Le proteine dell'involucro nucleare svolgono un ruolo centrale in molti processi biologici di base e sono state implicate in una varietà di malattie umane. Questo protocollo descrive un nuovo modello murino basato su Cre/Lox che consente il controllo spazio-temporale della rottura dei complessi LINC.
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Articolo metodologico
La convalida di un modello di topo per Disrupt LINC Complessi in modo specifico-Cell
In questo articolo
Sommario
Abstract
La migrazione nucleare e l'ancoraggio all'interno dei tessuti in via di sviluppo e adulti si basano fortemente su grandi assemblaggi di proteine macromolecolari chiamati LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). Questi scaffold proteici attraversano l'involucro nucleare e collegano l'interno del nucleo ai componenti del citoscheletro citoplasmatico circostante. I complessi LINC sono costituiti da due famiglie di proteine conservate evolutivamente, le proteine Sun e le Nesprins che ospitano motivi di firma molecolare C-terminale chiamati domini SUN e KASH, rispettivamente. Le proteine solari sono proteine transmembrana della membrana nucleare interna il cui dominio nucleoplasmatico N-terminale interagisce con la lamina nucleare mentre i loro domini C-terminali SUN sporgono nello spazio perinucleare e interagiscono con il dominio KASH delle Nesprins. Le isoforme canoniche di Nesprin hanno un N-terminale di dimensioni variabili che si proietta nel citoplasma e interagisce con i componenti del citoscheletro. Questo protocollo descrive la validazione di una strategia di topo transgenico dominante-negativo che interrompe le interazioni endogene SUN/KASH in modo specifico per tipo di cellula. Il nostro approccio si basa sul sistema Cre/Lox che bypassa molti inconvenienti come la letalità perinatale e i fenotipi cellulari non autonomi che sono associati ai modelli germinali di inattivazione del complesso LINC. Per questo motivo, questo modello fornisce uno strumento utile per comprendere il ruolo dei complessi LINC durante lo sviluppo e l'omeostasi in una vasta gamma di tessuti.
Introduzione
L'involucro nucleare (NE) separa nucleoplasma dal citoplasma. Esso è composto da una membrana nucleare interna ed esterna (INM e ONM, rispettivamente) che collegano a pori nucleari. Il lume delineato da due membrane si chiama lo spazio perinucleare (PNS). Il ONM è un'estensione del reticolo endoplasmatico rugoso (ER) e l'INM aderisce alla lamina nucleare, un reticolo di nucleare tipo V filamenti intermedi rappresentato da A e B lamine di tipo 1,2. Linker del nucleoscheletro e citoscheletro (LINC) sono complessi macromolecolari assemblee che attraversano l'intero involucro nucleare collegare fisicamente l'interno del nucleo di filamenti ....
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Protocollo
Etica Dichiarazione: procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato istituzionale animali (IACUC) presso la Washington University di St. Louis.
1. Allevamento Mouse e genotipizzazione
- Breed Tg (CAG-LacZ / EGFP-KASH2) topi con Tg (PCP2-Cre) per produrre topi Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) 19,20. Nota: Mentre il resto di questo protocollo concentra sull'uso della linea Tg (PCP2-Cre) topo per restringere espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje nel cervelletto, una procedura simile può essere seguita con qualsiasi altra Tg (Cre) mouse ( Figura....
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Risultati
Questo protocollo illustra l'utilità del (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello di topo Tg di limitare l'espressione EGFP-KASH2 alle cellule di Purkinje cerebellari utilizzando Tg (PCP2-Cre) topi. Nel Tg (PCP2Cre CAG-EGFP / KASH2) prole, la griglia di lettura aperta LacZ / V5 è asportato in P6 dalla ricombinasi Cre determinando così l'espressione di EGFP-KASH2 specificamente mirato al Purkinje cellule (Figura 2A). Come previsto, EGFP-KASH2 è rivolto a membrana nucleare come indicato dal .......
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Discussione
La fase più critica per studiare con successo il ruolo di complessi LINC in vivo utilizzando la (/ EGFP-KASH2 CAG-LacZ) modello Tg è quello di individuare una linea di topi Cre adatto (s). Infatti, se Cre è attiva in altri tipi di cellule coinvolte in percorsi simili, può complicare l'interpretazione dei risultati. Quindi, è importante esaminare cellule vicine, come mostrato qui negli strati cellulari e molecolari granuli del cervelletto (Figura 2B). Analogamente, per massimizzare eventuali.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il personale del nucleo Morfologia e Imaging, del nucleo Genetica Molecolare (Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive) e del mouse Genetica Nucleo presso la Washington University di St. Louis School of Medicine. Gli autori sono supportati dal piccolo programma di sovvenzioni dal Centro McDonnell per Cellulare e Neurobiologia Molecolare, il Centro Speranza per disordini neurologici, il National Eye Institute (# R01EY022632 a DH), un Istituto Nazionale di Eye Centro Nucleo Grant (# P30EY002687) e un sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Saccarosio | Sigma Aldrich | S0389 | |
| 10x PBS | Gibco | 14200-075 | |
| 16% Paraformaldeide Soluzione | Microscopia Elettronica Scienze | 15710 | |
| OCT Composto | Tissue-Tek | 4583 | |
| Vetrini di adesione | StatLab | M1000W | |
| Siero d'asino | Sigma Aldrich | D9663 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| ImmuEdge Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Anticorpo anti-Calbindina | Sigma Aldrich | C9848 | |
| Anticorpo anti-EGFP | Abcam | ab13970 | |
| Anticorpo | Precedentemente descritto in Ref. 21 | ||
| Montaggio fluorescente Media | Dako | S3023 | |
| 2-metilbutano | Sigma Aldrich | O3551 |
Riferimenti
- Hutchison, C. J. Lamins: building blocks or regulators of gene expression? Nature reviews. Molecular cell biology. 3, 848-858 (2002).
- Stuurman, N., Heins, S., Aebi, U. Nuclear lamins: their structure, assembly, and interactions. Journal of s....
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Ristampe e permessi
