Organoidi come modello per le malattie infettive: cultura dei diritti dell'uomo e organoidi stomaco murini e microiniezione dell'Helicobacter Pylori

Sommario

Le colture derivate da cellule staminali hanno un enorme potenziale per modellare le malattie infettive. Qui viene descritta la coltura di organoidi gastrici di topo e umani derivati da cellule staminali adulte. Gli organoidi vengono microiniettati con l'agente patogeno gastrico Helicobacter pylori.

Abstract

Recentemente i biologi delle infezioni hanno impiegato colture derivate da cellule staminali per rispondere alla necessità di nuovi e migliori modelli per studiare le interazioni ospite-patogeno. Sono state utilizzate tre fonti cellulari: cellule staminali embrionali (ESC), cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) o cellule staminali adulte. Qui, viene descritta la coltura di organoidi gastrici di topo e umani derivati da cellule staminali adulte e utilizzata per l'infezione con il patogeno gastrico Helicobacter pylori. Le ghiandole gastriche umane sono isolate dal materiale di resezione, seminate in una matrice basale e incorporate in un terreno contenente fattori di crescita epidermico (EGF), R-spondina, Noggin, Wnt, fattore di crescita dei fibroblasti (FGF) 10, gastrina e inibitore del fattore di crescita trasformante (TGF) beta. In queste condizioni, le ghiandole gastriche crescono in organoidi tridimensionali contenenti 4 lignaggi dello stomaco. Gli organoidi si espandono indefinitamente e possono essere congelati e scongelati in modo simile alle linee cellulari. Per gli studi sulle infezioni, i batteri vengono microiniettati nel lume degli organoidi. Gli organoidi infetti vengono elaborati per l'imaging. I metodi descritti possono essere adattati ad altri organoidi e alle infezioni da altri batteri, virus o parassiti. Ciò consente lo studio dei cambiamenti indotti dall'infezione nelle cellule primarie.

Introduzione

Lo studio di patogeni si basa su adeguati sistemi modello per imitare l'infezione in vivo. Per alcuni agenti infettivi, adeguati sistemi modello sono carenti, mentre alcuni dei sistemi utilizzati sono ben lungi dall'essere ottimale. Un esempio è il batterio gastrico Helicobacter pylori (H. pylori), che è causalmente legata alla sviluppo del cancro gastrico. Tuttavia, in assenza di un sistema di coltura cellulare più adatto, molti studi che mirano ad analizzare i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo del cancro linee cellulari tumorali uso, che rappresentano il punto finale della cascata cancerose. , Cellule non trasformate primarie ....

Protocollo

1. Istituzione di gastrico organoide Cultura

Nota: Questo protocollo può essere utilizzato per l'isolamento delle ghiandole gastriche da mouse o tessuti umani. Si consiglia di usare il tessuto di circa 1 cm². Tessuto umano può essere ottenuto da resezioni gastriche o biopsie.

1. Preparazione del materiale
   Nota: La matrice seminterrato utilizzato è Matrigel. Mantenere la matrice seminterrato su ghiaccio in ogni momento. Conservare la matrice seminterrato a -20 ° C e scongelare su ghiaccio prima dell'uso. Terreno di base si riferisce ad Avanzato DMEM / F12 integrato con HEPES; una fonte di glutammina appropriato come ....

Risultati

Questo protocollo permette isolamento delle ghiandole gastriche (Figura 2). Ghiandole vengono seminate in matrice seminterrato, che solidifica come goccia all'interno di un pozzo, fornendo una struttura tridimensionale 3 ricco di laminina e collagene per consentire le ghiandole crescono in organoidi (Figura 3). Organoidi tipicamente iniziano come piccole cisti e entro 12-16 giorni, si espandono in sfere con un diametro di 50-300 micron (Figura 4). Alcuni organoidi r.......

Discussione

Questo protocollo descrive l'uso di organoidi primari in continua espansione e non trasformati da cellule staminali adulte per la biologia delle infezioni. Passaggi critici sono i) l'isolamento delle ghiandole vitali, ii) l'espansione degli organoidi e iii) la microiniezione. Di seguito sono riportati alcuni suggerimenti per modifiche, risoluzione dei problemi e considerazioni tecniche.

Rispetto ad altri metodi di isolamento, che utilizzano un vigoroso agitamento o pipettaggio per rilasciare .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Medio
HEPES	Invitrogen	15630-056
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-028
Matrigel, GFR, privo di fenoli	BD	356231
GlutaMAX	Invitrogen	35050-079	Concentrazione madre 200 mM, concentrazione finale 2 mM
B27	Invitrogen	17504-044	Concentrazione madre 50 x, concentrazione finale 1x
N-Acetilcisteina	Sigma-Aldrich	A9165-5G	Concentrazione madre 500 mM, concentrazione finale 1 mM
EGF ricombinante murino	Invitrogen	PMG8043	Concentrazione madre 500 &; g/ml, concentrazione finale 50 ng/ml
FGF10 ricombinante umano	Peprotech	100-26	Concentrazione madre 100 µ g/ml, concentrazione finale 200 ng/ml
TGFβ i A-83-01	Tocris	2939	Concentrazione di stock 500 µ M, concentrazione finale 2 µ M
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Concentrazione madre 1 M, concentrazione finale 10 mM
[Leu15]-Gastrin	Sigma-Aldrich	G9145	Concentrazione di stock 100 µ M, concentrazione finale 1 nM
RHOKi Y-27632	Sigma-Aldrich	Y0503	Concentrazione stock 10 mM, concentrazione finale 10 µ M
Wnt3A Terreno			Linea cellulare stabile generata nel laboratorio Clevers. Concentrazione finale 50%. Le celle possono essere ottenute da Hans Clevers.
		condizionato R-spondina1	Linea cellulare stabile generata nel laboratorio Kuo. Concentrazione finale 10%. La linea cellulare può essere ottenuta da Calvin Kuo, Stanford.
		condizionato con Noggin	Linea cellulare stabile generata nel laboratorio Clevers. Concentrazione finale 10%. Le celle possono essere ottenute da Hans Clevers.
R-spondin3	R& D	3500-RS/CF	Fonte alternativa per R-spondina. Questo è stato testato su organoidi intestinali umani (1 & micro; g/ml), ma non ancora su organoidi gastrici.
Noggin	Peprotech	120-10	Fonte alternativa per la testa. Questo è stato testato su organoidi intestinali umani (100 ng/ml), ma non ancora su organoidi gastrici.
TrypLE express	Life Technologies	12605036	Soluzione di dissociazione enzimatica
CoolCell® Contenitori per il congelamento delle cellule senza alcool	biocision	BCS-405
Mezzo di congelamento per colture cellulari di recupero	Invitrogen	12648-010
Antibiotics
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Una composizione antibiotica contro batteri e funghi. È utile dopo l'inizio di una cultura. Per la coltura a lungo termine è possibile passare ad altri antibiotici o a nessuno.
Penicillina/streptomicina	Invitrogen	15140-122	Concentrazione di riserva 10.000/10.000 U/ml, concentrazione finale 100/100 U/ml. Può essere utilizzato in alternativa a Primocin in coltura a lungo termine.
Altro
Pinzette	Neolabs	2-1033	pinzette con punte sottili sono utili per la rimozione dello strato muscolare dal tessuto.
4 Pozzetti Multipiatti	Thermo Scientific	144444	È possibile utilizzare altri Multipiatti. Questi sono stati particolarmente utili per le microiniezioni perché hanno un bordo esterno basso e consentono una maggiore mobilità del manipolatore.
Micromanipolatore	Narishige	M-152
Microiniettore	Narishige	IM-5B
Stereomicroscopio	Leica	MZ75
Banco di lavoro	Aria		Realizzato su misura per adattarsi allo stereomicroscopio in condizioni ML2
Capillari	Apparato Harvard	GC100T-10	1 mm di diametro esterno, 0,78 mm di diametro interno.
Estrattore per micropipette	Sutter Instruments		micropipette marrone fiammeggiante
anti anticorpo Cag A	Santa Cruz	sc-25766

condizionato Terreno Terreno Le pulita Estrattore per