Articolo metodologico

Electrotaxis Studi di polmone cellule tumorali usando un Multicanale Dual-campo elettrico Microfluidic Chip

DOI:

10.3791/53340

⸱

29 dicembre 2015

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang-Ming University, 3Biophotonics & Molecular Imaging Research Center (BMIRC), National Yang-Ming University, 4Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 5Ph.D. Program in Microbial Genomics, National Chung Hsing University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Molti dispositivi microfluidici sono stati sviluppati per l'uso nello studio dell'elettrotassi. Tuttavia, nessuno di questi chip consente lo studio efficiente degli effetti simultanei della chimica e del campo elettrico (EF) sulle cellule. Abbiamo sviluppato un dispositivo a base di polimetilmetacrilato che offre una stimolazione chimica e EF coesistente meglio controllata per l'uso nella ricerca sull'elettrotassi .

Abstract

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Il comportamento di migrazione delle cellule direzionale in una corrente di campo elettrico diretto (dcEF) è indicato come electrotaxis. Il ruolo significativo fisiologico dcEF nel guidare il movimento delle cellule durante lo sviluppo embrionale, la differenziazione cellulare e la guarigione della ferita è stata dimostrata in molti studi. Applicando chip microfluidici a un saggio electrotaxis, il processo di indagine è abbreviato e errori sperimentali sono ridotti al minimo. Negli ultimi anni, i dispositivi microfluidici fatti di sostanze polimeriche (ad esempio, polimetilmetacrilato, PMMA, o acrilico) o polidimetilsilossano (PDMS) sono stati ampiamente utilizzati nello studio delle risposte delle cellule alla stimolazione elettrica. Tuttavia, a differenza dei numerosi passaggi necessari per fabbricare un dispositivo PDMS, la costruzione semplice e rapida delle micro acrilici fl truciolo uidic rende adatto sia prototipazione dispositivo e produzione. Tuttavia nessuno dei dispositivi riportati facilitare lo studio efficace della sostanza chimica simultanea e DCEF effetti sulle cellule. In questo rapporto, descriviamo la nostra progettazione e fabbricazione di un multicanale base acrilica a doppio campo elettrico (MDF) chip per studiare l'effetto concomitante di chimica e di stimolazione elettrica sulle cellule tumorali del polmone. Il chip MDF fornisce otto combinazioni di stimolazioni elettriche / chimiche in un singolo test. Il chip non solo riduce notevolmente il tempo richiesto sperimentale ma aumenta anche la precisione in electrotaxis studi.

Introduzione

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Il comportamento delle cellule aderenti muovono verso un anodo o catodo in una corrente di campo elettrico diretto (dcEF) è indicato come electrotaxis. Il comportamento electrotactic delle cellule svolge un ruolo significativo nella embriogenesi, rigenerazione dei nervi, e la guarigione della ferita. 1 Le cellule tumorali come le cellule tumorali della prostata di ratto, cellule del cancro al seno 2, 3 e del polmone di cellule di adenocarcinoma 4-8 hanno dimostrato movimento electrotactic sotto un dcEF applicato . L'EF fisiologica è stata misurata nei tessuti della ghiandola. 9,10 Electrotaxis è stata riportata anche in cellule tumorali ghiandola associate. 2,3 Nel loro insieme, le electrotaxis di cellule tumorali è considerata un fattore di metastasi. 11 Controllo della guida elettrica di le cellule tumorali sotto dcEF può essere un approccio potenziale per il futuro trattamento del cancro. Tuttavia, oggi, il meccanismo molecolare dettagliato della electrotaxis rimane controverso. Pertanto, un'indagine sulla influence di stimolazione elettrica sulla migrazione delle cellule del cancro può facilitare lo sviluppo di strategie per il trattamento del cancro.

Di recente, i dispositivi bio-microfluidica sono stati fabbricati per studiare le risposte cellulari a fluire forza di taglio, 12 gradienti chimici, 13 e stimoli elettrici 4 in vitro. La fabbricazione di dispositivi bio-microfluidica con polidimetilsilossano (PDMS) o polimetilmetacrilato (PMMA, noto anche come acrilico) ha ridotto con successo il tasso di fallimento di tali esperimenti. Inoltre, utilizzando dispositivi microfluidici base acrilica come prototipo per lo studio soggetti biologici è più semplice rispetto all'utilizzo di PDMS chip. Diverse funzioni nei dispositivi a base acrilica sono stati sviluppati per electrotaxis studio. Tuttavia, nessuno dei disegni precedenti sono in grado di testare contemporaneamente gli effetti di varie condizioni chimiche e il campo elettrico sulle cellule per electrotaxis studio. Così, abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidica-multichannel dual-campo elettrico (MDF)-chip contenente quattro canali indipendenti, cultura e otto differenti condizioni sperimentali in un unico chip.

Il chip MDF base acrilica, prima volta da Hou et al., 8 integra stimolazione elettrica e diversi canali isolati chimicamente. Questi canali isolati chimicamente possono essere utilizzati per la cultura diversi tipi di cellule in un esperimento. La dcEF nei canali viene prodotta da un alimentatore elettrico. Due campi elettrici indipendenti, uno con applicazione di forza del campo elettrico (EFS) e un altro con 0 EFS, sono condotte in ciascun canale chimicamente isolato. In questo modo, il chip fornisce EF coesistenti meglio controllato e stimolazione chimica. Inoltre, i risultati della simulazione numerica della diffusione chimica all'interno del chip MDF indicano che non si è verificata una contaminazione incrociata tra i canali, dopo un periodo sperimentale 24 hr. 8

Rispetto al device riportato da Li et al., 14 il chip MDF fornisce un'area culturale più grande, che permette ulteriori analisi biochimica delle cellule stimolate elettricamente. Inoltre, con grande area di osservazione del chip MDF, più cellule possono essere osservati nel test, per cui l'analisi della velocità di migrazione o di direzionalità delle cellule stimolate elettricamente è più accurata. I modelli di chip singolo canale di studi precedenti riportati da Huang et al. 4 e Tsai et al. 15 consentono solo un tipo di cellula o chimica da testare. Tuttavia, il chip MDF può essere usato per studiare gli effetti di varie sostanze chimiche su electrotaxis, nonché gli effetti della stimolazione elettrica su diversi tipi di cellule. In altre parole, il chip MDF consente lo studio di dose efficace delle dipendenze chimiche.

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Protocollo

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1. Progettazione e Realizzazione della MDF Chip

  1. Disegnare un individuo modello strato acrilico utilizzando il software commerciale, come AutoCAD, e salvare il modello.
    1. Rivedere la progettazione dei quattro strati acrilico modello foglio nella figura 1A e confermare le connessioni inter-strato.
  2. Realizzare tutte le lastre acriliche e il nastro biadesivo per ablazione laser utilizzando una incisione laser CO 2 (figure 1B, 2A, 2B e). 16
    1. Accendere il incisione laser e collegare la macchina al computer portatile di controllo.
    2. Eseguire il software commerciale e aprire il modello progettato nel passo 1.1 cliccando su "pattern file progettato."
    3. Posizionare un pezzo di foglio bianco acrilico o nastro biadesivo sul palco XYZ di incisione laser.
    4. Impostare il fuoco del raggio laser sulla superficie del foglio acrilico o nastro biadesivo con un auto-alignmenbastone t fornite dal produttore del incisione laser.
    5. Inviare il modello progettato per l'incisione laser per la lavorazione diretta del foglio acrilico o nastro biadesivo.
  3. Rimuovere la carta protettiva dalle lastre acriliche con pinze e saltare la superficie pulita con azoto.
  4. Impilare i fogli acrilici e collegare insieme sotto una pressione di 2 kg / cm 2 in un bonder termico per 45 min a 110 ° C per formare il / assemblea canale di stimolazione elettrica di flusso.
  5. Preparare il vetro di copertura microscopio come substrato di coltura cellulare nel chip.
    1. Mettere il vetro di copertura in una vaschetta di colorazione e riempire il vaso con una diluizione di dieci volte del detergente indicato nel listino materiale.
    2. Mettere il vetro di copertura e vaschetta di colorazione in un Steri-pulitore ad ultrasuoni e pulire il vetro di copertura per 15 minuti.
    3. Versare il detergente diluito fuori dalla vaschetta di colorazione, riempire il vaso con acqua distillata, e ripetere il punto 1.5.2 3 volte.
    4. Asciugare il vetro di copertura pulito soffiando con azoto prima di aderire al nastro biadesivo.
  6. Rispettare il vetro di copertura pulita per il / gruppo elettrico canale di stimolazione del flusso con il nastro biadesivo fantasia al punto 1.2.
  7. Rispettare 13 pezzi di adattatori acriliche alle singole aperture del livello 1 del assemblaggio di chip MDF con colla super. L'assemblaggio di chip MDF è quindi completa (Figura 2D).
  8. Sterilizzare il completo assemblaggio di chip MDF con 30 min di irradiazione UV prima dell'uso.

2. Impostazione del Sale bridge di rete del MDF Chip

  1. Prima dell'uso, sterilizzare tutti i tubi di plastica, dita i dadi, e tubi da microcentrifuga mostrati nella Figura 3B impostando un tempo di 15 min a 121 azienda ° C in autoclave.
  2. Collegare i tubi fluoroplastici (Figura 3B-i) al gruppo di chip MDF attraverso l'entrata mediae gli adattatori di uscita illustrati nella Figura 1A.
  3. Collegare la conicità Luer dell'ingresso medio e presa tubi di plastica in Figura 3B-i a 3 vie rubinetti.
  4. Prendere 2,5 ml di CO 2 PBS -equilibrated (PBS) usando una siringa da 3 ml e collegare la siringa al rubinetto a 3 vie del tubo di plastica di ingresso. Collegare una siringa vuota 3 ml al rubinetto a 3 vie del tubo plastico scarico. Le due siringhe sono così interconnessi attraverso il chip MDF.
    NOTA: incubare il PBS in 37 ° C 5% -CO 2 cella cultura incubatore O / N di ottenere emissioni di CO 2 -equilibrated PBS.
  5. Sigillare le aperture del blu e gli adattatori verdi (Figura 1A) sul foglio di PMMA Livello 1 con noci dito-stretto solidi bianchi (Figura 3B-iii).
  6. Riempire i canali del ponte del sale e le camere di coltura con il CO 2 -equilibrated PBS nella siringa descritto in configurazione punto 2.4. Evitarela formazione di bolle.
  7. Avanti, mettere la CO 2 -equilibrated PBS contenenti chip di MDF in 37 ° C 5% -CO 2 cella cultura incubatore per O / N incubazione. Questo permette l'aria disciolta nel nastro biadesivo per formare bolle nelle camere.
  8. Lavare via le bolle nei canali da un rapido flusso PBS nel canale utilizzando le due siringhe. Pompa PBS avanti e indietro se necessario.
  9. Scaricare l'PBS nei canali tramite il rubinetto a 3 vie collegato al tubo di uscita media.
  10. Usando una nuova siringa da 3 ml, prendere 2,5 ml di CO 2 -equilibrated Dulbecco modificato (DMEM) (vedi punto 3.5), e sostituire la siringa collegata alla presa con quello nuovo. Riempire i canali con il medium.
  11. Preparazione della rete ponte salino.
    1. Temporalmente rimuovere i dadi solido (Figura 3B-iii) sulle schede verdi (Figura 1A) e iniettare 3% caldo (> 70 ° C) agarosio nella bri saleDGE canale attraverso l'apertura nella adattatori verde (Figura 1A).
      NOTA: Preparazione di agarosio caldo: Sciogliere 1.5 g di polvere di agarosio in 50 ml di PBS. Sterilizzare impostando un tempo di 20 min tenuta a 121 ° C in autoclave.
    2. Arrestare iniettando l'agarosio quando il liquido riempie tre quarti della lunghezza del canale ponte salino.
    3. Sigillare i pori sulle schede verdi (Figura 1A) avvitando i dadi solidi (Figura 3B-iii) dopo l'iniezione agarosio.
    4. Sostituire i dadi solide sulle schede blu (Figura 1A) con i dadi tubolari traslucidi dita a tenuta (Figura 3B).
    5. Caricare il 3% preriscaldato agarosio nei dadi tubolari (Figura 3B-IV).
    6. Incorpora gli elettrodi Ag / AgCl (Figura 3B-V) nei dadi tubolari (Figura 3B-iv) primasolidificazione del agarosio.
  12. Dopo aver completato la configurazione della rete ponte salino, iniettare le cellule tumorali del polmone CL1-5 nelle camere di cultura, una camera per volta.

3. Preparazione delle cellule tumorali e Set Up per Electrotactic Experiment

  1. Cultura regolare di linea di cellule cancro ai polmoni CL1-5.
    1. Coltivare le cellule tumorali CL1-5 polmonari, ottenuti dalla Prof. Pan-Chyr Yang, 17 in mezzo completo in un pallone di coltura cellulare a 37 75T ° C in atmosfera di CO 2 5%. Il terreno completo è composto da DMEM e siero fetale bovino 10% (FBS). Sub-cultura delle cellule ogni 3 o 4 giorni. Le cellule utilizzate per l'esecuzione di esperimenti electrotaxis sono meno di 25 brani del sorgente originale.
  2. Aggiungere 2 ml di 0,25% tampone tripsina alle crescita esponenziale cellule CL1-5 e incubare per 2 minuti in 37 ° C 5% -CO 2 cella cultura incubatore per detachmen cellularit.
  3. Terminare il processo di distacco con 6 ml di DMEM 10% FBS e centrifugare le cellule a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente. Poi scartare il medio e sospendere il pellet cellulare con 5 ml di PBS.
  4. Contare il numero di cellule in PBS. Dai 1 x 10 6 cellule e centrifugare a 300 g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Eliminare il PBS. Sospendere le cellule con preriscaldata CO 2 -equilibrated DMEM e regolare la densità delle cellule di essere 1 x 10 6 cellule / ml.
    NOTA: incubare il terreno completo in 37 ° C 5% -CO 2 cella cultura incubatore O / N per ottenere la CO 2 -equilibrated DMEM.

4. Impostare per Electrotactic Experiment

  1. Dalla presa del chip MDF, iniettare 0,3 ml, 1 × 10 6 / ml, delle cellule nel chip.
  2. Incubare il chip MDF cellule testa di serie nell'incubatrice coltura cellulare (fissato a 37 ° C e 5% CO 2) per 2-4 ore.
  3. Configurazione di MDF microSistema fluidica.
    1. Installare il sistema microfluidica MDF su un calorifero trasparente di indio e stagno vetro ossido (ITO). Misurare la temperatura del chip MDF con una termocoppia di tipo K ritagliato tra il chip MDF e vetro ITO. Controllare il riscaldatore ITO con un controller proporzionale-integrale-derivativo (PID). Impostare la microfluidica temperatura del sistema di incubazione MDF a 37 ° C con il regolatore PID.
      NOTA: La fabbricazione del riscaldatore ITO e la messa a punto del sistema di celle di riscaldamento cultura sono descritte nelle relazioni precedenti 18,19.
    2. Montare l'assemblaggio di chip MDF temperatura controllata sul XYZ palco motorizzato controllato dal computer su un microscopio invertito. L'uso dello stadio motorizzato è descritta nel passaggio 5.1. Pompare il terreno completo nelle camere di cultura attraverso le prese con una pompa a siringa a quattro canali.
  4. Pompa terreno completo nel chip MDF ad una portata di 20 l / h. I rifiuti cultura dal fuorilascia viene raccolto nei tubi microcentrifuga (indicati come "rifiuti" in Figura 3A).
  5. Incubare le cellule per un altro 16-18 ore a 37 ° C nel chip MDF.
  6. Per sostituire il mezzo, pompare il terreno contenente 50, 25, 5, 0 e inibitore chinasi pM, rispettivamente, in ciascuna camera di coltura ad una portata di 20 l / min per 10 min.
    NOTA: Preparare una soluzione madre 10 mm di Rho-associata proteina chinasi inibitore Y27632 con l'aggiunta di 3 ml di acqua sterile per l'inibitore della chinasi 10,6 mg. Diluire la soluzione madre 10 mm a 50, 25 e 5 micron, rispettivamente con il 10% FBS DMEM.
  7. Incubare le cellule della chinasi per altri 60 min a 37 ° C. Impostare la portata media di 20 l / h. Utilizzare la stessa temperatura della cultura e portata sopra descritto nei punti successivi.
  8. Utilizzare cavi elettrici per collegare un alimentatore CC al chip MDF tramite gli elettrodi Ag / AgCl sul chip.
  9. Collegare in serie un amperometro in il circuito elettrico. Utilizzare l'amperometro per controllare la corrente elettrica nel chip MDF.
  10. Accendere l'alimentazione in corrente continua e regolare la corrente di 86.94 μA amperometro regolando la tensione di alimentazione compresa tra 15 e 19 V.
    NOTA: Considerando la legge di Ohm, E = I / (σA eff), dove I è la corrente elettrica che scorre attraverso il materiale sfuso, cioè, il terreno di coltura nella camera electrotactic, σ (= 1,38 Ω -1 m - 1) è il conducibilità del terreno di coltura, A eff (= 0.21 mm 2 per una larghezza 3 mm x 0,07 mm di altezza) è l'area della sezione trasversale efficace della camera electrotactic, e la corrente elettrica (I) necessario per generare una 300 mV / mm EF nel chip MDF è 86.94 μA.

5. Acquisizione e analisi di cellule Immagini

  1. Controllare il palco motorizzato con un programma MATLAB GUI. Con il sistema microfluidico MDF montato sul microscope, spostare il chip alle regioni di osservazione usando il tavolino motorizzato.
  2. Immagini di cellule registrare utilizzando una fotocamera digitale reflex (SLR) montata sul microscopio.
  3. Prendere immagini microscopiche utilizzando una lente obiettivo 4X ad intervalli di 15 minuti per 2 ore.
  4. Analisi migrazione cellulare.
    1. Eseguire NIH ImageJ 1.47 V.
    2. Analizzare la distanza dagli iniziali alle posizioni finali del baricentro della cellula.
    3. Vai su "File" → "Importa" → "Sequenza d'immagini", e importare le nove immagini per l'analisi migrazione cellulare. La prima immagine è il risultato del tempo zero, e l'ultima immagine è il risultato di 120 min.
    4. Andare su "Analizza" → "Imposta misure" e selezionare la casella accanto a "Centroide"
    5. Fare clic sull'icona "a mano libera selezioni".
    6. Descrivere il bordo delle celle selezionate nella prima immagine.
    7. Vai su "Modifica" → "Selezione" → "Aggiungi a Manager"
    8. Vai all'immagine nono e raffigurano il bordo delle stesse celle selezionate sulla prima immagine. Le posizioni delle celle possono essere rintracciate utilizzando la seconda all'ottavo immagini.
    9. Vai su "Modifica" → "Selezione" → "Aggiungi a Manager"
    10. Ripetere i passaggi da 5.4.5 a 5.4.9 per raccogliere i dati da 90 a 100 celle.
    11. Vai "Analisi" → "Measure" per ottenere il risultato delle posizioni iniziale e finale delle celle selezionate.
      NOTA: La velocità di migrazione è definita come la lunghezza media movimento cellulare per ora. La direzionalità è definita come il coseno, dove è l'angolo tra il vettore del dcEF (dall'anodo al catodo) e il vettore dal punto di partenza di una cella per la sua posizione finale. La direzionalità è -1 per cellule migranti verso l'anodo e uno per le cellule migrano verso il catodo. Per un gruppo di casualmente migrata cellule, la direzionalità è 0. 2

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Risultati

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Fabbricazione e montaggio del dispositivo MDF

Un diagramma schematico del chip MDF base acrilica è mostrato nella Figura 1A. Quattro strati acrilici, un vetro di copertura, 13 adattatori acrilici, e un pezzo di nastro biadesivo sono stati utilizzati per l'assemblaggio del chip MDF completato (Figura 2D). Ci sono solo quattro canali indipendenti di cultura nel ...

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Discussione

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Abbiamo trovato il processo di aderire adattatori acrilico su livello 1 del chip MDF di essere ingannevole. L'applicazione di appena 1 o 2 ml di colla super è sufficiente per aderire saldamente all'adattatore sul chip MDF. Grandi quantità di colla comportato un polimerizzazione incompleta del super colla e mancato adempimento. Una volta che gli adattatori acrilici erano saldamente rispettati sul chip MDF, perdite di liquido nel sistema microfluidico raramente verificato. Inoltre, O / N incubazione all'intern...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è sostenuto finanziariamente dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan (Contratto n. MOST 103-2113-M-001 -003 -MY2) e il Programma di ricerca sulle nanoscienze e le nanotecnologie, Academia Sinica, Taiwan.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagente
DMEM medioGibco,Invitrogen, USA12800-017
Siero fetale bovinoGibco,Invitrogen, USA16000-044
TripsinaGibco,Invitrogen, USA25200-072
PBSBasic LifeBL2651
Y-27632 (cloridrato)Cayman Chemical Co10005583
agarosioLONZO, USASiringa SeaKem LE AGAROSE
Terumo3 ml con rubinetto conico
3 vieNiprocon cono
PMMA (acrilico)HiShiRon Industries CO., Ltd, Taiwanspessore 1mm, adattatore acrilico 2mm
KuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwan1/4-28 attacco, dado personalizzato 10x10x6 mm
Thermo Fisher Scientific Inc.UPCHURCH: P-206x, P-200x, F120x, P-659, P-315x
Vetro di copertura del microscopioDeckglä ser, Germania24x60 mm
nastro biadesivo3MPET 8018
super colla3MScotch Liquid Plus Super Glue
TFD4 detergenteFranklab, FranciaTFD4
pulitore a ultrasuoni steriLEO ULTRASONIC CO., LTD., Taiwan
Thermo bonderKuanMin Technology Co., Ltd, Taichung, Taiwanscriber
Gruppo LTT, TaiwanISL-II
proporzionale-integrale-derivativo (PID)controller JETEC Electronics Co., JapenTTM-J40-R-AB,
termocoppia di tipo KTECPELTPK-02A
pompa a siringa a 4 canaliKdScientific, USAAlimentatore CC 250P
GWInstek, Taiwan
Stadio motore X-Y-ZTanLian, E-O Co. Ltd., Taiwan
Olympus, GiapponeCKX41
Canon, Giappone60D
LueraLuer laser CO2 personalizzato microscopio invertito personalizzato Fotocamera reflex digitale

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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