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Articolo metodologico

Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice

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DOI:

10.3791/53319

⸱

1 novembre 2015

 , 
1Division of Immunobiology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center and University of Cincinnati College of Medicine

In questo articolo

Sommario

Il trasferimento di linfociti bm12 in un ricevente C57BL/6 è un modello consolidato di lupus eritematoso sistemico. Qui descriviamo come iniziare la malattia utilizzando questo modello e come caratterizzare le cellule T follicolari helper, le cellule B del centro germinale e le plasmacellule mediante citometria a flusso.

Abstract

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune con diverse manifestazioni cliniche e immunologiche. Diversi modelli animali spontanei e inducibili rispecchiano componenti comuni della malattia umana, incluso il modello di trasferimento bm12. Dopo il trasferimento di splenociti bm12 o cellule T CD4 purificate, i topi C57BL/6 sviluppano rapidamente grandi frequenze di cellule T helper follicolari (Tfh), cellule B del centro germinale (GC) e plasmacellule seguite da alti livelli di anticorpi anti-nucleo circolanti. Poiché questo modello utilizza topi su un background C57BL/6 puro, i ricercatori possono studiare rapidamente e facilmente la progressione della malattia in ceppi di topi transgenici o knockout in un periodo di tempo relativamente breve. Qui descriviamo i protocolli per l'induzione del modello e la quantificazione di Tfh, cellule GC B e plasmacellule mediante citometria a flusso multicolore. È importante sottolineare che questi protocolli possono essere utilizzati anche per caratterizzare la malattia nella maggior parte dei modelli murini di LES e identificare le cellule Tfh, GC B e plasmacellule in altri modelli di malattia.

Introduzione

Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune complessa caratterizzata prototipicamente da anticorpi anti-nucleo (ANA) la produzione e la glomerulonefrite. Numerose altre sequele, tra cui dermico, cardio-polmonare e lesioni epatiche sono associati con la malattia in alcuni individui. Le stime sulla prevalenza negli Stati Uniti variano ampiamente, da 150,000-1,500,000 1,2, con incidenza particolarmente elevata nelle donne e le minoranze 3. Sebbene l'eziologia del LES è stato difficile da discernere, si pensa a sorgere dall'interazione di diversi fattori genetici e ambientali, che culminano in autoimmunità sistemica.

Numerosi modelli animali sono stati impiegati per studiare i fattori di insorgenza della malattia e la progressione. Modelli classici murini di SLE includono ceppi di topi geneticamente predisposti, tra cui il modello di X NZB NZW F1 e suoi derivati ​​di potenza NZM, il ceppo / lpr MLR, e il ceppo BXSB / Yaa, e sistemi inducibili, come il pristane e malattia cronica del trapianto contro l'ospite (GVHD cronica) modelli 4. I primi rapporti di produzione di autoanticorpi nei modelli GVHD usati diversi ceppi di topi o ceppi criceto per genitore in trasferimenti F1 5 - 8; metodi più comuni utilizzati per studiare le malattie simil-lupus attualmente includono il genitore DBA / 2 → (C57BL / 6 x DBA / 2) F1, ed il modello di trasferimento BM12 descritto qui. Ogni modello ha i suoi avvertimenti, ma in genere condividono un set comune di funzioni che sono correlate alle caratteristiche cliniche della malattia umana. I parametri più spesso segnalati in modelli murini includono splenomegalia, linfoadenopatia, nefrite, la produzione ANA, e a livello cellulare, l'espansione delle cellule T helper follicolari (TFH), le cellule B germinali centro (GC), e le cellule del plasma.

Il modello BM12 inducibile si ottiene il trasferimento adottivo di linfociti da IA BM12 B6 (C) - H2 - Ab1 BM12 / KhEgJ (BM12) topo, un ceppo identical a C57BL / 6 ad eccezione di 3 aminoacidi sostituzioni su MHC di classe II, in IA b C57BL / 6 (B6) topi. Alloactivation di donatori cellule T CD4 di destinatario APC porta a cGVHD con sintomi molto simili LES. In particolare, questi includono l'espansione di Tfh donatore-derivati, espansione delle cellule B GC destinatario di derivazione e plasmacellule, e la produzione di ANA tra cui anti-dsDNA, anti-ssDNA, anti-cromatina, e gli anticorpi anti-RBC 9. Nel corso del tempo, topi riceventi sviluppano glomerulonefrite associata a depositi di IgG nel glomerulare, interstiziale e regioni vascolari dei reni 10. Abbiamo recentemente dimostrato che, simile alla malattia umana, c'è anche un ruolo critico per tipo IFN in questo modello 11. In particolare, i criteri di definizione per il LES umano includono lo sviluppo di nefrite compatibile con SLE ​​in presenza di anticorpi anti-dsDNA anticorpi 12, entrambi i quali sono caratteristiche importanti di questo modello di topo.

Ci sono sevantaggi Veral del modello BM12 rispetto ai modelli spontanee. Modelli classici che sviluppano segni SLE-come spontaneamente si basano su entrambi i ceppi di topi ibridi, ceppi inbred di topo non sullo sfondo B6, o grande loci genetici sullo sfondo B6, che rendono attraversando a knockout o topi geneticamente modificati altrimenti difficile e richiede tempo. Con il modello inducibile BM12, topi geneticamente modificati possono servire sia come donatore o ricevente, consentendo più rapida identificazione del compartimento cellulare in cui alcuni geni possono essere importanti per la malattia. Inoltre, lo sviluppo della malattia nel modello BM12 è molto più veloce, che richiede solo 2 settimane fino alla comparsa di ANA, rispetto a diversi mesi per i modelli più spontanee. Inoltre, a differenza dei modelli spontanei che sviluppano la malattia in diversi momenti, l'insorgenza e la progressione della malattia nel modello B6 BM12 → è altamente sincronizzati. Questo permette la generazione di coorti di dimensioni appropriate che possono Be utilizzato per strategie di intervento o terapeutici in qualsiasi fase della sviluppo della malattia.

Quello che segue è un protocollo dettagliato per l'avvio SLE-come autoimmunità dal trasferimento adottivo di linfociti BM12 in topi C57BL / 6, o varianti genetiche sullo sfondo B6. Inoltre, si descrive un protocollo di colorazione citometria a flusso per l'enumerazione Tfh, cellule GC B, e tipi di cellule del plasma-cella associata con la malattia umana. È importante sottolineare che questi protocolli possono anche essere utilizzati per caratterizzare la malattia nella maggior parte dei modelli murini di LES e identificare Tfh, cellule GC B le plasmacellule in altri modelli di malattia.

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Protocollo

Lavoro animale è stato eseguito in condizioni di assenza di patogeni specifici in conformità con le linee guida definite dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International e la cura degli animali e del Comitato uso istituzionale (IACUC).

NOTA: Incorporare topi che esprimono un marcatore congenic quali CD45.1 su entrambi donatore o animali destinatari, se possibile, perché questo consente il monitoraggio dell'efficienza del trapianto donatore e specifica l'espansione della popolazione di cellule CD4 T del donatore. Se si considera l'uso di topi altrimenti geneticamente modificati come donatore o destinatari, garantire il ceppo sia correttamente backcrossed allo sfondo B6, o cellule trasferite può essere respinta, questo verrà affrontato in modo più approfondito nei risultati rappresentativi e le sezioni di discussione.

NOTA: Le seguenti procedure volumi di dettaglio per la raccolta 4 donatori BM12 topi, che dovrebbe produrre abbastanza cellule per iniettare 12-16 topi. Seia dodici topi BM12 settimana-vecchio cedere circa 100-140,000,000 linfociti con circa 25% di cellule T CD4. Se inizia con un diverso numero di topi, o differenti ceppi di topi, i volumi di scala su o in giù di conseguenza. C57BL / 6 topi generalmente danno rese simili con più vicino al 20% solo cellule T CD4.

NOTA: Eseguire tutte le misure a temperatura ambiente e utilizzare mezzi RT per evitare caldo e il freddo di shock, che può mettere in pericolo la vitalità dei linfociti-lungo termine. Eseguire il tessuto-raccolta e fasi di lavorazione dei tessuti, in una cappa di coltura utilizzando la tecnica asettica. Tutti i media in questo protocollo è IMDM con il 10% inattivato al calore FBS, salvo diversa indicazione, e sarà denominato semplicemente come "media completi."

1. nuovo metodo per la genotipizzazione BM12 Mice

NOTA: Un protocollo breve restrizione basata-digest per la genotipizzazione è fornito qui, come un semplice e poco costoso alternativa al sequenziamento, che è attualmente l'unico metodo di genotipizzazione pubblicatoper questi topi.

  1. Isolare DNA genomico da code di topo. Si prega di fare riferimento a un articolo precedente JOVE per protocolli dettagliati sulla coda di topo ritaglio e la generazione di cDNA da coda digerisce 13.
  2. Eseguire una reazione a catena polimerizzato inversa transcriptasi (PCR) 14 per amplificare un frammento di DNA 474 bp comune da MHC-II b IA e IA BM12 con primer e condizioni termocicli elencati nella tabella 1.
  3. Eseguire restrizione digerire il ~ 7 ml di prodotto PCR utilizzando l'enzima PsuI, o uno dei suoi isoschizomers (BstX2I, BstYI, MflI o XhoII), che taglia tipo selvaggio IA b, ma non IA BM12 mutante. Seguire digerire protocollo fornito dal produttore, che specifica una miscela di acqua, tampone e l'enzima, ed una incubazione di 5 min. a diverse ore a 37 ° C 15.
  4. Caricare digerire prodotto ed eseguito su 1% gel di poliacrilamide con bromuro di etidio 14 per 30-45 minuti. a 150V, anche se le impostazioni di tensione e di tempo ottimali variano a seconda dell'apparato gel di PCR utilizzato. Visualizzare le bande di DNA con un illuminatore UV. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1. Rappresentante BM12 risultati genotipizzazione.
Per identificare i topi omozigoti per IA BM12 / BM12, il DNA coda è stato proiettato per BM12 mediante PCR / restrizione digerire genotipizzazione (Fase 1). Wild type omozigoti (IA b / b) del DNA produce due bande a 227 e 247 bp (visualizzato come una band di spessore a ~ 250 bp); BM12 omozigote (IA BM12 / BM12) rese di DNA una banda a 474 bp; e eterozigote (IA BM12 / b) del DNA produce due bande a ~ 250 e 474 bp. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Raccolta dei donatoriCellule

  1. Topi sacrificio donatore utilizzando Istituzionale Animal Care and Use Committee (IACUC) -approvato metodi eutanasia primarie e secondarie. Ad esempio, l'eutanasia topi di asfissia con CO 2 seguita da dislocazione cervicale.
  2. Utilizzando una tecnica asettica, milza e linfonodi raccolta (cervicale superficiale, mandibolare, brachiale, ascellari, mesenterica, e inguinali) in 15 ml provette contenenti 10 ml completo dei media come a 11-13.
    NOTA: Fare riferimento alle relazioni precedenti per linfatici dettagliata protocolli nodo dissezione 16 - 18. Questo modello è anche successo utilizzando solo splenociti di topo per il trasferimento, ma l'aggiunta di linfonodi riduce significativamente il numero di topi donatori.
  3. Generare una cella singola sospensione da schiacciare tessuti linfoidi raccolti nel passaggio 2.2 attraverso 70 micron filtri celle, utilizzando il pistone da una siringa. Per i rendimenti migliori, non sovraccaricare filtri uso ~ 6 filtri per ogni 4topi trattati, e sciacquare filtri di frequente durante l'elaborazione. Combina tessuti da 4 topi in due 50 ml provette coniche, quindi le cellule centrifugare per 5 minuti a 400 xg e decantare il surnatante.
  4. Risospendere le cellule provenienti da entrambe le provette coniche in 50 ml di mezzi completi e di trasferimento di nuove tubo conico. Tenere questo tubo a temperatura ambiente.
    NOTA: Fat aderisce ai lati del tubo, e se il tubo non viene sostituito, le rese finali cellulari può soffrire.

3. donatore di cellule Conteggio

NOTA: Per conservare la massima redditività, globuli rossi (RBC) lisi dell'intero campione non è raccomandato.

  1. Mescolare sospensione singola cellula dal punto 2.4 bene, togliere 1 ml e trasferirla a parte conica da 50 ml. Mettere da parte residua, le cellule intatte (49 ml) a temperatura ambiente, mentre il conteggio.
  2. Aggiungere 3 ml di un tampone di lisi dei globuli rossi a base di cloruro di ammonio al campione cellulare 1 ml donatore. Mescolare delicatamente per 1 min. da dondolo, poi riempire a 50 ml con supporto completo, unnd centrifugare per 5 min. a 400 xg e decantare il surnatante.
  3. Risospendere le cellule RBC lisati in 10 ml di mezzi completi e di conteggio (ad esempio, con il blu trypan con un emocitometro). Risultato Moltiplicare per 49: questo è il numero totale di cellule rimanenti nel campione non lisato che è stato allocato. Ignora celle RBC-lisi.

4. donatore di cellule Etichettatura e / o CD4 T purificazione cellulare

  1. Se lo si desidera, purificare cellule CD4 T in questa fase, anche se questo non è necessario. Inoltre, se desiderato, le cellule di etichette con CFSE, come in 19, o altri coloranti inseguimento cellulare, di cui un esempio è mostrato in Figura 4 della sezione risultati rappresentativi.
    NOTA: Per la purificazione delle cellule CD4 T, selezione magnetico negativo è consigliata, in quanto si può ottenere un'elevata purezza e lascia intatte le cellule con elevata redditività come descritto in 20. E 'importante che vengano utilizzati i buffer libero di endotossine; Pertanto, invece di BSA, effettuare la separazione del buffer di spiritoh 2% FBS e la concentrazione raccomandata di EDTA.

5. L'iniezione di donatori Cellule BM12

  1. Dopo aver contato linfociti del donatore al punto 3 (e purificato o etichettato come al punto 4, come desiderato), le cellule centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Decantare le cellule surnatante e risospendere in PBS a 120 milioni di linfociti per ml (o 30 milioni purificati cellule T CD4 per ml). Trasferire le cellule in una sterile 5 ml di tubo a fondo tondo, o altro tubo sterile che accomoda facilmente una siringa da 1 ml, munito di 27,5 G x 13 mm ago.
  2. Prima dell'iniezione mettere da parte un piccolo campione di cellule del donatore dal punto 5.1 a 4 ° C per il flusso di colorazione per determinare la percentuale di cellule T CD4 all'interno campioni dei donatori. Stain questi campioni come descritto al punto 8 utilizzando il pannello di anticorpi minima (Tabella 2).
    NOTA: Se le cellule provenienti da diversi ceppi di topi sono usati come donatori separati, questa è una considerazione importante, e se le percentuali di cellule T CD4 variano sostanzialmente, purflussi, la verifica può essere richiesto.
  3. Mescolare delicatamente le cellule, ma accuratamente. Questo può essere fatto cellule pipettando su e giù con una siringa da 1 ml senza ago. Dopo la miscelazione, disegnare le cellule nella siringa da 1 ml. Attaccare l'ago dopo aver rimosso eventuali bolle d'aria. Tenendo l'ago fuori mentre l'innesco della siringa aiuta a mantenere la vitalità cellulare.
  4. Iniettare 250 ml per topo (che è pari a 30 milioni di linfociti, o 7,5 milioni purificati cellule CD4 T per topo) intraperitoneale, come descritto in 21.
    NOTA: Negli esperimenti mostrati qui e nel nostro lavoro, prima 11, ogni mouse viene iniettato con 30 milioni di linfociti totali dai BM12 donatori, piuttosto che i 100 milioni di splenociti totali tradizionalmente utilizzati. In dati non pubblicati dal nostro laboratorio, nessuna differenza è stata osservata nel siero anti-dsDNA al giorno 14 dopo iniezioni di 30 o 100 milioni di linfociti per mouse. Mentre questo riduce significativamente il numero di topi necessari per gli esperimenti, lo sviluppo di nefrite ingegnoh non è stato valutato il numero di cellule.

6. Determinare innesto Efficienza

NOTA 1: Questa sezione descrive come determinare il grado di innesto delle cellule del donatore nel ricevente a giorno 3, al fine di individuare eventuali topi che potevano aver ricevuto iniezioni non ottimali (ad esempio, l'innesto di un mouse è <10% di quello visto in tutti gli altri topi dello stesso gruppo). Questi dati possono anche aiutare a determinare se le cellule di un ceppo di topi geneticamente modificati vengono respinti in momenti successivi (per i dettagli, vedere la sezione risultati rappresentativi, figura 6).

NOTA 2: In questa sezione è possibile solo se i donatori ei riceventi sono da topi su sfondi diversi congenici, ad esempio, quando si utilizzano i donatori CD45.1 BM12 e CD45.2 C57BL / 6 destinatari, o quando le cellule del donatore sono etichettati con un colorante cellulare di monitoraggio. È importante sottolineare che, a 3 giorni dopo l'iniezione, cellule T CD4 hanno subito espansione minimo (see rappresentativo risultati, figura 4), ​​per cui le differenze osservate nel grado di innesto sono dovute alla variabilità in iniezioni, non espansione.

  1. Anestetizzare topi con il 4% isoflurano o altro metodo IACUC approvato. Metti alla prova i riflessi del piede posteriore per assicurare il mouse sia correttamente anestetizzati prima di procedere al prelievo del sangue.
  2. Harvest sangue 100-200 microlitri utilizzando un metodo di IACUC approvato, come la retro-orbitale foratura come nel 22. Prelevare il sangue in singole da 0,5 ml microprovette contenenti un anticoagulante, come ad esempio i tubi di raccolta del plasma fa riferimento la tabella materiali, che contengono dipotassio liofilizzato EDTA. Dopo la raccolta del sangue, applicare una leggera pressione per l'occhio del mouse con un asciugamano sterile o una garza per garantire le fermate sanguinamento, quindi posizionare il mouse avanti nella sua gabbia casa dove rimarrà fino alla mietitura del tessuto finale (punto 7).
    NOTA: Non lasciare incustoditi i topi fino a quando i topi hanno riacquistato coscienza sufficiente permantenere decubito ventrale, e non vi ritornano topi per la compagnia degli altri fino alla completa guarigione.
  3. Portare il volume del sangue di 500 ml con 21 ° C PBS e trasferimento in provetta a fondo conico, poi lentamente underlay 200 ml di 21 ° C soluzione separazione delle cellule ad alta densità con una microlitri pipetta 200, facendo attenzione a ridurre al minimo la miscelazione tra le due fasi ( vedi Materiali Tavolo per soluzioni consigliate). Cellule centrifugare a 700 xg per 20 minuti a 20-25 ° C con freno centrifuga impostato su basso.
  4. Rimuovere strato superiore contenente linfociti con una pipetta 1 ml e trasferimento in una nuova provetta contenente 800 ml supporto completo freddo. Vortice delicatamente per mescolare le cellule. Cellule centrifugare a 700 xg per 5 minuti a 4 ° C e decantare il surnatante.
  5. Risospendere le cellule in 200 l di media completo, trasferimento ad una piastra a 96 pozzetti U-basso, e macchia per citometria a flusso, come descritto al punto 8 utilizzando un pannello di anticorpi minima (Tabella 2) per determinare tha abbondanza relativa del trapianto di cellule CD4 T come percentuale di PBMC.

7. Tessuto Finale Harvest

NOTA: Gli esperimenti descritti nella sezione dei risultati è stato raccolto 14 giorni dopo l'iniezione di cellule del donatore (o in alcuni casi meno tempo), in quanto si concentrano sullo sviluppo iniziale di cellule tfh e plasmacellule; tuttavia, dal momento che questo modello è un modello GVHD cronica del LES, la malattia può essere monitorato in più punti secondo momento. La tempistica ottimale dipenderà dalla domanda di ricerca posta in ciascun esperimento.

  1. In un punto tempo predeterminato dopo l'iniezione di cellule del donatore BM12 (passo 5.4), sacrificare i topi utilizzando un metodo IACUC approvato dell'eutanasia. Si raccomanda Asfissia di CO 2 seguito da dissanguamento. Dislocazione cervicale può funzionare come un metodo secondario dell'eutanasia, ma ciò può ridurre la resa prelievo di sangue.
  2. Bagnare l'addome del mouse leggermente con un flacone spray contenente il 70%etanolo. Fai una piccola incisione superficiale con le forbici chirurgiche circa 1 cm sopra i genitali. Arretrare la pelle dell'addome verso lo sterno, facendo attenzione a mantenere intatta la fascia peritoneale.
    NOTA: i topi malate di solito presentano con 0,5-3 ml ascite a giorno 14, che, pur non è ancora stato ben caratterizzato, può essere misurato e analizzato come parametro malattia aggiuntivo.
  3. Montare una siringa da 5 ml con un ago da 18 G. Inserire l'ago nel quadrante inferiore destro dell'addome con l'ago diretto alto verso la testa dell'animale e di 15 ° angolo rispetto al piano della fascia. Posizionare la punta dell'ago vicino al cieco per aiutare a prevenire l'ago si intasi con intestino mentre aspirazione ascite.
  4. Ruotare delicatamente il mouse su un lato, quindi disegnare lentamente ascite nella siringa. Una volta ascite è stato recuperato, rimuovere la siringa e registrare il volume aspirato, sulla base dei segni volumetrici sul lato del syriESN.
  5. Ascite scarico in un 5 ml tubo a fondo rotondo e conservare in ghiaccio per la successiva elaborazione.
  6. Sangue raccolto tramite sorteggio dalla vena cava inferiore (IVC) essenzialmente come nel 22. Utilizzando pinze spenti, spostare delicatamente intestini per il lato sinistro del mouse, scoprendo la IVC. Inserire un ago 27.5 G montato su una siringa da 1 ml nella IVC e lentamente disegnare 400-500 ml di sangue.
  7. Per ridurre al minimo l'emolisi, iniettare lentamente il sangue in una provetta da microcentrifuga 0,5 ml di siero o di raccolta del plasma. Per la successiva analisi del siero di ANA con ELISA, mantenere il sangue in ghiaccio.
  8. Sezionare ed ottenere tessuti importanti supplementare (milza e, se lo si desidera, linfonodi e reni, in particolare se la raccolta in successivi momenti e glomerulonefrite saranno segnati). Rimuovere milza posizionando i intestino indietro verso il lato destro dell'animale, e tirando il pancreas, che è primario tessuto connettivo della milza.
  9. Rimuovere qualsiasi residuo del pancreas, poi pesaremilza su una bilancia ad alta precisione subito dopo la dissezione, come splenomegalia lordo è un parametro comunemente riportato in modelli murini di LES. Posizionare tessuti linfoidi in singoli 1,5 ml tubi riempiti di 1 ml multimediale completa su ghiaccio. Fissare reni nel 10% formalina tamponata neutra o scattare congelare reni per istologia poi come nel 23.
  10. Sangue centrifuga in 2 ore di raccolta per 3 min. a 10.000 xg (4 ° C). Rimuovere siero e conservare a -80 ° C per una successiva analisi di ANA con ELISA. Fare riferimento alle precedenti relazioni di dettagliati protocolli ANA ELISA 24,25. Siero Conservare in più 10-20 aliquote microlitri per ridurre al minimo i cicli di gelo / disgelo, e consentire un maggior numero di test futuri.
  11. Centrifuga ascite 400 xg per 5 minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta 1 ml e aliquota in più 0,5 ml tubi. Congelare il surnatante a -80 ° C per le successive analisi di anticorpi anti-nucleo (ANA) o di altri mediatori infiammatori solubili.
  12. Fract cellulare Risospendere ione in circa 1 ml mezzi completi e trasferire 200 ul di una piastra a 96 pozzetti U-bottom per il flusso colorazione (come nel passaggio 8).
  13. Mash ogni milza attraverso 70 micron filtri cellulari in tubi separati e risciacquare con supporto completo. Risospendere splenociti con 1 ml freddo tampone di lisi RBC per 1 min. e mescolare delicatamente a dondolo. Portare il volume a 10 ml con supporto completo a freddo e centrifugare per 5 minuti a 400 xg e decantare il surnatante.
  14. Pellet cellulare risospendere in 5 ml e multimediale completa contare con un emocitometro. Regolare il volume in modo che 200 ml di completo supporto contiene 1-3 milioni di cellule. Inizia colorazione per citometria a flusso (Passo 8) utilizzando un pannello esteso (Tabella 2) per quantificare donatore CD4 delle cellule T e B destinatario differenziazione cellulare e di espansione.
    NOTA: A seconda cosa laser, combinazioni di tubi fotomoltiplicatori (PMT), e set di filtri sono disponibili, separando il pannello analisi delle cellule T e B in più pannelli può essere necessario.
ve_title "> 8. flusso colorazione

  1. Trasferimento 1-3 milioni di splenociti in 200 microlitri mezzi completo in singole provette da 5 ml a fondo tondo, o nei pozzetti separati di una piastra a 96 pozzetti U-basso.
    NOTA: l'utilizzo di una piastra a 96 pozzetti è un modo efficace per colorare più campioni, ma fate attenzione alla piastra di campioni in ogni altro bene al fine di prevenire la contaminazione incrociata. Una piastra a 96 pozzetti può quindi contenere 24 campioni.
  2. Piatto di centrifuga a 500 xg per 3 min., Poi surnatante punizione dal piatto in appropriata (rischio biologico) contenitore.
  3. Risospendere il pellet di cellule con 100 ml di buffer di flusso (1% FBS in PBS) contenente un colorante vitalità fissabile alla concentrazione raccomandata dal costruttore e purificato anti-CD16 / anti-CD32 anticorpo cocktail al 1 mg / ml. Incubare per 10 minuti a 20-25 ° C, quindi aggiungere 100 microlitri mezzi completi a freddo per placare la vitalità tintura.
    NOTA: Splenociti da topi malati di solito contengono relativamente elevato numero di cellule morte o morenti;Pertanto, l'inclusione di un colorante viabilità si raccomanda di evitare l'etichettatura degli anticorpi non specifico di cellule morte, con conseguente più pulite, dati più affidabili. Allo stesso modo, il cocktail anti-CD16 / anti-CD32 è incluso per bloccare i recettori Fc legame da non specifico degli anticorpi fluorescenza marcata.
  4. Piatto di centrifuga a 500 xg per 3 min., Poi surnatante punizione dal piatto nel contenitore a rischio biologico. Risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer di flusso. Piatto di centrifuga a 500 xg per 3 min., Poi surnatante punizione dal piatto nel contenitore a rischio biologico.
  5. Risospendere le cellule in 50 microlitri di buffer flusso contenente anticorpi cocktail (Tabella 2). Incubare per 20 minuti a 4 ° C, quindi aggiungere 150 microlitri tampone flusso. Ripetere il lavaggio punto 8.4.
  6. Risospendere le cellule con 100 microlitri 2% paraformaldeide in PBS. Incubare per 30 minuti a 4 ° C, quindi aggiungere 100 microlitri tampone flusso. Piatto di centrifuga a 500 xg per 3 min., Poi surnatante punizione dal piatto nel contenitore a rischio biologico.
  7. Resuspend in 200 microlitri di buffer di flusso, il trasferimento a scorrere inserti tubo o tubi di flusso standard, aggiungere un buffer flusso di 100-200 ml aggiuntivo, e conservare a 4 ° C al buio fino a quando l'acquisizione sul citofluorimetro.
  8. Acquisire su un citofluorimetro equipaggiato con laser e PMT appropriati per i pannelli di anticorpi scelti entro alcuni giorni di colorazione. Record larghezza scatter in avanti e / o l'altezza, oltre a trasmettere zona dispersione, zona side scatter, e la zona dei parametri fluorescenti utilizzati. Per ottenere risultati affidabili, acquisire ≥1,000 le cellule del donatore in ciascun campione WT o un numero equivalente di linfociti totali in topi manipolati geneticamente modificati o di altra natura che mostrano minima espansione delle cellule del donatore, in cui la raccolta di tanti eventi potrebbe non essere fattibile.
    NOTA: analisi di citometria a flusso sono descritti in dettaglio nella sezione risultati rappresentativi (figure 3 - 6).

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Risultati

Topi malati sviluppano splenomegalia in appena 14 giorni, esibendo milza 2-3 volte le dimensioni di topi sani in termini di massa e cellularità (Figura 2).

Splenociti sono sequenzialmente gate sulla dispersione della luce (FSC-A da SSC-A), l'eliminazione di doppiette (FSC-W o -H da FSC-A), cellule vitali (basso colorazione della vitalità tintura) e CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Cellule del donatore si distinguono dalle cellule riceventi...

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Discussione

Il modello inducibile BM12 è un modo relativamente semplice ed efficace per studiare i processi cellulari e molecolari del LES. Attivazione cronica di adoptively trasferiti cellule T CD4 diretti contro antigeni auto porta all'accumulo di Tfh, cellule GC B, e le plasmacellule che può essere misurato mediante citometria di flusso, come descritto qui. Futuri studi che utilizzano questo modello può interrogare rapidamente e facilmente il ruolo dei geni candidati e nuove terapie nei processi centro germinale autoimmuni c...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Lupus Research Institute, dalla sovvenzione NCI CA138617, dalla sovvenzione NIDDK DK090978, dal Charlotte Schmidlapp Award (a E.M.J.) e dalla Albert J. Ryan Fellowship (a J.K.). Siamo grati per il supporto e la strumentazione forniti dal Research Flow Cytometry Core nella Divisione di Reumatologia del Cincinnati Children's Hospital Medical Center, supportato in parte da NIH AR-47363, NIH DK78392 e NIH DK90971.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJThe Jackson Laboratory001162CD45.1+ BoyJ ceppo di topo
B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJThe Jackson Laboratory001162Ceppo di topo Bm12
FastDigest PsuILife TechnologiesFD1554Enzima digest di restrizione per la genotipizzazione
1X RBC Lysis BuffereBioscience00-4333-57
IMDMGE HealthcareSH30228.01
Provetta per la separazione del plasma (PST)BD365974Provetta per la raccolta del sangue con EDTA dipotassico
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inserti per provette FACS da 1,2 ml, travasatoUSA Scientific1412-1400
BD Falcon™ Tubi a fondo tondoBD352017

Riferimenti

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