Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

Sommario

Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura.

Abstract

Presentiamo una tecnica che combina un protocollo in vitro iniezione tracciante, che utilizza una serie di impulsi elettrici, di pressione per aumentare colorante assorbimento attraverso elettroporazione in espianti cerebrali con illuminazione laser mirati e congrui occhialini filtro durante la procedura. La tecnica descritta di elettroporazione in vitro per sé produce relativamente buon controllo visivo rivolti determinate aree del cervello. Attraverso la combinazione con il laser di eccitazione di marcatori genetici fluorescenti e la loro lettura attraverso gli occhiali di filtro a banda passante, che possono raccogliere le emissioni dei geneticamente etichettati cellule / nuclei e il colorante tracciamento fluorescente, un ricercatore può aumentare notevolmente la precisione delle iniezioni trovando l'area di interesse e di controllo per il colorante diffuso / assorbimento nella zona di iniezione molto più efficiente. Inoltre, la tecnica di illuminazione laser consente di studiare la funzionalità di un dato neurocircuit dal provIding informazioni sul tipo di neuroni che proiettano una certa area in casi in cui l'espressione della GFP è legata al tipo di trasmettitore espressa da una sottopopolazione di neuroni.

Introduzione

Per definire un certo (micro) circuito neuronale, si deve avviare da trovare vari partecipanti di detto circuito, e il loro modello di connessione. Da quando la pubblicazione di Waller su neurofiber rintracciare attraverso la lesione ¹ una grande varietà di tecniche di tracciamento neuroanatomiche è stata stabilita. Alcune di queste tecniche possono essere applicate in tessuto fissato post mortem ^2-4, altri si basano sul trasporto attivo del colorante nei neuroni vivi, come scoperto nel 1971 ^5-6. Quest'ultimo può essere ulteriormente suddiviso in due gruppi discriminano tra metodi sfruttando retrograda attiva (dalla zona iniettata....

Protocollo

1. genotipizzazione ottico

1. Optical genotipizzazione del mouse Pups

1. Controllare espressione del marcatore fluorescente rispettivo usando un puntatore laser di adeguata lunghezza d'onda di eccitazione (405 nm negli esperimenti qui descritti) e corrispondenti occhiali filtro di blocco alla lunghezza d'onda di eccitazione, ma passando la lunghezza d'onda di emissione (450-700 nm negli esperimenti qui descritti) . Puntare il puntatore laser sul retro della testa o del midollo spinale del cucciolo mouse (vedi Figura 1). Evitare che splende il laser negli occhi e lunga esposizione della pe....

Risultati

Figure 1 e 2 mostrano come il puntatore laser e occhiali laser può essere usato al genotipo modo rapido ed economico GFP animali risultati positivi da una cucciolata. In caso di cuccioli di topo, la tecnica può essere utilizzata per identificare in maniera non invasiva etichetta GFP nel cervello dell'animale attraverso il cranio e la pelle sovrastante (Figura 1A - D). Fluorescenza emessa può essere visto attraverso la pelle e il cranio del mouse cuccioli almeno fino al giorno postna.......

Discussione

Una forza generale in vitro tracciante elettroporazione, al contrario di studi in vivo tracciamento, è che dà ricercatori migliore accesso alla zona del cervello di interesse e quindi non comporta stereotassica costose (e spesso elettrofisiologico) attrezzature. Inoltre, il periodo di sopravvivenza richiesto per gli espianti cerebrali estende solo poche ore (1 - 4) invece di giorni o settimane nel caso di vivo iniezioni traccianti in (vedere una recensione dettagliata sull'uso di .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Tutti i prodotti chimici provengono da Sigma-Aldrich, se non diversamente specificato.
Cloruro di potassio		P9333
Fosfato di potassio monobasico		P5655
Fosfato di sodio dibasico		S907
Cloruro di		M2670
Cloruro di		C5080
Glucosio		G7528
Bicarbonato		S6297
Acido		A4544
Mio-inositolo		I5125
Piruvato		P2256
	sierica bovina	A2153	opzionale, per ulteriore (immuno)istochimica
Triton-X-100		X100	opzionale, per ulteriore (immuno)istochimica
Poli(glicole etilenico), 8000 MW		P2139	opzionale, per la pulizia del cervello
Formamide	Fisher Scientific	F84	opzionale, per la pulizia del cervello
Sonde molecolari	subunità-b della coleratossina	C-34776 (Alexa 555)
Sonde molecolari	di destrane tetrametil-rodamina	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescente Nissl	Invitrogen	N-21479 (blu)
opzionale Paraformaldeide	Scientific	SF93
Agarosio	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Filamenti di vetro borosilicato	Harvard Apparatus	G150F-10
Estrattore	pipette Zeitz Instruments, Germania	DMZ Estrattore
Configurazione della perfusione	Puntatore laser su misura
	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
occhiali di sicurezza	Dragon Lasers, China	LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Microscopio bionoculare	Wild Heerbrugg, Svizzera	Wild M3	Dotato di illuminatore ad alta intensità (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC con installato il software MC Stimulus	Sistemi multicanale, Germania (software)
Stimolatore a 2 canali	Sistemi multicanale, Germania	STG-1002
Unità di isolamento per stimolazione	A.M.P.I., Israele	Micromanipolatore Iso-Flex
	Narishige, Giappone	YOU-1
Vibratome	Leica, Germania	VT1000S

magnesio calcio di sodio ascorbico di sodio Albumina della Fisher per universaleFiltri/