La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell

Summary

Le proteine dell'involucro nucleare svolgono un ruolo centrale in molti processi biologici di base e sono state implicate in una varietà di malattie umane. Questo protocollo descrive un nuovo modello murino basato su Cre/Lox che consente il controllo spazio-temporale della rottura dei complessi LINC.

Abstract

La migrazione nucleare e l'ancoraggio all'interno dei tessuti in via di sviluppo e adulti si basano fortemente su grandi assemblaggi di proteine macromolecolari chiamati LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). Questi scaffold proteici attraversano l'involucro nucleare e collegano l'interno del nucleo ai componenti del citoscheletro citoplasmatico circostante. I complessi LINC sono costituiti da due famiglie di proteine conservate evolutivamente, le proteine Sun e le Nesprins che ospitano motivi di firma molecolare C-terminale chiamati domini SUN e KASH, rispettivamente. Le proteine solari sono proteine transmembrana della membrana nucleare interna il cui dominio nucleoplasmatico N-terminale interagisce con la lamina nucleare mentre i loro domini C-terminali SUN sporgono nello spazio perinucleare e interagiscono con il dominio KASH delle Nesprins. Le isoforme canoniche di Nesprin hanno un N-terminale di dimensioni variabili che si proietta nel citoplasma e interagisce con i componenti del citoscheletro. Questo protocollo descrive la validazione di una strategia di topo transgenico dominante-negativo che interrompe le interazioni endogene SUN/KASH in modo specifico per tipo di cellula. Il nostro approccio si basa sul sistema Cre/Lox che bypassa molti inconvenienti come la letalità perinatale e i fenotipi cellulari non autonomi che sono associati ai modelli germinali di inattivazione del complesso LINC. Per questo motivo, questo modello fornisce uno strumento utile per comprendere il ruolo dei complessi LINC durante lo sviluppo e l'omeostasi in una vasta gamma di tessuti.

Introduction

L'involucro nucleare (NE) separa nucleoplasma dal citoplasma. Esso è composto da una membrana nucleare interna ed esterna (INM e ONM, rispettivamente) che collegano a pori nucleari. Il lume delineato da due membrane si chiama lo spazio perinucleare (PNS). Il ONM è un'estensione del reticolo endoplasmatico rugoso (ER) e l'INM aderisce alla lamina nucleare, un reticolo di nucleare tipo V filamenti intermedi rappresentato da A e B lamine di tipo ^1,2. Linker del nucleoscheletro e citoscheletro (LINC) sono complessi macromolecolari assemblee che attraversano l'intero involucro nucleare collegare fisicamente l'interno del nucleo di filamenti citoscheletrici e motori molecolari (Figura 1A). Sono costituiti da interazioni tra motivi evolutivamente conservati che caratterizzano due famiglie di proteine ​​transmembrana integranti del NE: Sun (SAD1 / Unc84) proteine ​​e Nesprins (nucleare Envelope SPectRINS). Nei mammiferi, Sun1 e Sun2 are transmembrana proteine ​​della INM la cui regione nucleoplasmic N-terminale interagisce direttamente con A e B lamine di tipo ^3-5. Sull'altro lato della INM, all'interno del PNS, proteine ​​Sun Harbor un tratto evolutivo conservata di ~ 150 amminoacidi C-terminale chiamato dominio SUN. Domini SUN interagiscono direttamente con il evolutivo conservata KASH (Klarsicht / Anc-1, Syne omologia) dominio, la firma molecolare di Nesprins. Domini KASH consistono di un tratto di ~ 30 C-terminale amminoacidi che sporge nel PNS seguito da un dominio transmembrana ^6. Almeno quattro geni distinti Nesprin (Nesprin1-4) codificano KASH contenenti proteine ​​che localizzano al NE ^7. Le regioni citoplasmatici di Nesprins, il cui variare taglie da ~ 50kDa (Nesprin4) a un sorprendente 1.000 kDa (Nesprin1 gigante), contengono spectrina multiplo ripete così come i motivi specifici che consente loro interazione con componenti del citoscheletro, come l'actina, plectina e motori molecolari ^{8- 13.}

Studi di vertebrati e invertebrati hanno mostrato che / motori molecolari Lamin Sole / Nesprin / costituiscono un "asse" evolutivamente conservata controllare la migrazione nucleare e di ancoraggio. Diversi knock-out (KO) modelli murini di componenti complessi LINC sono stati descritti e sono stati strumentali nel fornire un quadro per capire il ruolo delle proteine ​​Sole e Nesprin a NE durante lo sviluppo dei mammiferi ^9,14,15. Tuttavia, questi modelli presentano diversi svantaggi significativi, più in particolare: 1) difficoltà nell'interpretare fenotipi dovuti alla cella effetti non autonomi, 2) difficoltà nel distinguere i contributi fenotipiche di Kash contenenti vs. KASH-meno Nesprin isoforme ^16, 3) il la ridondanza funzionale delle proteine ​​Sole e Nesprin al NE in numerosi tipi di cellule richiede sistemi di allevamento complessi per inattivare tutte le interazioni SUN-Kash in topi ^{17 e} 4) la letalità perinatale di topi deficienti per la KASH-dominio di entrambiNesprins1 e 2 preclude l'analisi dei fenotipi adulti ^18.

Questo protocollo descrive un modello di topo romanzo progettata per distruggere tutte le interazioni SUN-KASH in vivo, in una cella modo autonomo e evolutivamente regolata, bypassando così molti degli inconvenienti sopra delineati. Questo / modello murino basato LOX-Cre si basa su due concetti importanti: 1) il dominio KASH di qualsiasi proteina Nesprin noto è sufficiente per indirizzare EGFP a NE in sistemi di colture cellulari e 2) i domini SUN interagire promiscuamente con i domini Kash, quindi sovraespressione di qualsiasi dominio KASH saturerà tutti i domini SUN endogeni e inattivare complessi LINC in modo negativamente dominante ¹⁷ (Figura 1B). Questo protocollo descrive la raccolta dei tessuti e fasi di lavorazione utilizzate per confermare l'interruzione di tutte le interazioni SUN-Kash in cellule di Purkinje cerebellari.

Protocol

Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) presso la Washington University di St. Louis.

1. Allevamento Mouse e genotipizzazione

1. Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) topi con Tg (PCP2-Cre) per produrre topi Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) ^19,20. Nota: Mentre il resto di questo protocollo concentra sull'uso della linea Tg (PCP2-Cre) topo per restringere espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje nel cervelletto, una procedura simile può essere seguita con qualsiasi altra Tg (Cre) mouse ( Figura 2A).
2. Eseguire genotipizzazione per individuare i cuccioli che ospitano sia transgeni EGFP e Cre come descritto in precedenza ^19.

2. Preparazione dei Materiali per la dissezione e tessuto Collection

1. Preparare 100 ml di 30% di saccarosio in PBS (30 g di saccarosio / 100 ml di PBS 1x) e conservare a -20 ° C. Il giorno del tessuto harvesting, disgelo e carico ~ 30-35 ml di soluzione di saccarosio in una siringa da 35 ml per perfusioni transcardial.
2. Preparare 40 ml di 4% PFA in PBS (10 ml 16% paraformaldeide e 30 ml PBS). Carico ~ 30-35 ml di 4% PFA in una siringa da 35 ml per perfusioni transcardial.
3. Riempire una piastra di coltura tissutale 10 centimetri con 10 ml di PBS per la dissezione dei tessuti.
4. Preparare un cocktail di ketamina / xilazina costituito da 16 mg / ml di ketamina e 3 mg / ml xilazina.
5. Preparare una soluzione di etanolo al 70% per la dissezione.

3. Dissection e tessuto Collection

1. Usando una siringa da 1 ml, 500 ml di iniettare il cocktail ketamina / xylazina per 25 grammi di peso corporeo ed attendere ~ 15 min. In alternativa, utilizzare un altro metodo di sedazione istituzionalmente riconosciuto che è appropriato per il sistema biologico di interesse.
2. Su sedazione, pizzicare delicatamente la zampa posteriore per confermare la mancanza di risposta al dolore, riporre tutte le zampe su un vassoio di polistirolo con il lato dorsale delil mouse verso il basso.
3. Spruzzare la addome con 70% etanolo e fare un'incisione dal basso addome alla sommità della gabbia toracica per accedere al cuore.
4. Effettuare una piccola incisione nell'atrio destro del cuore e inserire la siringa contenente la soluzione di saccarosio al 30% nel ventricolo sinistro del cuore.
5. Profumato la soluzione ad una velocità di ~ 2-5 ml per min. Quando è vuoto, rimuovere la siringa e ripetere con la soluzione PFA 4%.
6. Sblocca il mouse dal vassoio di polistirolo e decapitarlo per accedere al cervello.
7. Togliere la pelle intorno alla testa dell'animale con pinze e forbici. Fare un buco nella parte posteriore del cranio con un ago e rimuovere con attenzione il cranio con forbici e pinze dissezione.
8. Una volta che il cervello è chiaramente accessibile, utilizzare pinze per rimuovere il cervelletto e metterlo in PBS. Bisect cervelletto nel piano sagittale con un bisturi e trasferire la soluzione di saccarosio al 30% per una notte a 4 ° C. Nota: Per prepararesono sezioni di paraffina, fissano il cervelletto notte a 4 ° C in PFA 4% prima di incorporamento dei tessuti e sezionamento.

4. Tissue Processing e sezionamento

1. Preparare una sospensione di ghiaccio secco e butano 2-metil. Consentire la temperatura del bagno si stabilizzi per 5 min.
2. Riempire un cryomold con OCT e mettere la metà del cervelletto bipartita nello stampo.
3. Utilizzando un microscopio da dissezione e una coppia di pinze posizione cervelletto modo che la superficie bisecata (vicino alla linea mediana del cervelletto) è rivolto verso l'alto.
4. Trasferire il cryomold all'impasto ghiaccio secco per 5 minuti fino a quando il composto ottobre ha formato una solida matrice bianco intorno il campione di tessuto. Nota: I campioni congelati possono essere conservati a -20 ° C, se necessario.
5. Etichetta pretrattate diapositive poli-lisina per la raccolta sezioni di tessuto e preparare il criostato secondo le istruzioni del produttore per raccogliere 15 micron sezioni del Cerebellum. Per raccogliere sezioni contattare attentamente la sezione PTOM il lato rivestito poli-lisina della slitta. Per mantenere l'orientamento della sezione, non ruotare la slitta durante questa fase.
6. Sezioni di tessuto Conservare a -20 ° C fino a procedere con la colorazione e l'imaging.

5. La colorazione e imaging di Cervelletto Sezioni

1. Preparare le seguenti soluzioni prima della colorazione dei tessuti:
   ~ 50 ml di PBS
   ~ 5-10 ml di PFA 4% in PBS
   ~ 10-20 ml di Triton X-100 0,5% siero asino, 10% in PBS
2. Sezioni cerebellari disgelo. È importante sottolineare che ridurre al minimo la loro esposizione a qualsiasi fonte di luce continua e intensa per evitare sbiadimento di EGFP.
3. Con una penna barriera idrofobica, disegnare un rettangolo intorno alle sezioni di tessuto.
4. Post-fissare le sezioni con 4% PFA per 5 min. Usi abbastanza liquido da coprire l'intera area delimitata dalla barriera idrofoba (di solito ~ 500 microlitri). Utilizzare un aspirapolvere o pipetta, rispostare il fissativo essere particolarmente attenti a non disturbare i sezioni di tessuto.
5. Con una pipetta, applicare delicatamente PBS sul vetrino senza disturbare le sezioni di tessuto. Dopo 5 min utilizzare il vuoto o pipetta per rimuovere con attenzione il liquido. Ripetere la PBS sciacquare un totale di tre volte.
6. Usando una pipetta, applicare con cura la diluizione appropriata di anticorpi primari (3 ml calbindin e / o anticorpi Nesprin2 per 900 ml di soluzione di) nello 0,5% Triton X-100, il 10% di siero asino in PBS. Incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio.
   Nota: EGFP-KASH2 sarà visibile mediante microscopia a fluorescenza diretta su sezioni congelate, e non è necessario utilizzare un anticorpo anti-EGFP. Tuttavia, se sono stati preparati sezioni di paraffina, l'imaging di EGFP-KASH2 richiede immunolocalizzazione con un anticorpo anti-EGFP.
7. Rimuovere la soluzione di anticorpi e risciacquare con PBS per tre volte.
8. Preparare 1: 1.000 diluizioni di anticorpi secondari Alexa-Fluor in 0,5% Triton X-100,10% di siero asino in PBS e conservare al buio.
9. Rimuovere delicatamente la PBS risciacquo finale e applicare la diluizione anticorpo secondario per un'ora al buio.
10. Rimuovere la soluzione anticorpo secondario, sciacquare e lavare la sezione tre volte. Se necessario, applicare una colorazione nucleare, come DAPI (~ 300nm), durante la prima applicazione PBS.
11. Rimuovere completamente la soluzione di PBS da tutto il tessuto e posto ~ 5-7 ml di mezzo di montaggio sulla sezione di tessuto. Collocare un vetrino di vetro sopra la sezione di tessuto e ritirate ~ 15-30 minuti a temperatura ambiente al buio.
12. Utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato i filtri appropriati per visualizzare EGFP e qualsiasi altre lunghezze d'onda appropriate per gli anticorpi secondari usati nelle fasi 5.8 / 5.9. A fette cerebellare, utilizzare un obiettivo 20X per visualizzare cerchi nucleari EGFP-KASH2.

Results

Questo protocollo illustra l'utilità del (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello di topo Tg di limitare l'espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje cerebellari utilizzando Tg (PCP2-Cre) topi. Nel Tg ^(PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, la griglia di lettura aperta LacZ / V5 è asportato in P6 dalla ricombinasi Cre determinando così l'espressione di EGFP-KASH2 specificamente mirato al Purkinje cellule (Figura 2A). Come previsto, EGFP-KASH2 è rivolto a membrana nucleare come indicato dal modello bord...

Discussion

La fase più critica per studiare con successo il ruolo di complessi LINC in vivo utilizzando la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello Tg è quello di individuare una linea di topi Cre adatto (s). Infatti, se Cre è attiva in altri tipi di cellule coinvolte in percorsi simili, può complicare l'interpretazione dei risultati. Quindi, è importante esaminare cellule vicine, come mostrato qui negli strati cellulari e molecolari granuli del cervelletto (Figura 2B). Analogamente, per massimizzare eventuali...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Saccarosio	Sigma Aldrich	S0389
10x PBS	Gibco	14200-075
16% Paraformaldeide Soluzione	Microscopia Elettronica Scienze	15710
OCT Composto	Tissue-Tek	4583
Vetrini di adesione	StatLab	M1000W
Siero d'asino	Sigma Aldrich	D9663
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
ImmuEdge Pen	Vector Laboratories	H-4000
Anticorpo anti-Calbindina	Sigma Aldrich	C9848
Anticorpo anti-EGFP	Abcam	ab13970
Anticorpo			Precedentemente descritto in Ref. 21
Montaggio fluorescente Media	Dako	S3023
2-metilbutano	Sigma Aldrich	O3551