Specifiche Step-ordinamento di mouse spermatidi mediante citometria di flusso

Sommario

Descriviamo una strategia di selezione per spermatidi di topo utilizzando la citometria a flusso. Gli spermatidi sono suddivisi in quattro popolazioni altamente pure, tra cui rotonda (fasi di spermiogenesi 1-9), allungamento precoce (fasi di spermiogenesi 10-12), allungamento tardivo (fasi di spermiogenesi 13-14) e spermatidi allungati (fasi di spermiogenesi 15-16). La colorazione, la dimensione e la granulosità del DNA sono utilizzate come parametri di selezione.

Abstract

La differenziazione di spermatidi topo è uno processo critico per la produzione di un gamete maschile funzionale con un genoma intatto da trasmettere alla generazione successiva. Finora, gli studi molecolari di questa transizione morfologica sono stati ostacolati dalla mancanza di un metodo che consente un'adeguata separazione di queste importanti fasi di differenziazione spermatid per analisi successive. Precedenti tentativi di gate adeguato di queste cellule in citometria a flusso potrebbe essere stato difficile a causa di un particolare aumento della fluorescenza del DNA in spermatidi in fase di rimodellamento della cromatina. Sulla base di questa osservazione, noi forniamo i dettagli di un semplice sistema di citometria a flusso, che permette la purificazione riproducibile di quattro popolazioni di spermatidi topo fissate con etanolo, ognuno dei quali rappresenta uno stato diverso nel processo di rimodellamento nucleare. L'arricchimento della popolazione è confermato per mezzo di marcatori specifici per step e criteri morfologici. Gli spermatidi purificati possono essere utilizzati per genomica e proteomic analisi.

Introduzione

Gli spermatidi rotondi aploidi si differenziano in spermatozoi attraverso un processo chiamato spermiogenesi. Ciò comporta molte fasi diverse, tra cui l'acquisizione di un flagello, il rimodellamento della cromatina e del citoscheletro, la condensazione del nucleo e la perdita della maggior parte del citoplasma. Questi eventi cellulari unici devono essere finemente regolati al fine di produrre un gamete funzionale maturo con un genoma intatto adatto alla fecondazione. La spermiogenesi difficilmente può essere studiata in vitro, poiché finora nessun sistema di coltura cellulare affidabile è stato in grado di supportare la progressione attraverso le diverse fasi del processo. Inoltre, le attuali tecniche in vitro portano a una scarsa resa^1,2. In vivo, le transizioni corrette attraverso le diverse fasi della spermiogenesi sono cruciali per la naturale integrità funzionale del gamete maschile. La purificazione di successo degli spermatidi secondo le loro fasi di differenziazione non è mai stata raggiunta con un livello di arricchimento sufficiente a consentire la caratterizzazione molecolare della spermiogenesi. Ad esempio, la purificazione dei passaggi chiave del differenziamento spermatidale sarebbe particolarmente utile per studiare lo sviluppo dell'acrosoma, la formazione del midpiece³, la dinamica della giunzione cellulare⁴, la dinamica dell'RNA⁵, il processo di rimodellamento della cromatina^6,7 o la stabilità genomica⁸. La purificazione degli spermatidi è stata ostacolata dalla loro progressiva trasformazione morfologica, dalla mancanza di biomarcatori esterni stadio-specifici noti e dalla loro particolare forma e dimensione.

Sebbene la maggior parte delle cellule germinali maschili mostri una relazione diretta tra la colorazione del DNA e la ploidia (contenuto di DNA), abbiamo notato che tale correlazione positiva non è più applicabile agli spermatidi. Ciò deriva dalla nostra prima osservazione che le sezioni dei tubuli seminiferi mostrano un'intensità variabile di colorazione del DNA durante le diverse fasi della spermiogenesi. Sebbene la colorazione del DNA sia coerente con il loro set di cromosomi aploidi dalle fasi di spermiogenesi da 1 a 7 (spermatidi rotondi), abbiamo osservato un forte aumento dell'intensità della fluorescenza con DAPI o SYTO 16 intorno all'inizio della riorganizzazione nucleare e del rimodellamento della cromatina (fase 8 della spermiogenesi) che raggiunge un picco all'inizio della condensazione nucleare (fasi 11-12 della spermiogenesi). In seguito alla condensazione del nucleo, l'intensità della colorazione del DNA diminuisce fino alla spermiazione (fase 16 della spermiogenesi). Abbiamo ipotizzato che questo fosse probabilmente associato alla formazione della loro peculiare transizione di struttura cromatinica in cui gli istoni sono sostituiti da protamine. Abbiamo quindi sviluppato un metodo di citometria a flusso affidabile che consente la separazione degli spermatidi utilizzando la variazione dell'intensità del DNA degli spermatidi come parametro di selezione principale.

Viene descritto un semplice approccio di citometria a flusso per separare gli spermatidi di topo con elevata purezza (95-100%) in base al loro contenuto di DNA apparente (colorazione SYTO16), alle dimensioni e alla granulosità. Gli spermatidi sono separati in quattro popolazioni; Spermiogenesi Fasi 1-9, 10-12, 13-14 e 15-16. Gli spermatidi purificati sono adatti per l'analisi genetica/genomica, nonché per le applicazioni proteomiche, come descritto in una recente pubblicazione del nostro gruppo⁹.

Protocollo

Cura degli animali era in conformità con la cura degli animali e l'uso comitato Université de Sherbrooke.

1. Preparazione del tubo

1. Il giorno prima separazione delle cellule, aggiungere 1-2 ml di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS) a 5 ml in polipropilene provette con fondo arrotondato, e di 15 ml e 50 ml tubi in polipropilene coniche.
   Passaggio fondamentale: Assicurarsi che ogni tubo utilizzato nel protocollo è rivestito.
   Nota: Rivestimento FBS impedisce alle cellule germinali di attaccarsi alle pareti del tubo.
2. Mescolare lentamente O / N per inversione a 4 ° C per rivestire i tubi in modo uniforme con un rotatore.
3. Il giorno successivo, togliere FBS da tubi rivestiti per decantazione.
   1. * Passo critico: Assicurarsi che i 5 ml in polipropilene provette con fondo arrotondato e le 15 e 50 ml tubi utilizzati per la preparazione delle cellule (protocollo passaggi 2,1-2,11) sono completamente svuotati di FBS per prevenire Fanning (ad esempio, deviazione imprecisa dei torrenti laterali). Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere le FBS.
      Nota: residua FBS in tubi prima di smistamento può portare a una perdita di cellule o la contaminazione di altri tubi utilizzati durante l'ordinamento delle cellule,
   2. Lascia un piccolo volume residuo di FBS (circa 100-200 ml) in polipropilene da 5 ml tubi tondi fondo utilizzati per la raccolta delle cellule purificate.

2. Preparazione delle cellule

1. Sacrifica un topo maschio in anestesia con O ₂ / isoflurano (induzione al 5% poi mantenuto al 2%), seguito da _CO 2 asfissia.
2. Accise e decapsulate entrambi i testicoli e tritare con piccole forbici in 500 ml di smistamento tampone in una provetta da 1,5 ml.
3. Cellule germinali Flush da tubuli seminiferi di dolce pipettando su e giù nel tubo 1,5 ml, prima con una punta tronca 100-1000 ml, e poi con un intatto punta 100-1000 ml.
4. Rimuovere i detriti e ciuffi dopo passo una filtrazione con un colino cella 40 micron e raccogliere filtrato nei 50 ml prev tubo conicoiously rivestito con FBS al punto 1.
5. Lavare il filtro una volta con tampone di smistamento fino ad un volume totale di 3 ml e trasferimento filtrato nel tubo da 15 ml precedentemente rivestito in passaggio 1.
6. Aggiungere 16 ml di 50 mM EDTA pH 8 per millilitro di sospensione cellulare (48 ml per 3 ml) in modo da ottenere una concentrazione finale di 0,8 mM EDTA.
7. Per risolvere le cellule germinali, lentamente aggiungere 3 volumi di ghiacciata etanolo al 100% con un 10 ml pipetta con agitazione (vortex a bassa velocità), che produrrà una sospensione lattiginosa.
   Step critico: lentamente aggiungendo etanolo è cruciale e importante preservare l'integrità della preparazione cellulare. Abbiamo notato che la rapida aggiunta di etanolo provoca la lisi delle cellule con una conseguente notevole diminuzione dell'efficienza della selezione. Per una sospensione cellulare 3 ml, 9 ml di etanolo dovrebbe essere aggiunto in circa 1 min.
8. Incubare le cellule in ghiaccio per 15 minuti con miscelazione occasionali per inversione.
9. Sospensione cellulare a 800 xg Centrifugare per 5 min e rimuovere il chiarosurnatante.
10. Risospendere delicatamente le cellule germinali fissati in 2 ml di cernita tampone.
11. Aggiungere 4 ml di colorante DNA SYTO16 (soluzione 1 mM in DMSO) e incubare per almeno 30 min (protetto dalla luce).
    Nota: I risultati migliori si ottengono utilizzando ordinamento SYTO16 poiché è un colorante DNA permeabile che è facilmente incorporato in nuclei altamente compattati di spermatidi.

Sorter 3. cellulare Set Up

Viene utilizzato 20 parametri cell sorter BDFACSAria III Ecco, un 4-Laser (rosso 405 nm - viola, 488 nm - blu, 561 nm - - giallo-verde, 633 nm): Nota. Il software BD FACSDiva 6.1.3 viene utilizzato per visualizzare e analizzare i dati. Le impostazioni possono variare a seconda del tipo di sorter utilizzato.

1. Sterilizzare il sorter FACS eseguendo il 70% di etanolo come fluido di trasporto durante la procedura di spegnimento fluidica (menu "Cytometer" del software) prima di smistamento. Selezionare "Citometro" nella barra degli strumenti del software e scegliere "sh Fluidicutdown ". Seguire la procedura citati dai processi.
2. Preparare e filtrata 1x PBS con un filtro da 0,22 micron in modo da eliminare eventuali cristalli e contaminanti. Riempire il serbatoio guaina la linea di saldatura superiore all'interno del serbatoio.
3. Avviare il software ed eseguire il login. Avviare il sorter FACS a scaldare i laser per almeno 30 minuti prima di smistamento. Eseguire due processi di avvio fluidici per scovare l'etanolo dai fluidica. Selezionare "Citometro" nella barra degli strumenti del software e scegliere "avvio Fluidic". Seguire i passaggi indicati dai processi.
   Nota: Questo ripristina fluidica con normale liquido guaina (1x PBS).
4. Pulire il blocco di ordinamento e le piastre di deflessione con acqua distillata e asciugare accuratamente. Sonicare un ugello 100 micron posto in un tubo di acqua distillata per 2 minuti in un bagno di sonicazione. Pulire a fondo l'ugello.
5. Inserire l'ugello 100 micron nella cella di flusso e ruotare l'ugello leva di bloccaggio in senso orario al 12Posizione hr. Impostare la pressione della guaina di 20 psi.
6. Accendere il torrente e regolare l'ampiezza di ottenere valori di riferimento per la frequenza (circa 30), Goccia 1 (circa 150) e Gap (circa 12), e di stabilire un modello di gocce di troncaggio stabile (gocce pochi satellite). Spegnere attenuazione.
7. Assicurarsi che il flusso sia diritto e colpisce il centro dell'aspiratore rifiuti cambiando l'angolo del blocco genere. Nota: Un ugello 130 micron a 10 psi è stato anche testato ed è stato trovato nessuna differenza evidente.
8. Impostare ritardo laser a 0 per il blu, -77,39 per il rosso, 37.33 per il viola e -39,85 per i laser di colore giallo-verde.
9. Impostazione delle aree di scala di 1,14 per il blu, 1.0 per il rosso, 0,75 per la viola e 0.96 per i laser di colore giallo-verde.
10. Utilizzando un Sort Test (nella finestra "laterale Stream" del software), fare in modo che i flussi laterali non sono Fanning. Nella finestra "laterale Stream", regolare i cursori di tensione di ogni flusso lato in modo che hanno colpito il middle di tubo di raccolta di prova. Se il flusso centrale non è stretto, regolare il 2 ^{°, 3 °} e 4 impostazioni ^° drop per limitare il flusso centrale.
11. Avviare l'installazione citometro e tracking (CS & T) applicazione nel (menu "Cytometer") del software.
12. Utilizzare l'Installazione e monitoraggio perline citometro a 1 goccia per 350 ml per automatizzare la caratterizzazione e il monitoraggio delle prestazioni citometro utilizzando le istruzioni del produttore.
13. Chiudere l'applicazione CS & T. Applicare impostazione CS & T, assicurarsi che i parametri di flusso consentono ancora un andamento stabile delle gocce di troncaggio, e attivare il pulsante di Sweet Spot come descritto nelle istruzioni del produttore (nella "finestra breakoff").
14. Ottimizzare il valore di goccia di ritardo utilizzando perline fluorescenti (vedi Tabella dei Materiali).
    1. Installare i tubi di raccolta nel supporto. Aprire la porta blocco tipo. Nella finestra "laterale Stream", accendere la tensione, quindi selezionare "Test di sorta "e fare clic sul pulsante aspiratore cassetto per aprire il cassetto e avere accesso ai tubi di raccolta.
    2. Ottimizzare i flussi laterali così vanno al centro del tubo. Regolare i valori e cursori come necessario.
    3. Chiudere la porta blocco tipo e assicurarsi di regolare il quadrante del micrometro per ottenere il posto tallone luminoso al centro. Cassetto rifiuti deselezionare, prova sorta e la tensione. Rimuovere i tubi di raccolta.
    4. Ottimizzare il ritardo calo secondo le istruzioni del fabbricante.
       1. In breve, agitare tallone fiala vigorosamente e diluire 1 goccia di perline in 0,5 ml di PBS.
       2. Utilizzando le istruzioni del produttore, impostare il ritardo goccia utilizzando il modello esperimento goccia Ritardo disponibili nel software. In alternativa, utilizzare la funzione Auto Goccia Ritardo per impostare il ritardo goccia.
       3. Caricare il tubo di perline fluorescenti e regolare la portata fino a quando il tasso di soglia è ~ 3.000 a 4.000 eventi / secondo. Impostare la precisione sorta di "iniziale" e finalemente a "sintonizzare" nella finestra "Layout Sort". Selezionare il filtro ottico e ordinare perline. Regolare il ritardo di goccia fino ~ 100% sono allineati a sinistra.
          Nota: Questo passaggio è fondamentale per fare in modo che le cellule di interesse specie in un flusso laterale. Le perline e il filtro ottico sono utilizzati per ottenere vicino a una deviazione gocciolina 100%.
15. Posizionare un ND (neutral density) Filtro FSC 1.5 all'estremità sinistra del blocco rilevatore FSC. Impostare l'estensione della finestra di 2.00 ms e il ridimensionamento FSC area a 1,00 (nella scheda "Laser" nella finestra "citometro").
16. Prima di caricare provetta posizionare una linea di filtro campione di 50 um alla fine della linea di campionamento per evitare grumi. Per farlo, selezionate "Modifica filtro campione" nel menu "citometro".
17. Testare la composizione del fluido campione per ottenere una buona separazione senza ventaglio tra flusso laterale e per evitare che le cellule di attaccarsi alla poliprotubi ne.
    1. Caricare la provetta, accendere le piastre di deflessione e selezionare "Test tipo" con il cassetto chiuso. Guardate i flussi laterali in caso di separazione senza troppi Fanning.
       Nota: Fanning è probabilmente dovuto ad un alta concentrazione di proteine ​​nel tampone.
18. Caricare la provetta nello strumento FACS. Selezionare un campione di agitazione 300 rpm ed una temperatura del campione di 4 ° C. Selezionare "Acquisire dati" nella "Acquisizione Dashboard".
19. Se necessario, diluire il campione per ottenere un tasso di evento appropriato ad un massimo di 5000 eventi / sec (ad una portata massima di 3,0). Rigorosamente rispettare questi limiti in modo da mantenere la purezza delle cellule ordinati.
20. Per analizzare e ordinare le celle, ottimizzare il valore di soglia FSC per eliminare i residui senza interferire con la popolazione di interesse. In scala logaritmica, regolare la tensione del rivelatore con il filtro 530/30 tubo fotomoltiplicatore (PMT) per rendereAssicurarsi che il segnale di fluorescenza della popolazione totale si inserisce all'interno della scala, e porta sulla popolazione positivo (Figura 1, Gate 1).
21. Produrre un Forward Scatter-zona (FSC-A) / Side Scatter-zona (SSC-A) diagramma della popolazione positivo SYTO16 e regolare la FSC-A a circa 110 V in scala lineare, e la SSC-A a circa 150 V in scala logaritmica per visualizzare tutti gli eventi escludendo molto grandi cellule e aggregati cellulari.
22. Nella finestra "Ordina Layout", impostare il "modo Ordinamento Precision" a "purezza 4-way" (maschera Yield: 0, Purezza Maschera: 32, Fase Maschera: 0). Selezionare "Continua" dal menu "Target Eventi" per l'ordinamento continuo.
23. Aggiungere popolazioni per ordinare nel campo corrispondente ai tubi (nella finestra "Sort Layout"). Popolazioni posto con frequenze più alte al centro e quelli con frequenze più basse alle estremità. Impostare le piastre di tensione a 2.500 V. Durante l'ordinamento, mantenere la raccolta del campione tUBE su ghiaccio.

4. cella Ordinamento

1. Immediatamente prima di smistamento, celle filtranti usando un filtro 50 micron in un precedentemente rivestito 5 ml in polipropilene tubo tondo fondo.
2. Lavare il filtro a lungo con 1-2 ml di cernita tampone.
3. Cellule germinali Ordina fissi utilizzando un attrezzato laser cell sorter 488 nm secondo lo schema di gating dettagliato in figura 1. Raccogliere frazioni purificate in polipropilene 5 ml provette con fondo arrotondato precedentemente rivestite nella sezione 1 su ghiaccio.
   1. Assicurarsi che 100-200 ml di FBS è conservato nei tubi di raccolta per evitare incollaggio delle cellule ordinati alla parete del tubo.
   2. Assicurarsi che la concentrazione di SYTO16 è saturare per evitare fluttuazioni di fluorescenza durante il periodo di smistamento. SYTO16 è saturare quando non c'è un'ulteriore variazione di intensità di colorazione della cellula al 488 parametro Alexa Fluor (colorazione DNA) nella grafica smistamento. Se necessario, aggiungere 1 ml diSYTO16 al tubo di smistamento per raggiungere la saturazione.
   3. Visualizzare gli eventi totali su un grafico che visualizza i seguenti parametri: numero di eventi vs Alexa Fluor 488-A.
   4. Selezionare le celle colorazione DNA positivi con Gate 1, come mostrato in Figura 1.
      1. Celle di visualizzazione dalla porta 1 su un grafico con SSC-A vs FSC-A come parametri
         1. Selezionare le celle con Gate 2, come mostrato in Figura 1.
         2. Celle di visualizzazione dalla Porta 2 su un grafico utilizzando FSC A vs Alexa Fluor 488-A come parametri.
         3. Selezionare celle con Gate 5 e 6 su Gate Porta 2 grafica, come mostrato in Figura 1.
         4. Visualizza separatamente Gate 5 e Gate 6 sulla grafica che utilizzano Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A come parametri.
         5. Selezionare spermiogenesi i passaggi 1-9 spermatidi sul Gate 5 grafica e spermiogenesis passaggi 10-12 spermatidi sul cancello 6 grafici, come mostrato in Figura 1.
      2. Displaycellule dalla porta 1 su un grafico utilizzando FSC A vs Alexa Fluor 488-A come parametri
         1. Selezionare le celle con Gate 3 e Gate 4, come mostrato in Figura 1.
         2. Visualizza separatamente Gate 3 e Gate 4 sulla grafica che utilizzano Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A come parametri.
         3. Selezionare spermiogenesi passaggi 13-14 spermatidi sul Gate 3 grafica e spermiogenesis passaggi 15-16 spermatidi sulla Porta 4 grafico, come mostrato in Figura 1.

Risultati

Strategia di gating utilizzato con citometria a flusso

La figura 1 rappresenta la strategia di gating utilizzato in citometria a flusso per ordinare quattro popolazioni spermatidi altamente puri. In breve, le cellule con colorazione del DNA positivo (Alexa Fluor 488-A) sono selezionati prima con Porta 1. spermatidi da spermiogenesis Predellino 1-12 sono selezionati (Porta 2) su un diagramma a punti che mostra ...

Discussione

Cellule spermatogenic sono sempre stati difficili da studiare data la complessità del seminifero, nonché il limitato successo della coltura in vitro. Nel corso degli anni, molti approcci per purificare cellule germinali di varie specie sono stati sviluppati. Tecniche di sedimentazione che utilizzano purificazione gravità con Percoll o bovina siero gradienti di albumina solitamente forniscono una buona resa di cellule germinali intatte, ma mancano di adeguata definizione tra alcuni tipi di cellule come le cellul...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Isoflurano	ABBOT	05260-05	Per l'anestesia del topo prima dell'eutanasia
Siero fetale bovino	Wisent	90150	Per il rivestimento
di tubi 1x PBS
EDTA	BioShop	EDT	Per la preparazione del tampone di smistamento
HEPES	Sigma	H	Per la preparazione del tampone di smistamento
100% Etanolo	Les alcools de commerce	092-09-11N	Per la fissazione cellulare
SYTO 16	Life Technologies	S7578	Colorazione del DNA
5 ml di provette a fondo tondo in polipropilene	BD	Falcon 352063	Raccolta di cellule selezionate
15 ml di provette a fondo conico	in polipropilene PROgene	1500
Provette da 50 ml in polipropilene a fondo conico	PROgene	5000
Vaporizzatore anestetico TEC4	Ohmeda	Per l'eutanasia del topo
CO2 serbatoio del gas	Praxair C799117902	Per l'eutanasia del topo
O2 serbatoio del gas	Praxair	Per l'eutanasia del topo
Camera a gas			Per l'eutanasia del topo
40 &; m Filtro per celle Falcon	Corning Incorporated	352340
50 μ m filtri della linea di campionamento	BD Biosciences	649049
Miscelatore a vortice	Labnet international, inc.	S0200	Per la fissazione cellulare
Centrifuga Dynac	Clay Adams	101
Celltrics 50 µ m filters	Partec	04-004-2327
Selezionatore cellulare a 488 nm con utilizzo laser	BD Biosciences	FACSAria III
Accudop Fluorescent Beads	BD Biosciences	345249
Tampone di smistamento: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS FBS			è inattivato termicamente. Prepara una soluzione fresca, 0,22 μ m filtrato e conservare a 4°C.