015

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1CSIR-Institute of Genomics and Integrative Biology, New Delhi, India, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), New Delhi, India

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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I microRNA svolgono ruoli cruciali nel cervello e sono potenziali bersagli per la modellazione della neurodegenerazione. Tuttavia, perturbare i livelli di miRNA è difficile a causa della breve lunghezza dei miRNA e dell'inaccessibilità del tessuto cerebrale. Questo video presenta un metodo per la progettazione di antagomir e la somministrazione di antagomir specifici per il cervello utilizzando un neuropeptide nei topi.

Abstract

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I microRNA (miRNA) sono regolatori chiave dell'espressione genica. Nel cervello, processi vitali come il neurosviluppo e le funzioni neuronali dipendono dalla corretta espressione dei microRNA. La perturbazione dei microRNA nel cervello può essere utilizzata per modellare le malattie neurodegenerative modulando la morte delle cellule neuronali. Attualmente, l'iniezione stereotassica viene utilizzata per fornire agenti di knockdown dei miRNA in una posizione specifica nel cervello. Qui, discutiamo le strategie per progettare antagomiri contro i miRNA con modificazioni nucleotidiche bloccate (LNA). Successivamente descrivere un metodo per la somministrazione di antagomiri nel cervello, in modo uniforme in diverse regioni del cervello. Questo metodo è semplice e ampiamente applicabile poiché supera l'intervento chirurgico, le lesioni associate e la limitazione della somministrazione locale nelle iniezioni stereotassiche. Abbiamo preparato un complesso di glicoproteina del virus della rabbia (RVG) peptide neurotropico che penetra nelle cellule con antagomir contro miRNA-29 e iniettato attraverso la vena caudale, per veicolarlo specificamente nel cervello. Il design dell'antagomir incorporava caratteristiche che consentono il targeting specifico del miRNA e la formazione di complessi non covalenti con il peptide. Il knock-down del miRNA nelle cellule neuronali ha provocato la morte cellulare apoptotica e i difetti comportamentali associati. Pertanto, il metodo può essere utilizzato per modelli acuti di neurodegenerazione attraverso la perturbazione di miRNA.

Introduzione

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I microRNA sono emersi come nuovi bersagli terapeutici per il loro ruolo universale nella regolazione dell'espressione genica e prova diretta per il coinvolgimento nella malattia. MiRNA sono allo studio attivamente per il loro potenziale come bersagli farmacologici 1,2. Inoltre, alterazioni nell'espressione di miRNA sono associati a diverse malattie 3 e simulazione di questi cambiamenti perturbazione artificiale dell'espressione dei miRNA possono essere utilizzati per studiare i meccanismi cellulari coinvolti nella manifestazione della malattia. Tessuto specifico di consegna di farmaci destinati miRNA è attualmente una delle principali sfide per lo sviluppo di farmaci a base di miRNA. Antagomirs e imita miRNA sono agenti promettenti per perturbare i livelli di miRNA 4-6. Tuttavia, funzioni speciali che migliorano la loro specificità ed efficacia devono essere incorporato nel design di antagomirs prima di poter essere utilizzati in vivo perturbazione dell'espressione dei miRNA.

I microRNA sono particolarmente rilevanti come bersagli in neurodegenerativa attualmente incurabile e malattie neuro-sviluppo. La barriera emato-encefalica pone una limitazione alla consegna antagomirs nel cervello. Iniezioni stereotassica sono ampiamente utilizzati in modelli di roditori per consegnare molecole in posizioni specifiche nel cervello 7. Richiede abilità, ingenti investimenti in strumentazione e tempo. Iniezioni stereotassica sono invasivi, comporta un intervento chirurgico, causare almeno lievi lesioni e sono limitate alla consegna locale. L'uso di cellule penetrante peptidi con una preferenza per i neuroni di targeting può contrastare queste limitazioni dal momento che possono essere forniti per via trans-vascolare ma violare la barriera emato-encefalica. Tale peptide derivato dal virus della rabbia glicoproteina (RVG), è stato precedentemente usati per fornire siRNA contro l'encefalite giapponese di virus nei topi 8. Abbiamo trovato che l'uso del peptide per antagomir consegna, miRNA può essere efficacemente abbattuto nel cervello di topo 9.

ONTENUTO "> La seconda grande sfida di miRNA knock-down nasce dalla piccola dimensione del miRNA e la presenza di isoforme sequenza strettamente correlati. Prendiamo l'esempio di MMU-miR 29-famiglia che si compone di tre isoforme strettamente correlati, miR-29a , b e c. antagomirs sono generalmente modificati lungo la catena per aumentare la loro stabilità e renderli resistenti agli attacchi di nucleasi. Locked Nucleic Acids (LNA) offre un ulteriore vantaggio di migliorare la stabilità termica e anche portare a bersaglio degrado di là sterico 10. Introdurre modifiche tutte lungo la catena può essere efficace ma costoso. Abbiamo visto in precedenza che modifiche oltre un numero ottimale non può migliorare ulteriormente l'efficacia. Il design del antagomir comporta quindi la modifica ottimale del antagomir.

Per il complesso antagomir non covalente con il peptide neurotropica, una carica epta all'estensione nona-arginina è usato. D-Argininaresidui sono utilizzati poiché conferiscono maggiore stabilità in quanto non sono suscettibili di clivaggio da proteasi. Epta a tratti nona-arginina agire agenti cellulari penetrante come efficienti, anche se non conferiscono tipo di cellula specificità. Con covalentemente collegando il peptide RVG al linker nona-arginina, un neurotropica, cellule penetrante peptide è stato generato. I residui carichi positivamente del peptide interagiscono con scheletro dell'acido nucleico carica negativa, per formare complessi. Questi complessi possono essere utilizzati per trasfettare efficacemente DNA o RNA in cellule in coltura e in vivo nei tessuti.

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Protocollo

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Nota: Tutti i procedimenti tra cui soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Etico Istituzionale Animali (AICE) presso l'Istituto di Genomica e Biologia Integrativa, Nuova Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Questo protocollo è specificamente adattato per somministrazione mirata di antagomir-29 nel cervello e atterramento di miR-29.

1. antagomir Design Strategy

  1. Recuperare il maturo sequenza di miRNA da miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
  2. Recuperare le sequenze di relativi familiari miRNA utilizzando il link "Gene Famiglia" nel record miRBase
    (Http://www.mirbase.org/cgi-bin/mirna_summary.pl?fam=MIPF0000009).
  3. Reverse completare la sequenza: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html fornisce un comodo strumento perinvertire sequenze complemento.
  4. Segnare le posizioni da modificate da LNA utilizzando le seguenti linee guida:
    1. Scegliere residui timina immessi 3-4 basi a parte per la modifica LNA, poiché pirimidine LNA sono più stabili di purine 12.
    2. Scegli residui di citosina separati da 3-4 residui se passo precedente produce meno di cinque modifiche.
    3. Priorità cinque modifiche all'estremità 5 'del antagomir, poiché questo evita la sequenza seme.

2. antagomir-neuropeptide Preparazione Complex

Nota: Questa è la fase più critica nel protocollo e ha bisogno di standardizzazione. Per standardizzare il protocollo qualsiasi oligonucleotide fluorescente (FLO) può essere utilizzato al posto del antagomir 9. I peptidi devono essere di purezza elevata (grado HPLC, 98% di purezza) .Sequences e carica di peptide e antagomir sono riportati nella tabella 1.

  1. Decidere il numero di moles di antagomir da iniettare in base alla carica molare antagomir, la sua tossicità e peso del mouse. Calcolare il numero di moli di peptide da iniettare riferiscono al rapporto molare di carica antagomir: peptide.
    NOTA: Standardizzare rapporto molare responsabile antagomir: peptide per la tossicità e la consegna effettiva nel cervello di topo. Usare differenti rapporti di carica molare di oligonucleotide fluorescente: peptide per la standardizzazione. Abbiamo scoperto che antagomir-29 e di controllo erano entrambi tossici 4microgram / grammo di peso corporeo di mouse. Antagomir-29 e di controllo sono stati utilizzati a 2microgram / grammo di peso corporeo, ma questa concentrazione efficace può variare per ogni microRNA.
  2. Diluire il peptide e antagomir in tubi microcentrifuga separati da soluzioni madri con sterile 10% D-glucosio alla concentrazione finale desiderata come calcolato al punto 1.
  3. Mantenere la provetta per microcentrifuga con la soluzione peptide in un vortice a velocità moderata vortex.
  4. Aggiungere 1/3 di unsoluzione ntagomir al tubo soluzione peptide, lentamente, goccia a goccia, mentre si miscela accuratamente su un vortex.
  5. Continuare a mescolare di soluzioni sul vortice per il prossimo 1 minuto e poi lasciare che la miscela di riposare per 1 minuto.
  6. Ripetere il passaggio 4 e 5 altre due volte per mescolare il restante antagomir soluzione con la soluzione del peptide nella stessa provetta per microcentrifuga. La lenta aggiunta è critica per la formazione di complessi mono-dispersa che sono efficaci nel trasfezione. Rapid aggiunta può provocare l'aggregazione dei complessi e la loro precipitazione.
  7. Incubare il complesso per 30 minuti a temperatura ambiente, senza vortex. Durante questo periodo di incubazione, acclimatize i topi al laboratorio dove verranno eseguite le iniezioni.

3. Coda Vena Iniezione di Complex antagomir-neuropeptide

  1. Per trattenere l'animale, posizionare il mouse in un dispositivo di immobilizzazione o decapicone di dimensioni adeguate.
  2. Pulire la superficie della coda utilizzando tampone di cotone pre-imbevuto in acqua calda (circa 40 ° C). Questo promuoverà vasodilatazione e aumentare la visibilità della vena.
  3. Approccio la coda con un piccolo volume (0,5 - 1.0 cc) siringa da insulina ad un angolo di 15-20 °. Fare attenzione a non introdurre aria nella siringa. Iniziare la porzione distale della coda. Iniettare il complesso. Rimuovere l'ago ed applicare un tampone antisettico direttamente al sito di iniezione (circa 5-10 sec) per fermare le emorragie.
  4. Sostituire il mouse in una gabbia ventilato singolarmente nel gruppo di 3-5, con la pannocchia e carta velina come arricchimento. Non tenere i topi uninjected e iniettati in stessa gabbia.

4. comportamentali Assays

Nota: Mantenere l'intervallo di tempo di 3-4 ore tra test di iniezione e comportamentali per permettere il recupero dopo l'iniezione. Portare il mouse in una stanza tranquilla. Non disturbare gli animali durante questo periodo di acclimatazione.

  1. Acclimatarsi il mouse per ilnuova stanza per 30 minuti e poi avviare i seguenti test comportamentali. Mantenere uno spazio di 10 minuti tra ogni test comportamentale.
  2. Clasping arti posteriori:
    NOTA: Questo test indica disfunzione motoria e danni neurologici.
    1. Sollevare delicatamente il mouse tenendo vicino alla base della coda sullo sfondo chiaro.
    2. Controllare la posizione degli arti posteriori per 10-15 secondi. Tipo selvatico sguanci topo arti posteriori distanti addome, mentre un mouse atassica tende a ritirare una o entrambe le zampe posteriori verso l'addome più del 50% del tempo sospeso 13.
    3. Ritorna il mouse per la gabbia
  3. Test Ledge:
    1. Sollevare il mouse delicatamente tenendo la coda e tenerlo sul davanzale di una gabbia.
    2. Osservare il mouse in particolare in un angolo della gabbia. Topo selvatico tipo può passare agli angoli facilmente senza paura e perdere l'equilibrio. Topo Atassica perdere il suo equilibrio, congelare o scuote mentre si cammina lungo la sporgenza gabbia e agli angoli.
  4. test piede stampa Mouse:
    NOTA: per questo test a mantenere il foglio assorbente pronto, sul pavimento di una pista stretta (~ 70 cm di lunghezza, ~ 5 cm di larghezza con ~ 5 cm di alte mura.)
    1. Tenere il mouse delicatamente con una mano e applicare l'inchiostro sugli arti posteriori da una spazzola.
    2. Posizionare il foglio assorbente sul pavimento di una pista stretta.
    3. Lasciare mouse per camminare o correre su un foglio assorbente in linea retta in una pista da un'estremità all'altra.
    4. Ripetere il processo per altre due volte con ogni mouse utilizzando foglio assorbente fresco.
    5. Misurare la distanza tra due passi consecutivi nel movimento in avanti. Non includere prima e l'ultima pochi orme in cui l'animale è solo iniziando e finendo la sua corsa, rispettivamente.

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Risultati

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Utilizzando la procedura qui presentata, complessi di oligonucleotide 50microgram fluorescente (FLO) e ~ 850microgram RVG peptide di 01:15 rapporto molare di carica (FLO: peptide) sono stati preparati e iniettato una sola volta attraverso vena della coda. Complesso di non neurotropi rabbia Virus Matrix (RVM) e peptide FLO è stato utilizzato come controllo di consegna. Il giorno dopo, i topi cervello e il fegato sono stati isolati e sospensioni singola cella sono stati preparati. Le cellule sono state osservate al micros...

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Discussione

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Qui dimostriamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare gli effetti della modulazione dei miRNA. Attualmente, la maggior parte dei tentativi di caratterizzazione in vivo delle funzioni dei miRNA comporta la creazione di topi knockout o di un transgenico che esprime una spugna di miRNA. La maggior parte dei miRNA, anche quelli specifici del tipo di cellula, sono espressi in più di un organo. Ad esempio, i miRNA inizialmente ritenuti specifici del sistema ematopoietico sono espressi anche nel cervel...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Souvik Maiti per l'aiuto nella progettazione degli antagomir. Ringraziamo anche Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey e Bijay Pattnaik per il loro aiuto con i metodi sperimentali. Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio per la ricerca scientifica e industriale (BSC0123). HS, MV e RR riconoscono la borsa di studio del Council of Scientific and Industrial Research, India. Il MAS riconosce la borsa di studio della Commissione per le sovvenzioni universitarie, India.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Vortice
Trattenitore o Decapicone
Pista~ 70 cm di lunghezza, ~ 5 cm di larghezza con pareti alte ~ 5 cm.
Reagenti
Oligonucleotidi marcati in fluorescenza (siGLO)GE Healthcare Dharmacon INCD0016300120
10% D-glucosio
Antagomir-29SintesiExiqon
Controllo AntagomirSintesiExiqon
Neuropeptide RVGG.L.Biochem ( Shanghai) Ltd.sintesi personalizzata>98% di purezza
Neuropeptide RVMG.L.Biochem (Shanghai) Ltd.sintesi personalizzata>98% di purezza
Altro
Cotone
Acqua
Siringhe per insulina
assorbenti
Pennello per
inchiostro
Antisettico
stretta sterilepersonalizzata personalizzata calda Fogli

Riferimenti

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  1. Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
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Silenziamento di microRNADesign di antagomirAcido nucleico bloccatoPeptide a penetrazione cellulareGlicoproteina del virus della rabbiaIniezione nella vena caudaleSomministrazione specifica per il cervelloTest comportamentaliPCR quantitativaModello di neurodegenerazione

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