Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged neuroni dell&#39;ippocampo

María Calvo-Rodríguez; Carlos Villalobos; Lucía Nuñez

doi:10.3791/53330

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Articolo metodologico

Fluorescenza e bioluminescenza di subcellulare Ca

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DOI:

10.3791/53330

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1 dicembre 2015

María Calvo-Rodríguez¹ , Carlos Villalobos¹ , Lucía Nuñez²

¹Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, ²Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

In questo articolo

Sommario

Il rimodellamento intracellulare del Ca²⁺ nell'invecchiamento può contribuire all'eccitotossicità e al danno neuronale, processi mediati dal sovraccarico di Ca²⁺. Abbiamo mirato a studiare il rimodellamento del Ca²⁺ nel cervello che invecchia utilizzando l'imaging a fluorescenza e bioluminescenza del Ca²⁺ citosolico e mitocondriale in colture a lungo termine di neuroni ippocampali di ratto, un modello di invecchiamento neuronale.

Abstract

Suscettibilità alla morte cellulare dei neuroni associati alla neurodegenerazione e ischemia sono estremamente aumentata nel cervello invecchiato ma meccanismi responsabili sono mal noti. Eccitotossicità, un processo che si ritiene di contribuire al danno dei neuroni indotta da entrambe le ingiurie, è mediata da attivazione dei recettori del glutammato che promuove Ca ²⁺ afflusso e mitocondriale sovraccarico di Ca ^2+. Un cambiamento sostanziale intracellulare di Ca ²⁺ omeostasi o ristrutturazione di ^Ca2 + intracellulare omeostasi può favorire danno neuroni in vecchi neuroni. Per indagare Ca ²⁺ rimodellamento nell'invecchiamento abbiamo usato l'imaging cellulare dal vivo in colture a lungo termine di neuroni di ratto dell'ippocampo che assomigliano per alcuni aspetti neuroni in vivo di età. Per questo fine, cellule dell'ippocampo sono, in primo luogo, al momento disperso dalle nuove ippocampi di ratto nato e placcato su vetrini rivestiti, vetro poli-D-lisina. Poi culture sono tenuti in media controllati per diversi giorni o più weeks per indagare giovani e vecchi neuroni, rispettivamente. In secondo luogo, neuroni in coltura sono caricati con fura2 e sottoposti a misure di concentrazione citoplasmatica di Ca ²⁺ utilizzando digitale rapporto imaging di fluorescenza. In terzo luogo, neuroni in coltura sono trasfettate con plasmidi che esprimono un tandem di bassa affinità equorina e GFP mirata ai mitocondri. Dopo 24 ore, equorina all'interno delle cellule viene ricostituito con coelenterazine e neuroni sono sottoposti ad immagini bioluminescenza per il monitoraggio della concentrazione di ^Ca2 + mitocondriale. Questa procedura in tre fasi permette di monitorare citosolica e mitocondriale Ca ²⁺ risposte agli stimoli rilevanti come ad esempio l'agonista del recettore del glutammato NMDA e confronta se queste ed altre risposte sono influenzati da invecchiamento. Questa procedura può produrre nuove intuizioni su come l'invecchiamento influenza citosolica e mitocondriale risposte Ca ²⁺ agli stimoli selezionati, nonché la sperimentazione di farmaci selezionati volti a prevenire cella neuronemorte in malattie legate all'età.

Introduzione

Eccitotossicità è uno dei meccanismi più importanti che contribuiscono a danno neuronale e la morte cellulare in insulti neurologici quali ischemia, e in alcune malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer ^1. Questo tipo di neurotossicità è mediato principalmente da glutammato agisce su Ca ²⁺ -permeable, recettori ionotropici NMDA (NMDAR) ^2. L'esposizione di neuroni in coltura per il glutammato può portare a eccitotossicità ^3, che provoca l'apoptosi neuronale ^4. Noi e altri abbiamo già riferito che la vulnerabilità neuronale all'apoptosi NMDA indotta può cambiare con lo sviluppo in vitro<....