Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Sommario

Il pH fagosomico influenza la maturazione dei fagosomi, la produzione di ossidanti, l'uccisione fagosomiale e la presentazione dell'antigene. Qui descriviamo un metodo raziometrico per misurare le variazioni di pH nel corso temporale e nel punto finale nei singoli fagosomi nei fagociti viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Abstract

Fagocitosi è un processo fondamentale attraverso il quale le cellule immunitarie innate fagocitare batteri, cellule apoptotiche o altre particelle estranee al fine di uccidere o neutralizzare il materiale ingerito, o di presentarlo come antigeni e di avviare le risposte immunitarie adattive. Il pH di fagosomi è un parametro critico regolazione fissione o fusione con endomembrane e l'attivazione degli enzimi proteolitici, eventi che permettono al vacuolo fagocitosi di maturare in un organello degradativa. Inoltre, è richiesto di traslocazione H ⁺ per la produzione di elevati livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che sono essenziali per l'uccisione efficiente e segnalazione ad altri tessuti dell'ospite. Molti patogeni intracellulari sovvertono uccisione fagocitico limitando phagosomal acidificazione, sottolineando l'importanza del pH in phagosome biologia. Qui si descrive un metodo per misurare raziometrica phagosomal pH nei neutrofili con fluoresceina isotiocianato (FITC) -labeled zymosan come phagocytic targETS e live-cell imaging. Il saggio si basa sulle proprietà di fluorescenza di FITC, che si spegne da pH acido quando eccitato a 490 nm ma non quando eccitato a 440 nm, permettendo la quantificazione di un rapporto pH-dipendente, piuttosto che di fluorescenza assoluta, di un singolo colorante. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'esecuzione in loco di calibrazione tintura e la conversione del rapporto di valori reali di pH. Single-dye metodi raziometriche sono generalmente considerati superiori a singola lunghezza d'onda o protocolli pseudo-raziometrico dual-dye, in quanto sono meno sensibili alle perturbazioni, come lo sbiancamento, concentrarsi modifiche, variazioni laser, e l'etichettatura irregolare, che distorcono il segnale misurato. Questo metodo può essere facilmente modificato per misurare il pH in altri tipi di cellule fagocitiche e zymosan può essere sostituita da qualsiasi altra particella contenente ammina, da perline inerti ai microrganismi viventi. Infine, questo metodo può essere adattato a fare uso di altre sonde fluorescenti sensibili a diversi intervalli di pH o altri phagosomattività al, rendendolo un protocollo generale per l'imaging funzionale di fagosomi.

Introduzione

La fagocitosi, il processo attraverso il quale le cellule immunitarie innate inghiottono particelle di grandi dimensioni, si è evoluta dal meccanismo alimentare degli organismi unicellulari, e comporta il legame con un bersaglio, avvolgendolo con una membrana e pizzicando la membrana per formare un vacuolo all'interno del citosol chiamato fagosoma. Mentre la membrana fagosomiale è derivata dalla membrana plasmatica, lo smistamento attivo delle proteine e dei lipidi, così come la fusione con le endomembrane durante la formazione dei fagosomi, trasformano il fagosoma in un organello distinto all'interno della cellula con proprietà degradative che consentono l'uccisione, la neutralizzazione e la rottura del materiale ingerito^1-3. Questo processo, chiamato maturazione fagosomiale, si basa sulla somministrazione di una serie di enzimi proteolitici e microbicidi, tra cui la nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi che trasferisce elettroni nei fagosomi producendo il forte ossidante O₂^- e le sue specie reattive dell'ossigeno derivate (ROS) ^2,4.

Il pH luminale dei fagosomi ha una profonda influenza su diversi eventi necessari per la funzione dei fagosomi. In primo luogo, il pH influenza il traffico delle endomembrane in generale, poiché i cambiamenti conformazionali pH-dipendenti dei regolatori del traffico transmembrana alterano il reclutamento di determinanti del traffico come Arfs, Rabs e proteine del rivestimento vescicolare, che a loro volta definiscono quali vescicole possono fondersi con i fagosomi ^5-8. In secondo luogo, anche la composizione ionica del lume fagosomiale si trasforma man mano che i fagosomi maturano, e alcuni trasportatori ionici, come lo scambiatore Na⁺/H⁺ o gli antiportatori Cl^-/H⁺ della famiglia ClC, che promuovono la funzione fagocitica, si basano sulla traslocazione H^{+ 9,10}. Allo stesso modo, la produzione di ROS è intimamente legata al pH fagosomiale. I ROS e i suoi sottoprodotti ossidanti tossici sono stati a lungo riconosciuti come cruciali per l'uccisione fagosomiale nei neutrofili ^4,11,12 e hanno dimostrato di svolgere un ruolo critico in altri fagociti, tra cui i macrofagi, le cellule dendritiche (DC) e l'ameba ^13-16. La NADPH ossidasi è un enzima elettrogenico che rilascia H⁺ nel citosol quando viene consumato e che richiede il trasferimento simultaneo di H⁺ attraverso i canali HVCN1 insieme agli elettroni trasportati nel lume fagosomiale, al fine di alleviare la massiccia depolarizzazione che altrimenti porterebbe all'autoinibizione dell'enzima ^17-21. Infine, diversi enzimi proteolitici hanno un'attività ottimale a pH diversi, quindi le variazioni di pH fagosomiale dipendenti dal tempo possono influenzare quali enzimi sono attivi e quando. L'importanza del pH fagosomiale è evidenziata da organismi come Mycobacterium tuberculosis, Franciscella tularensis e Salmonella typherium che sovvertono l'uccisione fagocitaria almeno in parte alterando il pH fagosomiale ^22-24.

Nei mammiferi i principali fagociti sono neutrofili, macrofagi e cellule dendritiche e, a seconda del tipo di cellula, le variazioni di pH fagosomiale dipendenti dal tempo possono variare notevolmente e sembrano svolgere ruoli diversi. Nei macrofagi una forte e rapida acidificazione mediata dall'ATPasi vacuolare della pompa protonica ATP-dipendente (V-ATPasi) è uno dei fattori chiave che mediano l'uccisione ^25-27, simile ai meccanismi presenti nell'ameba che utilizza la fagocitosi come meccanismo alimentare ²⁸. In queste cellule si ritiene che l'attivazione delle proteasi acide svolga un ruolo chiave. Al contrario, l'uccisione dei neutrofili si basa maggiormente sui ROS e sull'HOCl prodotto dalla mieloperossidasi (MPO)¹¹, e il pH rimane neutro o alcalino durante i primi 30 minuti, acidificandosi solo successivamente ^{a 29,30}. È stato suggerito che il pH neutro favorisca l'attività delle proteasi ossidative come alcune catepsine. Nelle DC il pH fagosomiale è controverso, con alcune che riportano acidificazione e altre con pH neutro o alcalino ^31,32, ma i ROS e il pH possono influenzare profondamente la capacità di queste cellule di presentare antigeni alle cellule T, una delle loro principali funzioni ³³.

È importante sottolineare che ormoni, chemochine e citochine possono produrre eventi di segnalazione che inducono la maturazione e i cambiamenti nel comportamento dei fagociti e, a loro volta, influenzano il pH fagosomiale ^34,35. Allo stesso modo, i farmaci, ad esempio l'antimalarico clorochina, che è anche considerato per le terapie antitumorali ³⁶, possono influenzare il pH fagosomiale e quindi gli esiti immunitari. Pertanto, una varietà di biologi cellulari, immunologi, microbiologi e sviluppatori di farmaci può essere interessata a misurare il pH fagosomiale quando cerca di comprendere i meccanismi alla base degli effetti di una particolare alterazione genetica, composto bioattivo o microrganismo sulle risposte immunitarie innate e adattative.

Qui descriviamo un metodo per misurare il pH fagosomiale nei neutrofili che ci ha permesso di mostrare l'importanza del canale HVCN1 nella regolazione del pH ¹⁹ dei neutrofili. Il metodo si basa sulla proprietà raziometrica dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC) la cui emissione di fluorescenza a 535 nm è sensibile al pH quando eccitata a 490 nm ma non a 440 nm ³⁷. Quando questo colorante è accoppiato chimicamente a un bersaglio, in questo caso lo zimosoma, può essere seguito utilizzando la microscopia a fluorescenza ad ampio campo, in cui le cellule vengono visualizzate mentre fagocitano e le variazioni di pH fagosomiale vengono misurate in tempo reale durante la maturazione del fagosoma. Il pH effettivo viene quindi raccolto eseguendo un esperimento di calibrazione in cui le cellule che hanno fagocitato sono esposte a soluzioni di pH diverso che contengono gli ionofori nigericina e monensina, che consentono il rapido equilibrio del pH all'interno dei fagosomi con la soluzione esterna. I valori del rapporto vengono quindi confrontati con il pH noto delle soluzioni, viene costruita una curva di calibrazione mediante regressione non lineare e l'equazione risultante viene utilizzata per calcolare il pH dal valore del rapporto.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Tutte le manipolazioni sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le linee guida del Comitato delle Università di Ginevra Animal Research.

1. Preparazione di obiettivi fagocitiche

1. Aggiungere 20 mg di zimosan essiccata a 10 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS). Vortex e calore in un bagno di acqua bollente per 10 min. Raffreddare e centrifugare a 2000 xg per 5 min.
2. Rimuovere il surnatante, risospendere in 1 ml di PBS e ultrasuoni per 10 minuti in un bagno sonicatore acqua. Trasferire 500 microlitri di due provette da 1,5 ml. Centrifugare a 11.000 g per 5 min.
3. Ripetere il lavaggio con 500 microlitri di PBS. Il zymosan bollito può essere aliquotato, congelato e conservato a -20 ° C.
4. Lavare zymosan due volte in 500 microlitri preparate 0,1 M _Na 2 CO _3, pH 9,3 come sopra (punto 1.2).
5. Risospendere in 490 microlitri dopo il lavaggio finale. Aggiungere 10 ml di 10 mg / ml FITC sciolto in dimetil sulfoxide (DMSO), vortice, coprire con un foglio, e incubare con agitazione per 4 ore a temperatura ambiente.
6. Per rimuovere il colorante, lavare come in precedenza (punto 1.2), prima con 0,5 ml di DMSO + 150 l di PBS, poi 0,5 ml di DMSO + 300 ml di PBS, poi 0,5 ml di DMSO + 450 l di PBS, poi PBS da solo.
7. Conte zymosan utilizzando un emocitometro. Aggiungere 1 ml di zymosan a 500 microlitri di PBS, vortex, quindi aggiungere 10 microlitri al bordo della camera dell'emocitometro, dove incontra il coprioggetto posto sopra la griglia centrale. Montare il emocitometro su un microscopio in campo chiaro equipaggiato con un obiettivo 20X.
8. Focus su nell'angolo in alto a sinistra contenente 16 piazze e contare tutte le particelle zymosan in questo settore con un contatore riscontro mano. Ripetere con l'angolo in basso a destra. Calcolare la concentrazione zymosan utilizzando la seguente equazione: concentrazione Zymosan = Count / 2 x 500 x ¹⁰ 4 zymosan / ml. Zymosan etichettati, possono essere aliquotato, congelato e conservato a -20 ° C.
9. Opsonize l'etichetta wi zymosanTh A anticorpo anti-coniglio di zymosan a diluizione 1: 100. Vortex e incubare per 1 ora in un bagno d'acqua a 37 ° C. Lavare con 500 microlitri di PBS come sopra (punto 1.2).
   Nota: Sonicazione è altamente raccomandato, in particolare dopo opsonizzazione, come zymosan tende a formare grumi che possono rendere l'analisi più difficile in seguito. Opsonizzazione con il 65% v / v di ratto o siero umano può essere utilizzato in alternativa.
10. Conte zymosan utilizzando un emocitometro come descritto nei passaggi 1,7-1,8, e portare a 100 x ¹⁰ 6 particelle / ml. Opsonizzazione con altri stimolatori fagocitosi, come complemento o no opsonizzazione, può essere effettuata in alternativa.

2. Live Video Microscopia

1. Isolare neutrofili principale del mouse come descritto in dettaglio altrove ^38.
   1. In alternativa, utilizzare qualsiasi tipo di cellula fagocitica. Mantenere neutrofili sul ghiaccio in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 5% di siero fetale bovino (v / v), penicillina 200 U / streptomycin, ad una concentrazione di 10 x 10 ⁶ cellule / ml fino al momento dell'uso. Altri tipi di cellule possono essere seminate 1-4 giorni prima.
2. Aggiungere 2 x 10 ⁵ (20 ml) di neutrofili al centro di un piatto fondo di vetro 35 mm, diffondere il calo aggiungendo 50 ml di terreno ed incubare a 37 ° C per 5 minuti per consentire cellule di aderire.
3. Aggiungere 1 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) riscaldato a 37 ° C che contiene la specifica MPO idrazide inibitore 4-aminobenzoico (4-ABH, 10 micron). Non specifici inibitori MPO, come il sodio azide (5 mm), possono anche essere utilizzati, ma sono state recentemente suggerito di esercitare ulteriori effetti non specifici sul pH ^39.
4. Montare il piatto su un microscopio a fluorescenza widefield dotato di un sistema di riscaldamento 37 ° C e un obiettivo 40X olio. Incubare le cellule senza l'imaging per 10 minuti per consentire alle cellule e attrezzature equilibrare.
5. Regolare le impostazioni del microscopio per acquisire un'immagine di trasmissione in campo chiaro [phase o il contrasto di interferenza differenziale (DIC), se disponibile] con 440 nm o 490 nm di eccitazione e 535 nm di emissione ogni 30 sec.
6. Regolare il tempo di esposizione e la frequenza di acquisizione secondo il sistema microscopio per evitare troppo photobleaching e fototossicità e seconda delle domande sperimentali viene chiesto. Inizia l'acquisizione delle immagini.
7. Dopo 2 min, aggiungere 10 x 10 ⁶ (50 microlitri) opsonizzati FITC-zymosan al centro del piatto. Regolare bersaglio: i rapporti di cellule a seconda del tipo di fagociti e target utilizzato.
8. Continuare di imaging per 30 min. Dopo 30 minuti fermare l'acquisizione time-lapse e avviare un timer. Spostare lo stadio e catturare più di 10 istantanee in diversi campi di vista di immagine altri fagosomi, tutti a 5 minuti.

3. taratura e controllo Esperimenti

1. Preparare le soluzioni di taratura pH (ricette sono descritti nella Tabella 1) prima del giorno di esperimento e congelare in 10 ml aliquote.Scongelare le soluzioni di taratura e la calda a 37 ° C in un bagno d'acqua. Controllare il pH con un pHmetro e registrare il pH effettivo di soluzioni.
2. Montare una pompa peristaltica sul fondo piatto di vetro prima acquisizione dell'immagine ed eseguire la microscopia video dal vivo come descritto sopra (sezione 2).
3. Alla fine del periodo di acquisizione 30 min accendere la pompa per rimuovere la soluzione all'interno del piatto, aggiungere 1 ml della prima soluzione di calibrazione e arrestare la pompa.
4. Attendere che il segnale si stabilizza, di solito 5 min. Ripetere con ogni soluzione di calibrazione.
   1. Effettuare almeno una calibrazione al giorno sperimentale, e calibrare iniziando con il più alto pH e sequenzialmente lavorare al minimo, così come a partire dal pH basso e lavorando in sequenza verso l'alto.
5. Come controllo, aggiungere 100 ml di 100 mM inibitore NADPH ossidasi difenil propionium ioduro (DPI) diluiti in HBSS alle cellule in 900 microlitri HBSS nel piatto fondo di vetro, eincubare per 10 min.
6. Avviare l'acquisizione e aggiungere zymosan come sopra (punto 2.7). Dopo 15 min di fagocitosi, aggiungere 10 ml di 10 mM inibitore V-ATPasi concanamycin A (ConcA) diluiti in HBSS e continuare l'imaging per altri 15 min.

4. Analisi

1. L'analisi dei filmati time-lapse e istantanee phagosome.
   Nota: Le seguenti istruzioni sono specifici per ImageJ. Step-by-passo le istruzioni possono variare ampiamente a seconda del software utilizzato, ma le funzioni descritte in questa sezione sono disponibili nella maggior parte dei software di analisi immagine professionale.
   1. Aprire le immagini con il software di analisi di immagine professionale. Sottrarre il fondo nel canale 490 tracciando una piccola ROI piazza con lo strumento di selezione del poligono piazza in una zona dove non ci sono le cellule, e facendo clic su Plugins> BG Sottrazione di ROI. Poi caricare lo stesso ROI sul canale 440 facendo clic su Modifica> Selezione> Ripristina selezione e ripetere.
   2. Fare un rapporto di immagine a 32 bit del canale 490 diviso per il canale 440 cliccando processo> Calcolatrice Immagine ..., selezionando le immagini appropriate nei menu a scorrimento visualizzati Image1 e Image2, quindi selezionando 'Divide' nel menu a discesa Operazione , e controllando il risultato casella di controllo a 32 bit (float).
   3. Cambia il look-up table colori per una codifica a colori compatibile rapporto facendo clic su Immagine> tabelle di ricerca> Arcobaleno RGB. Soglia l'immagine rapporto di eliminare 0 e infinito pixel facendo clic su Immagine> Regola> Soglia .... Regolare le barre di scorrimento in modo che zymosan appare in rosso e fare clic su Applica, assicurandosi che i pixel dello sfondo Imposta la casella di controllo per NaN è selezionata.
   4. Combinate questo rapporto stack con il canale in campo chiaro in un composito multi-canale cliccando Immagine> Colore> Unisci canali, e selezionando l'immagine in campo chiaro nel menu a discesa dei canali grigio e l'immagine il rapporto nel menu a discesa canale verde, e selezionando laMantenere immagini di origine check-box. Scansione film time-lapse o istantanee per determinare quale phagosomes devono essere analizzati. Il canale in campo chiaro è utile per questo.
   5. Disegna regioni di interesse (ROI) utilizzando lo strumento di selezione ovale poligono attorno fagosomi, e aggiungerli al gestore ROI facendo clic su Analizza> Strumenti> ROI Manager> Aggiungi. Misurare il loro rapporto di intensità zymosan facendo clic su Altro> multimisura e de-selezionando l'Una riga per fetta casella di controllo.
   6. Per i filmati time-lapse, pista phagosomes uno alla volta disegnando un ROI, digitando CTRL + M per misurare ogni punto di tempo, e spostando il ROI in caso di necessità di monitorare i valori di intensità nel corso del tempo. Copiare le misurazioni dalla finestra Risultati in un foglio elettronico.
      Nota: Analisi di 15 (5 andamenti temporali per esperimento x 3) esperimenti indipendenti è ideale, ma più o meno può essere richiesta a seconda della variabilità osservata. Salvataggio delle ROI è sempre consigliato. Alcuni pacchetti software consentono regi immaginestrazione e aggiornamento dinamico di ROI, facilitare questo parte dell'analisi.
2. La conversione da fluorescenza a valori di pH
   1. Misurare il rapporto 490/440 per phagosomes nella calibrazione film time-lapse, come descritto nella sezione 4.1.
   2. In un foglio di calcolo, tracciare i valori del rapporto nel corso del tempo, e calcolare i valori medi del rapporto da tutti i fagosomi all'interno del campo di vista (di solito, tra 5-20) da 5 punti temporali entro la metà del periodo di tempo corrispondente ad ogni calibrazione pH soluzione. (Vedi anche le caselle rosse nella figura 5A.)
   3. Tracciare questi medi 490/440 valori del rapporto contro il pH attuale di misura. Combina almeno 3 tarature indipendenti in un unico grafico. Utilizzare un pacchetto software statistico o numerico per eseguire una regressione lineare (migliore misura della curva), di solito per una equazione sigmoidale.
      Nota: per esempio, nella Figura 5B l'equazione utilizzata era un sigmoidale Boltzmann [Y = inferiore + ((Alto-Basso)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], dove i valori di Y sono i rapporti 490/440, X sono i valori di pH e alto, in basso, i parametri V50 e pendenza sono calcolati dal software.
   4. Usare l'equazione ottenuto di trasformare valori di rapporto al pH.
      Nota: Per esempio, nella Figura 5B nell'equazione ottenuto per la curva di calibrazione in presenza di sodio azide è 490/440 Ratio = 1.103 + [(2.89-1.103) / (1 ​​+ EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Risolvendo per pH dà la seguente equazione: pH = 6.993 - 0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))].

Risultati

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi per un esperimento in cui il pH phagosomal dei neutrofili topo primari isolati dal midollo osseo di wild-type o Hvcn1 ^{- / -} sono stati confrontati topi. Per un esperimento riuscito, è importante ottenere abbastanza fagosomi all'interno del campo visivo durante tutta la durata del film accelerato, evitando troppi fagosomi, che sarà poi essere più difficile segmento durante l'analisi delle immagini. La figura 1 mostra ese...

Discussione

Sebbene più tempo rispetto metodi alternativi, come la spettroscopia e FACS, che impiegano una simile strategia di utilizzo di un colorante sensibile al pH accoppiato obiettivi ma misurano il pH medio di una popolazione di fagosomi, microscopia offre diversi vantaggi. Prima è che interno ed esterno vincolati, ma non interiorizzato, le particelle possono essere facilmente distinguibili, senza dover aggiungere altre sostanze chimiche, come trypan blu o di anticorpi, per placare o etichettare particelle esterne, rispettiva...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Zymosan A polvere	Sigma-Aldrich	Z4250	Esistono vari fornitori
Isotiocianato di fluoresceina	Sigma-Aldrich	F7250	Esistono vari fornitori Anticorpo
anti-zymosan (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 è un prodotto equivalente. In alternativa, il siero al 25% può essere utilizzato come reagente opsonante.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori
Difenileneodonio cloruro (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori
Concanamicina A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Life Technologies	14200-075	Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono
Hank's balance salt solution	Life Technologies	14025092	Ringer's balanced salt solution o altri chiari tamponi fisiologici possono essere sostituito.
Carbonato di sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Esistono vari fornitori
Acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Esistono diversi fornitori
Acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Esistono vari fornitori
N-metil-D-glucamina (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Esistono diversi fornitori
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&primo;,acido N&primo;-tetraacetico (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Esistono vari fornitori
Tris(idrossimetil)amminometano (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Esistono diversi fornitori
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Esistono vari fornitori
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Esistono vari fornitori
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Esistono vari fornitori
Etanolo assoluto (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Esistono vari fornitori
Piastre di Petri da 35 mm con fondo in vetro (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Possono essere sostenute piastre o vetrini coprioggetti Ibidi µ-clear con camere di imaging appropriate
Bagno d'acqua sonicante	O. Kleiner AG		Al suo posto può essere utilizzato un sonicatore, esistono vari fornitori di strumenti
Heamocytometer	Marienfeld GmbH		Esistono vari fornitori
di strumentiMicroscopio a distanza larga per immagini dal vivo	Carl Zeiss AG		Esistono diversi fornitori di strumenti, ma il microscopio deve essere in grado di visualizzare rispettivamente l'eccitazione/emissione 440/535 e 490/535. Le configurazioni confocali a disco rotante con capacità di campo chiaro possono essere sostituite, ma lo zimosano tende ad andare fuori fuoco più spesso.
Pompa peristaltica (Dynamax RP-1)	Rainin		Esistono diversi fornitori di strumenti
pHmetro	Schott Gerate GmbH		Esistono vari fornitori di strumenti
Contatore manuale	Milian SA		Esistono vari fornitori di strumenti