L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare la micro-dissezione a cattura laser come metodo efficace per isolare popolazioni pure di tipi cellulari da tessuti prostatici eterogenei per l'analisi dell'RNA a valle.
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Articolo metodologico
Laser-capture Microdissezione di Human prostatica Epitelio per l'analisi di RNA
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ghiandola prostatica contiene un ambiente eterogeneo di tipi di cellule stromali, epiteliali, neuroendocrine e immunitarie. La prostata sana è composta da stroma fibromuscolare che circonda i lumi secretori discreti rivestiti di epitelio e una popolazione molto piccola di cellule immunitarie e neuroendocrine. Al contrario, le aree di cancro alla prostata hanno un aumento dell'epitelio luminale displastico con una popolazione stromale notevolmente ridotta o assente. Data la profonda differenza tra i tipi di cellule stromali ed epiteliali, è imperativo separare i tipi di cellule per qualsiasi tipo di analisi molecolare a valle. Nonostante questa conoscenza, la maggior parte degli studi sull'espressione genica confronta la prostata benigna con il cancro senza micro-dissezione, portando a bias stromale nei campioni benigni. La microdissezione a cattura laser (LCM) è un metodo efficace per separare fisicamente diversi tipi di cellule da una sezione di campione. L'obiettivo di questo protocollo è dimostrare che l'RNA può essere isolato con successo dall'epitelio prostatico umano raccolto con LCM e utilizzato per studi di espressione genica a valle come RT-qPCR e RNAseq.
Introduzione
La prostata è un tessuto eterogeneo composto da epitelio secernente disposti in acini ghiandolari circondato da stroma fibromuscolare composta principalmente da muscolatura liscia 1. Il vano epiteliale è composto da cinque diversi tipi di cellule, ma organizzati: cellule basali, cellule, cellule neuroendocrine secretoria, cellule amplificazione di transito e cellule staminali 2. Nel cancro della prostata (APC), che deriva dalle cellule epiteliali luminali, la crescita del adenocarcinoma provoca un evidente declino progressivo del vano stromale 3. Per queste ragioni, campioni di tessuto saranno chiare differenze nella proporzione di st....
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Protocollo
Tutti i tessuti umani usati per questi esperimenti sono stati acquisiti tramite un protocollo Institutional Review Board approvato e / o di esenzione presso University of Illinois a Chicago.
1. Sezione freschi congelati prostata su PEN-scivolo e sulla Charged vetrino
- Il giorno prima o qualche ora prima sezionare il campione, attrezzi puliti (ad esempio, spazzola, pinze, coplins, lame, scivoli PEN-incorniciati (se non è già RNasi gratuito), un ETOH marcatore di sicurezza e una matita) e l'interno di una RT criostato con la soluzione RNase-decontaminazione utilizzando uno spray e di laboratorio-salviette.
- Lasciare la soluzione-R....
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Risultati
In un precedente studio abbiamo dimostrato l'uso di LCM per raccogliere tessuti epiteliali e stromali confrontare profilo di espressione mediante RT-qPCR di mRNA e microRNA dai tessuti prostatici congelati e FFPE dallo stesso paziente 4. LCM richiede molto tempo, specialmente se grandi quantità di RNA è da raccogliere per l'analisi di sequenziamento di prossima generazione. Pertanto, è fondamentale per mantenere lo spazio di lavoro e strumenti RNase. Si raccomanda di controllare la qualità e cellula-s.......
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Discussione
Profilo di espressione genica da campioni umani può essere impegnativo, non solo per la qualità o la quantità di tessuto a disposizione, ma anche per le diverse entità istologiche presenti in un dato campione di tessuto. Ciò è particolarmente impegnativo nella prostata in cui tessuti benigni sono in gran parte i tessuti stromali e le aree di cancro sono privi di stroma. LCM facilita separazione fisica di stroma prostatico e l'epitelio RNA per una firma più accurata dei due diversi tipi di cellule (Figura 1A).......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo la dottoressa Vicky Macias, Angeline Giangreco e Avani Vaishnav per l'assistenza nell'ottimizzazione di questa metodologia nel corso degli anni e Yang Zhang e il dottor Jian Ma dell'Università dell'Illinois a Urbana-Champaign per l'analisi del seq dell'RNA. Questo lavoro è stato supportato da NIH/NCI R01 CA166588-01 (Nonn), American Cancer Society Research Scholar 124264-RSG-13-012-01-CNE (Nonn), NIH/NCI R03 CA172827-01 (Nonn), DOD-CDMPR PRCP Health Disparities Idea Award PC121923 (Nonn) e una sovvenzione della Prevent Cancer Foundation (Zhou).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| RNasi-VIA | MBP | 7005-11 | |
| PEN-membrana 4,0 mm vetrini | Leica | 11600289 | |
| Vetrini in vetro, Superfrost Plus | FisherBrand | 12-550-15 | |
| Etanolo 200 proof | Decon labs. | 2701 | |
| DEPC (pirocarbonato di dietile) | Sigma | D-5758 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 | |
| Coplins (barattolo di colorazione) | IHCWORLD | M900-12 | |
| Coplins (rack di colorazione) | IHCWORLD | M905-12 | |
| Aperio ScanScope | Aperio (Leica) | ScanScope® | |
| Toluidina Blu | Fluka | 89640-5G | |
| Sistema di Microdissezione Laser | Leica | LMD7000 | |
| 0,5 ml Provette a parete sottile per LCM | Thermo Scientific | AB-0350 | |
| RNAqueous®-Micro Kit di isolamento dell'RNA totale | Ambion | AM1931 | Thermo Fisher Scientific Marca |
| NanoDrop | Thermo Scientific | Fluorimetro ND-1000 | |
| Qubit 2.0 Life | Technologies | Q32866 | del marchio Thermo Fisher Scientific |
| Biosystems Applied Biosystems | 4368814 | Thermo Fisher Scientific Brand | |
| Kit di sintesi universale del cDNA II, 8-64 rxns | Exiqon | 203301 | |
| TaqMan microRNA RT kit | Applied Biosystems | 4366597 | Thermo Fisher Scientific Marca |
| Ematossilina colorante | Ricca Chemical Company | 3536-16 | |
| Eosin-Y | Richard Allan Scientific | Codice: 7111 |
Riferimenti
- Schauer, I. G., Rowley, D. R. The functional role of reactive stroma in benign prostatic hyperplasia. Differentiation. 82, 200-210 (2011).
- Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocrine-related cancer. 12
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Ristampe e permessi
