Strategie sperimentali per colmare grandi lacune tessuto nel midollo leso spinale dopo acuta e cronica Lesione

Sommario

Le gravi lesioni del midollo spinale spesso provocano difetti tissutali. Vengono descritte due possibilità per colmare con successo tali lacune per promuovere l'adattamento tissutale, le risposte rigenerative e il miglioramento funzionale nei ratti attraverso l'impianto di un sistema di microconnettori meccanici dopo una lesione acuta e cinque settimane dopo la completa transezione del midollo spinale.

Abstract

Dopo una lesione del midollo spinale (SCI) si forma una cicatrice nel nucleo della lesione che ostacola la rigenerazione assonale. Colmare il luogo della ferita dopo un insulto al midollo spinale, resezioni tumorali, o difetti del tessuto derivanti da incidenti traumatici possono aiutare a facilitare la riparazione dei tessuti in generale, così come la crescita di rigenerazione delle fibre nervose nella e oltre la zona interessata. Due strategie terapeutiche sperimentali sono presentati: (1) l'impianto di un nuovo dispositivo microconnettore in una toracico midollo spinale di ratto acutamente e completamente sezionato per riadattare reciso ceppi tessuto del midollo spinale, e (2) riempimento polietilenglicole del sito SIC nei ratti cronicamente lesionati dopo la resezione cicatrice. La lesione del midollo spinale cronica in questo modello è un transection del midollo spinale completo che è stato inflitto 5 settimane prima del trattamento. Entrambi i metodi hanno recentemente ottenuto risultati molto promettenti e promosso ricrescita assonale, benefica invasione cellulare e miglioramenti funzionaliin modelli di roditori di lesioni del midollo spinale.

Il sistema microconnettore meccanico (MMS) è un sistema multi-canale composto da polimetilmetacrilato (PMMA) con un sistema di tubo di uscita per applicare pressione negativa per l'MMS lume tirando così i monconi del midollo spinale nei fori a nido d'ape-strutturato. Dopo il suo impianto nella fessura tessuto 1 millimetro il tessuto viene aspirata nel dispositivo. Inoltre, le pareti interne delle MMS sono microstrutturata per una migliore aderenza dei tessuti.

Nel caso dell'approccio cronica lesioni del midollo spinale, midollo spinale tessuto - compresa la zona della lesione cicatriziale-riempita - viene resecato su una superficie di 4 mm di lunghezza. Dopo resezione cicatriziale microchirurgico la cavità risultante è riempita con polietilene glicole (PEG 600), che è stato trovato fornire un eccellente substrato per invasione cellulare, rivascolarizzazione, rigenerazione assonale e anche remyelination compatta in vivo.

Introduzione

Una lesione traumatica al midollo spinale porta non solo alla perdita di assoni ma ulteriori risultati in difetti del tessuto che impediscono tutte le risposte rigenerativi (per una rassegna vedi ^1,2). tessuto del midollo spinale spesso si perde attraverso la degenerazione secondaria che porta alla formazione di cisti o buchi dentro e intorno alla zona della lesione. La maggior parte degli interventi terapeutici sperimentali si concentrano su incompleti danni al midollo spinale come transezione, schiacciare o contusione lesioni parziali con un bordo residuo di tessuto sano. Per le lesioni complete come transections totali derivanti da incidenti traumatici o interventi chirurgici, come la resezione del tumore, sono disponibili solo le opzioni di trattamento molto limitate oggi ^3,4. Dopo la completa resezione, la tensione meccanica dei risultati di tessuto del midollo retrazione ceppo, lasciando un piccolo spazio nel midollo spinale. La maggior parte delle strategie si concentrano su colmare questa lacuna con tessuti, cellule o matrici ^5,6.

Qui, una strategia differentesi presenta, cioè riadattamento dei monconi separati mediante un dispositivo microconnettore novel ^7. Per riadattare i due monconi, forza meccanica deve essere applicata come una pressione leggermente negativa per raggiungere questo (Figura 1). Il sistema microconnettore meccanico (MMS) è un sistema multi-canale di polimetilmetacrilato (PMMA) con fori a forma di nido d'ape (Figura 1A) e provvisto di un sistema tubo di uscita. Si è impiantato nella fessura tessuto risultante dalla completa transection midollo spinale nel ratto (Figura 1C). Un tubo può essere collegato ad una pompa a vuoto per applicare una pressione negativa alle MMS (Figura 1D). La pressione tira le sconnesse ceppi del midollo spinale nei fori a forma di nido d'ape dei MMS, che hanno pareti microstrutturate per tenere il tessuto in posizione quando la pressione viene rilasciata (Figura 1B). Il tubo può essere lasciato intatto dopo l'intervento e collegato ad un minipompa osmotica in ordineinfondere sostanze nel nucleo lesione (Figura 1E-F).

Oltre ad una transezione acuta del midollo spinale altro tipo di risultati completi lesione da rimozione chirurgica di un tumore spinale o un solido cicatriziale lesione cronica che porta a grandi lacune del tessuto di alcuni millimetri, che non possono essere superati mediante i MMS finora. La maggior parte dei pazienti con trauma del midollo spinale soffrono di lesioni croniche. In questi pazienti, una cicatrice completamente sviluppato occupa il nucleo lesione. La rimozione chirurgica della cicatrice lesione è un concetto per il trattamento che è attualmente indagato dopo SCI sperimentale ^8,9. Mentre la procedura di resezione stessa può essere eseguita senza causare notevoli danni aggiuntivi, il divario tessuto risultante deve essere colmato con una matrice adatta che consente e promuove la rigenerazione dei tessuti e, nel caso specifico delle lesioni del midollo spinale, la rigenerazione delle fibre nervose per mantenere e promuovere le funzioni dell'apparato locomotore. Eratrovato che a basso peso molecolare polietilene glicole (PEG 600) è un materiale molto adatto per questo scopo. La sua mancanza di immunogenicità e la viscosità molto bassa consentono un'agevole integrazione nel tessuto circostante. Inserimento del biopolimero solo promuove l'invasione delle cellule benefiche, comprese le cellule endoteliali, cellule di Schwann periferiche e astrociti, e - molto importante - la rigenerazione e l'allungamento degli assoni di discendente e ascendente tratti di fibre così come la loro ensheathment da mielina compact ^8. Queste risposte rigenerativa sono stati trovati ad essere accompagnato da lunga durata miglioramenti funzionali. La combinazione della resezione di tessuto cicatriziale e conseguente impianto di PEG 600 presenta un mezzo sicuro e semplice, ma molto efficace per colmare notevoli difetti del tessuto del midollo spinale.

Protocollo

linee guida istituzionali per la sicurezza degli animali e il comfort sono stati rispettati, e tutti gli interventi chirurgici e la cura degli animali pre e post-chirurgica sono stati forniti nel rispetto della legge sulla protezione degli animali tedesca (Ufficio di Stato, ambientale e tutela dei consumatori del Nord Reno-Westfalia, LANUV NRW ).

1. transezione completa del midollo spinale toracico di ratti femmina Wistar (220 - 250 g)

1. Preparazione del midollo spinale
   1. Utilizzare isoflurano anestesia per inalazione (2 - 3% di isoflurano in O ₂ / NO ₂ con un rapporto di 1: 2) e bolo di Carprofen (sottocutanea [sc] 5 mg / kg). Si raccomanda la combinazione di carprofen e buprenorfina oppioidi (0,02 mg / kg sc). Inizia chirurgia quando palpebra riflesso al tocco leggero con un batuffolo di cotone e zampa ritiro reflex a pizzicare stimolo con una pinza non sono più rispettate.
   2. Posto l'animale su una coperta di riscaldamento a 37 ° C per mantenere la tempe corpore durante l'intervento e mettere pomata occhio sugli occhi per evitare la secchezza mentre sotto anestesia.
   3. Shave dorso dell'animale e preparare la pelle con un disinfettante pelle.
   4. Tagliare la pelle sulla linea mediana lungo le vertebre toraciche per 4 cm con una lama chirurgica e aprirlo. Da questo punto in poi, utilizzare strumenti chirurgici sterilizzati per tutte le procedure (in autoclave o immersione-sterilizzato).
   5. Ritrarre i muscoli sopra le vertebre toraciche con la fascetta a piccoli muscoli.
   6. Rimuovere i processi spinosi a livello toracico 8 (Th8) e Th9 con un rongeur osso da clipping cautamente piccoli pezzi di osso fino a quando le ossa vertebrali sono piatte.
   7. Utilizzare pinze anatomiche per sollevare la colonna vertebrale al processo spinoso Th7 e utilizzare un rongeur per ritagliare piccoli pezzi di osso vertebrale da caudale a rostrale fino a quando una laminectomia viene eseguita a Th8 e Th9. Esporre la dura madre senza danneggiarlo rimuovendo accuratamente pochi e molto piccoli pezzi di osso vertebrale alla volta.
   8. Bloccare la spina dorsale con 2 pinze di stabilizzazione a processi spinosi Th7 e D10, sollevare l'animale a disaccoppiare i movimenti respiratori dalle vertebre.
2. Completare Transezione midollo spinale a livello toracico 8/9
   1. Sollevare la dura madre con una pinza sottile, tagliare la dura madre con le forbici occhio fini in direzione trasversale.
   2. Tenere l'estremità del taglio laterale della dura madre con una pinza sottile e inserire un gancio spinale nello spazio subarachnoidic tra la dura madre e arachnoidea. Evitare danni delle meningi, non pungendo nella pia o dura madre sia con una pinza o il gancio del midollo spinale.
   3. Ruotare lentamente il gancio per posizionarlo lungo tutto il tessuto del midollo spinale, facendo attenzione a non pungere nella dura (pia è ancora intatto).
   4. Sollevare il midollo spinale per circa 1 - 2 mm verso l'alto, fino a quando uno spazio è visto dalla parte ventrale tra il tessuto del midollo spinale e dura.
   5. Inserire le forbici occhi sottili nello spazio between dura e pia e tagliare il midollo spinale, mentre il gancio vertebrale viene lasciato in sede.
   6. Sollevare i due monconi del midollo spinale con due pinze e garantire la completa visivamente transection.
   7. Per gli animali di controllo-lesionati e animali con una lesione cronica, chiudere la dura dai punti staccati con monofilamento non assorbibili 9,0 discussioni.
   8. Per le lesioni croniche seguire parte 1.6.
3. Mms impianto
   1. Posizionare MMS sopra il sito della lesione con i due tubi che si trovano su ciascun lato laterale della vertebra e abbassarlo nella cavità lesione.
   2. tubi sutura ai muscoli a lato della vertebra con non riassorbibile 4-0 filo per assicurare la stabilizzazione del MMS. Garantire una fissazione degli MMS utilizzando forcipe durante questa fase.
   3. Rimuovere il pin del connettore MMS tagliando con un paio di forbici sottili.
   4. Chiudere la dura sopra l'MMS e suturare con 9,0 fili.
   5. Attaccare un tubo alla pompa da vuoto, e sigillarel'altra da bloccaggio.
   6. Applicare una leggera pressione negativa per l'MMS da una pompa a vuoto attraverso il tubo aperto, succhiando i ceppi del midollo spinale nel lume MMS. Applicare la pressione negativa per alcuni minuti (al massimo per 10 minuti) e monitorare da sensori (250 - 350 mbar).
   7. Tagliare i tubi vicino alle MMS e rimuovere i tubi. Continuare con passo 1.6.
4. Resezione di tessuto del midollo spinale Compresa la cicatrice lesione cronica alla settimana 5 dopo lesione iniziale
   1. Seguire i punti 1.1.1 - 1.1.5.
   2. Identificare tessuto cicatriziale da comparsa marrone-giallo e del tessuto rigido sulla parte superiore del midollo spinale. Rimuovere delicatamente gli strati superficiali del tessuto cicatriziale tenendo con una pinza sottile e il taglio con le forbici sottili. Con questo metodo, riaprire il sito di laminectomia per esporre il tessuto che contiene l'area lesioni del midollo spinale. Smettere di preparazione quando la sutura dura è identificato visivamente.
   3. Bloccare la spina dorsale del 2 stabilizzazione morsetti a rotazioneprocessi OU TH7 e TH10, e quindi elevare l'animale a disaccoppiare i movimenti respiratori dalle vertebre.
   4. Con un piccolo righello cartone misurare l'area del midollo spinale che deve essere asportato (lunghezza: 4 mm) e segnare i bordi di questo rispettiva area di tessuto con incisioni trasversali per consentire la successiva rimozione del tessuto.
   5. Rimuovere tessuto cicatriziale tramite una combinazione di taglio e aspirazione. Estrarre il tessuto che è stato separato dal midollo spinale con le incisioni trasversali. Utilizzare una leggera aspirazione ogni volta che è sufficiente per consentire la rimozione del tessuto. Inoltre, ogni volta che la consistenza rigida del tessuto cicatriziale rende aspirazione dei tessuti troppo difficile, usare le forbici sottili per tagliare e rimuovere questo tessuto.
   6. Inserire un pezzo (circa 5 mm x 5 mm x 5 mm cubo) di emostatico spugna di gelatina nella fessura del tessuto fino placa sanguinamento. La spugna di gelatina si stringe appena è imbevuto di liquido.
5. IMPLAntazione di PEG 600
   1. Preparare 1 ml di puro diluito PEG 600 iniettabile per riscaldamento a 37 ° C.
   2. Rimuovere spugna di gelatina.
   3. Inserire quantità sufficiente (circa 5 - 7 ml) del PEG nella fessura utilizzando una siringa da 10 microlitri o una pipetta 10 microlitri.
   4. coprire con cura la zona con un pezzo (circa 5 mm x 4 mm) di sostituzione del sigillante / dura.
   5. Fissare il sigillante circonda il tessuto muscolare con qualche goccia di colla tessuto. Posizionare il sigillante sulla parte superiore del gap resezione PEG-riempita. Per evitare lo slittamento del sigillante, utilizzare piccole gocce di colla tessuto per fissare gli angoli del sigillante al tessuto muscolare circostante. Nota: evitare la fuoriuscita del collante del tessuto sul tessuto del midollo spinale!
6. Chiusura di tessuti e postoperatoria cura
   1. muscoli di sutura e strato di pelle per lo strato con punti staccati con intrecciati assorbibili 4-0 discussioni
   2. Iniettare 2 × 2,5 ml di cloruro di sodio (NaCl[0.9%]) a 36 ° C sc per la reidratazione dopo l'intervento. Una singola iniezione di 5 ml NaCl allungherebbe pelle dell'animale e potrebbe causare danni inutili per l'animale. Non lasciare incustoditi animale fino a quando viene ripreso piena coscienza.
   3. Iniettare carprofen giornaliero (sc 5 mg / kg) per almeno 2 giorni dopo l'intervento. Animal House in un'unica gabbia durante i primi 2 giorni, poi in gruppi di 2-3.
   4. Applicare trattamento antibiotico (somministrazione orale giornaliera dell'enrofloxacina) per la prima settimana post-operatorio.
   5. Fare vescica manuale svuotamento a due o tre volte al giorno da accarezzando delicatamente il ventre dell'animale da rostrale a caudale. Fare attenzione a non spostare la colonna vertebrale dell'animale e non sollevare l'animale in coda. annullare manualmente la vescica dell'animale completamente spinalized tutti i giorni durante il tempo di sopravvivenza generale. Bisogna fare attenzione a posizionare pellet cibo e bottiglie d'acqua in una altezza che può essere raggiunto dagli animali senzain piedi sulle loro hindpaws. Anche se essere lesi nella funzione posteriori trimestre, gli animali si muovono ed esplorare le gabbie attivamente subito dopo l'intervento chirurgico. Si raccomanda di tenere i topi in gruppi socievoli.
   6. Per le lesioni croniche lasciare un tempo di sopravvivenza degli animali di cinque settimane prima resezione cicatrice. Seguire i punti 1.4.

Risultati

Tissue Conservazione, assonale ricrescita e beneficio funzionale di MMS impianto dopo acuta transezione completa del midollo spinale
E 'dimostrato che l'impianto acuta degli MMS stabilizzato i completamente sezionato ceppi midollo spinale e diminuito il restringimento del tessuto (Figura 2A contro B). Come visualizzato da Trichrome colorazione nelle sezioni sagittali, il verde colorazione del tessuto connettivo de...

Discussione

Qui due diversi approcci chirurgici vengono presentati per colmare le lacune del tessuto del midollo spinale dopo (1) transezione completa acuta e MMS impianto e (2) cronica lesione del midollo spinale e la rimozione della cicatrice fibrosa più PEG matrice impianto. Entrambe le strategie portano alla conservazione dei tessuti e la rigenerazione assonale nonché significativo locomotoria miglioramento funzionale degli animali trattati. Per MMS impianto un'adeguata fissazione dei MMS all'interno del midollo spinale...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PEG 600 Ph Eur	Merck/VWR	8.170.041.000
Spugna di gelatina Gelastypt	sanofi Aventis	PZN-8789582
Sigillante Nescofilm	Roth	2569.1
Baytril	Bayer
Rimadyl (Carpofen)	Pfizer
Forene (Isoflurano)	Abbvie
Kodan (disinfettante per la pelle)
Histoacryl (colla per tessuti)
Friedman-Pearson Rongeur, tazza da 1 mm, dritta	Fine Science Tools	16020-14
Micro Spatola due in uno - 12 cm	Fine Science Tools	10091-12
Dumont #7 Pinze - Inox Medical	Fine Science Tools	11273-20
Dumont #5/45 Pinze - Inox Medical	Fine Science Tools	11253-25
Gancio per midollo spinale	Strumenti per la scienza fine	10162-12
Forbici	Strumenti per scienze fini	14078-10
Morsetto	Aesculap	EA016R
Ethicon Vicryl 4-0
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer
Forcipe anatomico	Fine Science Tools	11000-13
Divaricatore autobloccante	Fine Science Tools	17008-07
Morsetto per la pelle	Strumenti per le scienze fini	13008-12
Aluspray	Selectavet