Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

Sommario

Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura.

Abstract

Presentiamo una tecnica che combina un protocollo in vitro iniezione tracciante, che utilizza una serie di impulsi elettrici, di pressione per aumentare colorante assorbimento attraverso elettroporazione in espianti cerebrali con illuminazione laser mirati e congrui occhialini filtro durante la procedura. La tecnica descritta di elettroporazione in vitro per sé produce relativamente buon controllo visivo rivolti determinate aree del cervello. Attraverso la combinazione con il laser di eccitazione di marcatori genetici fluorescenti e la loro lettura attraverso gli occhiali di filtro a banda passante, che possono raccogliere le emissioni dei geneticamente etichettati cellule / nuclei e il colorante tracciamento fluorescente, un ricercatore può aumentare notevolmente la precisione delle iniezioni trovando l'area di interesse e di controllo per il colorante diffuso / assorbimento nella zona di iniezione molto più efficiente. Inoltre, la tecnica di illuminazione laser consente di studiare la funzionalità di un dato neurocircuit dal provIding informazioni sul tipo di neuroni che proiettano una certa area in casi in cui l'espressione della GFP è legata al tipo di trasmettitore espressa da una sottopopolazione di neuroni.

Introduzione

Per definire un certo (micro) circuito neuronale, si deve avviare da trovare vari partecipanti di detto circuito, e il loro modello di connessione. Da quando la pubblicazione di Waller su neurofiber rintracciare attraverso la lesione ¹ una grande varietà di tecniche di tracciamento neuroanatomiche è stata stabilita. Alcune di queste tecniche possono essere applicate in tessuto fissato post mortem ^2-4, altri si basano sul trasporto attivo del colorante nei neuroni vivi, come scoperto nel 1971 ^5-6. Quest'ultimo può essere ulteriormente suddiviso in due gruppi discriminano tra metodi sfruttando retrograda attiva (dalla zona iniettata alla sorgente di sporgenze, cioè. Somata di neuroni che sono sporgenti da detta area) e anterograda attiva (dal iniettato zona al target di una data di proiezione, cioè. le proiezioni assonale ei terminali assonale dei neuroni marcati) di trasporto. Inoltre, in alcuni casi di tramateriale cer viene iniettato in animali vivi che poi sopravvivono l'iniezione di diversi giorni o settimane (a iniezioni vivo tracciante), mentre in altri casi cervelli espiantati vengono iniettati e incubare per diverse ore dopo l'iniezione di liquido cerebrospinale artificiale (in vitro iniezioni tracciante) .

In questo protocollo abbiamo modificato uno esistente in vitro tecnica elettroporazione ^7-8 per etichettare somata e processi neuronale nel anterograda e tracciamento retrogrado esperimenti usando choleratoxin subunità-b e tetramethylrhodamine destrano le sostanze tracciamento. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire neuroscienziati con uno strumento efficiente per tracciare modelli di connettività tra i diversi nuclei neuronali del cervello, usufruendo di linee disponibili topo transgenico ed apparecchiature ottiche di base al fine di aumentare la precisione di mira durante le iniezioni traccianti. Sebbene il metodo di anterograda e retrograda usando tracingcholeratoxin e ammina destrano e rispettivi coniugati fluorescente non è nuova ^9-13 (come è il metodo di elettroporazione, per es. Haas et al. ^14), la combinazione di iniezioni traccianti con elettroporazione in una preparazione in vitro coinvolgono blocchi di tessuto cerebrale è uno sviluppo più recente ^7. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche di tracciatura neuronali utilizzando lo stesso tipo di coloranti traccianti di animali vivi è la maggiore intensità di etichettatura, a causa della maggiore efficienza con cui il colorante elettroporate viene ripreso dai neuroni. Un ulteriore vantaggio è il termine abbreviato di incubazione (necessario per il trasporto di colorante) e la sua maggiore accuratezza bersaglio durante l'iniezione tracciante, perché lo sperimentatore ha il controllo visivo sull'area bersaglio di iniezione. Quest'ultimo significa anche che non costose apparecchiature stereotassica è richiesto per trovare il nucleo o il cervello area di interesse.

Per addizionale aumentare la precisione di mira, abbiamo approfittato di una linea di topi transgenici, che esprime GFP nella sottopopolazione glicinergica di neuroni ¹⁵ ed apparecchiature ottiche di base che consistono di un puntatore laser portatile di 405 nm occhiali passa-banda di lunghezze d'onda e la congruenza di filtraggio (450 - 700 nm). Così, abbiamo ottenuto un ulteriore significativo aumento di targeting accuratezza individuando la zona di iniezione attraverso il suo segnale fluorescente e fornendo un modo più fine di controllare per la diffusione di colorante all'interno dell'area di iniezione attraverso l'osservazione dell'interazione tra il segnale GFP indigena e il tracciante fluorescenza. La nostra tecnica permette anche di scoprire la funzionalità di un circuito con la sua connettività identificando neuroni inibitori GFP-positive (o eccitatorio in altre linee di topo), che sono stati riempiti con il tracciante.

In sintesi, abbiamo ulteriormente migliorato un potente strumento per studiare la neuroscientifica connettoma del cervello dei vertebrati e valutare tha diverse caratteristiche neuroanatomiche di un determinato neurocircuit. Utilizzando topi transgenici con apparecchiature ottiche economico e largamente disponibile siamo stati in grado di aumentare significativamente la precisione di mira dei nostri iniezioni. Inoltre, i topi transgenici ha permesso di identificare il tipo di connessioni tracciate, che hanno contribuito scoprire la funzionalità di un microcircuito inibitorio nel tronco cerebrale uditivo.

Protocollo

1. genotipizzazione ottico

1. Optical genotipizzazione del mouse Pups

1. Controllare espressione del marcatore fluorescente rispettivo usando un puntatore laser di adeguata lunghezza d'onda di eccitazione (405 nm negli esperimenti qui descritti) e corrispondenti occhiali filtro di blocco alla lunghezza d'onda di eccitazione, ma passando la lunghezza d'onda di emissione (450-700 nm negli esperimenti qui descritti) . Puntare il puntatore laser sul retro della testa o del midollo spinale del cucciolo mouse (vedi Figura 1). Evitare che splende il laser negli occhi e lunga esposizione della pelle alla luce laser.

2. ottica genotipizzazione degli anziani animali

1. Profondamente anestetizzare il mouse (di età compresa tra P14 a P138 negli esperimenti qui descritti), con una overdose di pentobarbital attraverso un'iniezione intraperitoneale (120 mg / kg di peso corporeo). Confermare anestesia corretta verificando i riflessi degli animali (brevemente pizzicare la punta di the orecchio o una delle zampe posteriori per suscitare il riflesso retrazione dell'orecchio o della gamba).
2. Nota: Nonostante l'uso di una dose eccessiva di pentobarbital (120 mg / kg di peso corporeo) si fa riferimento alla procedura di iniezione come "profonda anestesia" invece di eutanasia, perché l'animale è idealmente ancora vivo (cioè il suo cuore batte ancora), quando la chirurgia e la perfusione cominciano. Questo assicura una più efficiente perfusione degli organi interni compreso il cervello.
3. Una volta che l'animale non mostra riflessi, rimuovere con attenzione la pelle sovrastante il cranio (Figura 2A) facendo un'incisione nella pelle che copre la parte posteriore della testa e taglio al tronco del cranio. Esporre il cranio scoperto alla luce laser e osservare la fluorescenza attraverso gli occhiali filtro come descritto sopra. Se un segnale GFP positivo viene osservato, passare al punto 2, se non, sacrifica l'animale attraverso decapitazione (secondo / garantendo forma di eutanasia seguendo il nostroRegolamenti IACUC).

Nota: Nei topi, anche più grandi (> 1 mese) la fluorescenza può essere osservata attraverso gli occhi dell'animale.

2. transcardial Perfusione e Cervello Preparazione

1. Profumato transcardiaca con tampone fosfato salino ghiacciata (PBS; NaCl: 137 mm, KCl 2,7 mM, KH ₂ PO _4: 1.76 mM, Na ₂ HPO _4: 10 mm) con una siringa ago da 30 G per rimuovere gran parte del sangue da l'animale.
   1. Innanzitutto, aprire con cautela la gabbia toracica con forbici affilate e poi spingere l'ago nel ventricolo sinistro del cuore. Avviare il pompaggio PBS nel cuore e l'aorta e immediatamente dopo questa fase aprire nell'atrio destro del cuore con le forbici per consentire al sangue di uscire dal corpo. Nota: perfusione richiede 5 - 10 min a seconda della taglia dell'animale.
2. Dopo dissanguamento mediante perfusione, decapitare il animali, garantire la sua testa con il perno needles (o 30 G aghi delle siringhe) da loro penetrante attraverso le orbite in un piatto preparato e rimuovere il cervello dal cranio.
   1. Innanzitutto, utilizzare forbici affilate per tagliare la pelle sovrapponendo cranio: fare una piccola incisione nella parte posteriore della testa, poi tagliare lungo la linea mediana sul lato dorsale della testa, tagliati ai lati appena caudalmente degli occhi dell'animale e infine tagliato in direzione caudale rimuovere completamente i lembi di pelle nella parte posteriore della testa.
   2. Successivamente, ripetere lo stesso schema di taglio per il cranio stesso, assicurarsi di rimuovere due coclee nel processo, perché questo semplifica notevolmente la rimozione del tronco cerebrale alla fine. Dopo questa procedura, la parte caudale del cervello dovrebbe giacciono completamente esposto.
   3. Nella fase successiva, utilizzare una lama di rasoio affilata o un bisturi per tagliare attraverso tutta proencefalo ad un angolo di circa 45 ° e circa 2 mm rostrale dal cervelletto. Scoop fuori la metà anteriore separata del cervello con abspatola ent.
   4. Utilizzare la spatola per elevare la parte caudale del cervello alla sua estremità rostrale e successivamente tagliare i nervi cranici che sono ancora collegate al tronco cerebrale sul lato ventrale. Come risultato finale, la parte caudale del cervello incluso il tronco cerebrale deve cadere liberamente fuori il resto della testa di animale preparato.
   5. Capovolgere la parte caudale rimosso del cervello per esporre il suo lato ventrale e tagliare lungo il piano coronale solo rostrale (per le iniezioni anterograda) o semplicemente caudale (per le iniezioni retrogradi) delle "lampadine" ventrale situati contenenti il ​​corpo trapezoidale (vedere il passaggio 2.3).
      1. Utilizzare sempre una lama di rasoio affilata o un bisturi per la procedura di taglio per ridurre al minimo la morte cellulare causata da eccessiva sollecitazione meccanica sul tessuto. Come risultato finale, un espianto cervello attraversa circa 1 cm di lunghezza e contenente la completa oliva pontina lungo altre regioni del cervello avrebbe dovuto essere ottenuta.

Nota: Questo protocollo illustra la procedura di iniezione tracciante nel corpo trapezoidale situato nel tronco cerebrale uditivo. Adattare la posizione e l'orientamento dei piani di taglio e siti di iniezione come necessario. Se le regioni cerebrali fluorescenti di interesse si trovano abbastanza vicino alla superficie del cervello, in modo che possano essere identificati e iniettati senza tagliare il cervello (vedere la Figura 2B), allora la fase di taglio coronale può essere omesso.

3. Identificare il corpo trapezoidale come due ventrali "lampadine" di spicco che contengono il nucleo ventrale del corpo trapezoidale (VNTB).

Nota: per ulteriori riferimenti anatomici per quanto riguarda la localizzazione stereotassica approssimativa di questi piani di taglio, vedere Franklin & Paxinos, 2008. Panel 78 dell'atlante, Bregma ~ -5.7 mm mostra il nucleo mediale del corpo trapezoidale (= MNTB) etichettato come "Tz ". Panel 69 mostra il nucleo ventrale del bo trapeziody (VNTB) etichettato come "MVPO" (medioventral nucleo periolivary) ^19.

3. anterograda / retrograda Tracing

Nota: Eseguire tutte le procedure di seguito a temperatura ambiente (25 ° C).

1. Dopo il taglio, posizionare l'espianto tronco cerebrale in un piatto preparato contenente ossigenata (95% O _2, CO ₂ 5%) dissezione soluzione (NaCl: 125 mm, KCl: 2,5 mm, _MgCl 2: 1 mm, CaCl _2: 0,1 mm, il glucosio : 25 mM, NaH ₂ PO _4: 1,25 mM, NaHCO _3: 25 mM, acido ascorbico: 0.4 mM, mio-inositolo: 3 mM, acido piruvico: 2 mM), fissandolo con 30 aghi siringa G. Assicurarsi che la zona di iniezione è rivolta verso l'alto.
2. Tirare pipette iniezione da vetro borosilicato e riempirli con uno dei seguenti tre soluzioni: a) una soluzione di 1,0 mg / ml di choleratoxin subunità b coniugato ad un fluoroforo Alexa 555 in PBS ^_12-13 (utilizzato principalmente per il trasporto retrogrado), b ) un -d 1%ilution in soluzione fisiologica 0,9% di destrano tetramethylrhodamine 555 (3.000 MW, utilizzato principalmente per il trasporto retrogrado) oppure c) una diluizione, 1% in soluzione fisiologica 0,9% di 10.000 MW-destrano TRITC 555 (utilizzato principalmente per il trasporto anterogrado).
   1. Assicurarsi che le resistenze gamma pipetta di iniezione 2,5-3,5 MOhm e che sono fabbricati in 3 - 4 cicli di trazione. Per gli esperimenti qui descritti, ottenere ciò selezionando un algoritmo tirando preprogrammato sul estrattore pipetta.
3. Illuminare l'espianto del cervello utilizzando un puntatore laser montato in modo statico della lunghezza d'onda appropriata (punto n ° 2 nella figura 3A; 405 nm di lunghezza d'onda negli esperimenti qui descritti). Utilizzare il puntatore laser come guida per le iniezioni, e puntare il fascio laser verso il nucleo cerebrale fluorescente o cellule di interesse che verrà iniettato.
4. Trovare e osservare il fascio luminoso attraverso un microscopio binoculare mentre indossa gli occhiali filtranti compatibili (450 - 700 nm filtro passa banda negli esperimenti qui descritti). Inserire l'elettrodo di iniezione tramite micromanipolatore nella zona di interesse.
5. Iniettare la sostanza tracciante. Le iniezioni sono composti da 2 - 10 impulsi di pressione a 15 psi per 50 msec ciascuno, utilizzando un dispositivo di iniezione a pressione, diretto perpendicolarmente nella regione di interesse (ROI) all'interno della sezione cervello. Somministrare ogni impulso di pressione ad intervalli di 10 - 15 secondi per consentire il colorante di diffondersi.
6. Nel caso delle iniezioni tetramethylrhodamine (TRITC), inoltre stimolare elettricamente per migliorare l'assorbimento di colorante attraverso elettroporazione con l'elettrodo posto nella zona del cervello di interesse (MNTB e VNTB negli esperimenti qui descritti).
   1. Utilizzare 8 impulsi TTL di 8 volt per 50 msec con 50 msec inter intervalli, guidati da uno stimolatore e amplificati a 55 V con una unità di isolamento di stimolazione (articoli n ° 7 e 9 nella Figura 3B). Usare 10 - 20 ripetizioni di questo protocollo, amminitrato per diversi minuti ^7,8. Assicurati di massa l'elettrodo correttamente - il filo di terra deve essere collegato al soluzione del bagno!
7. Controllare successo dell'iniezione. Dal momento che un tracciante fluorescente con una lunghezza d'onda di emissione è più anche emettendo un segnale fluorescente su eccitazione laser con lunghezza d'onda più corte, per controllare visivamente il colorante captazione / diffondersi nella zona di destinazione iniettata mentre illuminando la zona con il laser e osservando attraverso gli occhiali del filtro.

4. Incubazione

1. Dopo l'iniezione, incubare le brainstems nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl ₂ 1 mM, CaCl _2: 2 mM, glucosio 25 mM, NaH ₂ PO _4: 1.25 mM, NaHCO _3: 25 mM, acido ascorbico: 0.4 mM, myo-inositolo: 3 mM, acido piruvico: 2 mM, bollito con 95% O ₂ - 5% ₂₎ a temperatura ambiente CO (RT, 25 ° C) per 1 - 4 ore, mentreil colorante viene trasportato. Bubble soluzione durante l'intero periodo di incubazione.
2. Successivamente, trasferire i brainstems in 4% paraformaldeide (PFA) disciolto in PBS (circa 100 ml;. PH 7 per il mix PFA / PBS) e incubate a 4 ° C per consentire post-fissazione overnight (O / N).

5. Tessuto affettare e di montaggio

1. Il giorno dopo, lavare il tronco cerebrale per tre volte in PBS (5 minuti per ogni fase di lavaggio), coprire nel 4% agar e poi tagliata a 50 - 80 micron di spessore fette su un vibratomo. Montare le fette con un mezzo di montaggio su un vetrino e coprioggetto.
2. Facoltativamente, etichettare le sezioni con Nissl fluorescente per 25 min (per esempio blu Nissl ad una diluizione 1: 100 in AB media).
   1. Per preparare AB media, mescolare 250 ml di 0,2 M tampone fosfato (PB; 51 KH _MM 2 PO _4, 150 mm _Na 2 HPO _4), 15 ml di 5 M di NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml DDH ₂ O e 5 g albumina di siero bovino.
   2. Precede e avere successo l'etichettatura Nissl passo da 3 fasi di lavaggio in PBS (10 minuti ciascuno).

Nota: Nei casi in cui devono essere montati e analizzato sezioni più spesse (in esperimenti descritti qui tali fette erano 100 - 500 micron di spessore per mantenere i collegamenti assonale su distanze più grandi), la tecnica può essere combinata con compensazione dei tessuti. Abbiamo trovato il ClearT2 ¹² per avere successo ^20. Quando un passo di compensazione tessuto è incluso, eseguire prima di montare sezioni.

Risultati

Figure 1 e 2 mostrano come il puntatore laser e occhiali laser può essere usato al genotipo modo rapido ed economico GFP animali risultati positivi da una cucciolata. In caso di cuccioli di topo, la tecnica può essere utilizzata per identificare in maniera non invasiva etichetta GFP nel cervello dell'animale attraverso il cranio e la pelle sovrastante (Figura 1A - D). Fluorescenza emessa può essere visto attraverso la pelle e il cranio del mouse cuccioli almeno fino al giorno postnatale...

Discussione

Una forza generale in vitro tracciante elettroporazione, al contrario di studi in vivo tracciamento, è che dà ricercatori migliore accesso alla zona del cervello di interesse e quindi non comporta stereotassica costose (e spesso elettrofisiologico) attrezzature. Inoltre, il periodo di sopravvivenza richiesto per gli espianti cerebrali estende solo poche ore (1 - 4) invece di giorni o settimane nel caso di vivo iniezioni traccianti in (vedere una recensione dettagliata sull'uso di ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S7653	Tutti i prodotti chimici provengono da Sigma-Aldrich, se non diversamente specificato.
Cloruro di potassio		P9333
Fosfato di potassio monobasico		P5655
Fosfato di sodio dibasico		S907
Cloruro di		M2670
Cloruro di		C5080
Glucosio		G7528
Bicarbonato		S6297
Acido		A4544
Mio-inositolo		I5125
Piruvato		P2256
	sierica bovina	A2153	opzionale, per ulteriore (immuno)istochimica
Triton-X-100		X100	opzionale, per ulteriore (immuno)istochimica
Poli(glicole etilenico), 8000 MW		P2139	opzionale, per la pulizia del cervello
Formamide	Fisher Scientific	F84	opzionale, per la pulizia del cervello
Sonde molecolari	subunità-b della coleratossina	C-34776 (Alexa 555)
Sonde molecolari	di destrane tetrametil-rodamina	D-7162 (Alexa 555)
Fluorescente Nissl	Invitrogen	N-21479 (blu)
opzionale Paraformaldeide	Scientific	SF93
Agarosio	Invitrogen	16520
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
Pentobarbi-tal	Vortech Pharmaceuticals	Fatal-Plus
Filamenti di vetro borosilicato	Harvard Apparatus	G150F-10
Estrattore	pipette Zeitz Instruments, Germania	DMZ Estrattore
Configurazione della perfusione	Puntatore laser su misura
	laserpointerpro.com, Hong Kong	HK-88007294 (405 nm)
occhiali di sicurezza	Dragon Lasers, China	LSG09 (band-pass 450-700 nm)
Microscopio bionoculare	Wild Heerbrugg, Svizzera	Wild M3	Dotato di illuminatore ad alta intensità (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)
Picospritzer	Parker Instruments	Picospritzer III
PC con installato il software MC Stimulus	Sistemi multicanale, Germania (software)
Stimolatore a 2 canali	Sistemi multicanale, Germania	STG-1002
Unità di isolamento per stimolazione	A.M.P.I., Israele	Micromanipolatore Iso-Flex
	Narishige, Giappone	YOU-1
Vibratome	Leica, Germania	VT1000S