Il trasferimento di linfociti bm12 in un ricevente C57BL/6 è un modello consolidato di lupus eritematoso sistemico. Qui descriviamo come iniziare la malattia utilizzando questo modello e come caratterizzare le cellule T follicolari helper, le cellule B del centro germinale e le plasmacellule mediante citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Il BM12 inducibile modello di Lupus Eritematoso Sistemico (LES) in C57BL / 6 Mice
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune con diverse manifestazioni cliniche e immunologiche. Diversi modelli animali spontanei e inducibili rispecchiano componenti comuni della malattia umana, incluso il modello di trasferimento bm12. Dopo il trasferimento di splenociti bm12 o cellule T CD4 purificate, i topi C57BL/6 sviluppano rapidamente grandi frequenze di cellule T helper follicolari (Tfh), cellule B del centro germinale (GC) e plasmacellule seguite da alti livelli di anticorpi anti-nucleo circolanti. Poiché questo modello utilizza topi su un background C57BL/6 puro, i ricercatori possono studiare rapidamente e facilmente la progressione della malattia in ceppi di topi transgenici o knockout in un periodo di tempo relativamente breve. Qui descriviamo i protocolli per l'induzione del modello e la quantificazione di Tfh, cellule GC B e plasmacellule mediante citometria a flusso multicolore. È importante sottolineare che questi protocolli possono essere utilizzati anche per caratterizzare la malattia nella maggior parte dei modelli murini di LES e identificare le cellule Tfh, GC B e plasmacellule in altri modelli di malattia.
Introduzione
Il lupus eritematoso sistemico (LES) è una malattia autoimmune complessa caratterizzata prototipicamente da anticorpi anti-nucleo (ANA) la produzione e la glomerulonefrite. Numerose altre sequele, tra cui dermico, cardio-polmonare e lesioni epatiche sono associati con la malattia in alcuni individui. Le stime sulla prevalenza negli Stati Uniti variano ampiamente, da 150,000-1,500,000 1,2, con incidenza particolarmente elevata nelle donne e le minoranze 3. Sebbene l'eziologia del LES è stato difficile da discernere, si pensa a sorgere dall'interazione di diversi fattori genetici e ambientali, che culminano in autoimmunità sistemica.
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Protocollo
Lavoro animale è stato eseguito in condizioni di assenza di patogeni specifici in conformità con le linee guida definite dalla Associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International e la cura degli animali e del Comitato uso istituzionale (IACUC).
NOTA: Incorporare topi che esprimono un marcatore congenic quali CD45.1 su entrambi donatore o animali destinatari, se possibile, perché questo consente il monitoraggio dell'efficienza del trapianto donatore e specifica l'espansione della popolazione di cellule CD4 T del donatore. Se si considera l'uso di topi altrimenti geneticamente modifica....
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Risultati
Topi malati sviluppano splenomegalia in appena 14 giorni, esibendo milza 2-3 volte le dimensioni di topi sani in termini di massa e cellularità (Figura 2).
Splenociti sono sequenzialmente gate sulla dispersione della luce (FSC-A da SSC-A), l'eliminazione di doppiette (FSC-W o -H da FSC-A), cellule vitali (basso colorazione della vitalità tintura) e CD4 + TCRβ + (Figura 3A). Cellule del donatore si distinguono dalle cellule riceventi.......
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Discussione
Il modello inducibile BM12 è un modo relativamente semplice ed efficace per studiare i processi cellulari e molecolari del LES. Attivazione cronica di adoptively trasferiti cellule T CD4 diretti contro antigeni auto porta all'accumulo di Tfh, cellule GC B, e le plasmacellule che può essere misurato mediante citometria di flusso, come descritto qui. Futuri studi che utilizzano questo modello può interrogare rapidamente e facilmente il ruolo dei geni candidati e nuove terapie nei processi centro germinale autoimmuni c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Lupus Research Institute, dalla sovvenzione NCI CA138617, dalla sovvenzione NIDDK DK090978, dal Charlotte Schmidlapp Award (a E.M.J.) e dalla Albert J. Ryan Fellowship (a J.K.). Siamo grati per il supporto e la strumentazione forniti dal Research Flow Cytometry Core nella Divisione di Reumatologia del Cincinnati Children's Hospital Medical Center, supportato in parte da NIH AR-47363, NIH DK78392 e NIH DK90971.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ | The Jackson Laboratory | 001162 | CD45.1+ BoyJ ceppo di topo |
| B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ | The Jackson Laboratory | 001162 | Ceppo di topo Bm12 |
| FastDigest PsuI | Life Technologies | FD1554 | Enzima digest di restrizione per la genotipizzazione |
| 1X RBC Lysis Buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| IMDM | GE Healthcare | SH30228.01 | |
| Provetta per la separazione del plasma (PST) | BD | 365974 | Provetta per la raccolta del sangue con EDTA dipotassico |
| Provetta per la separazione del siero (SST) | BD | 365967 | Provetta per la raccolta del sangue con attivatore del coagulo / SST Gel |
| Ficoll | GE Healthcare | 17-1440-02 | Soluzione di separazione cellulare ad alta densità |
| Lympholyte-M | Cedarlane | CL5030 | Soluzione di separazione cellulare ad alta densità |
| GL-7-biotina | eBioscience | 13-5902-82 | |
| Streptavidina-BUV395 | BD | 564176 | |
| CD138-BV421 | BioLegend | 142508 | |
| CD4-BV510 | BioLegend | 100559 | |
| TCRβ-BV605 | BD | 562840 | |
| CD45.1-BV711 | BioLegend | 110739 | |
| CD45.2-FITC | BioLegend | 109806 | |
| PD-1-PE | BioLegend | 135206 | |
| CD19-PerCP | BioLegend | 115532 | |
| Fas-PE-Cy7 | BD | 557653 | |
| CXCR5-APC | BioLegend | 145506 | |
| Colorante di vitalità fissabile ef780 | eBioscience | 65-0865-18 | |
| CD4-BV421 | BioLegend | 100443 | |
| inserti per provette FACS da 1,2 ml, travasato | USA Scientific | 1412-1400 | |
| BD Falcon™ Tubi a fondo tondo | BD | 352017 |
Riferimenti
- Helmick, C. G., Felson, D. T., et al. Part I. Arthritis Rheum. Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States. 58, 15-25 (2008).
- Lupus Foundation of America Web Site. , Available from: http://www.lupus.org/answers/entry/what-is-lupus (2015).
- Somers, E. C., Marder, W., e....
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Ristampe e permessi
