I meccanismi molecolari della decondensazione della cromatina mitotica altamente compattata sono mal definiti. Presentiamo un test cell-free basato su cluster di cromatina mitotica isolati da cellule HeLa ed estratto di uova di Xenopus laevis che ricostituisce fedelmente il processo di decondensazione in vitro.
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Articolo metodologico
Un Free Cell Assay per studiare cromatina decondensazione alla fine del mitosi
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Durante il ciclo cellulare dei vertebrati, la cromatina subisce ampi cambiamenti strutturali e funzionali. All'ingresso mitotico, si condensa massicciamente in cromosomi a forma di bastoncino che vengono mossi individualmente dall'apparato del fuso mitotico. La condensazione mitotica della cromatina produce cromosomi compattati cinquanta volte più densi come nell'interfase. Durante l'uscita dalla mitosi, i cromosomi devono ristabilire il loro stato di interfase funzionale, che è racchiuso da un involucro nucleare ed è competente per la replicazione e la trascrizione. Il processo di decondensazione è morfologicamente ben descritto, ma in termini molecolari poco compreso: ci manca la conoscenza degli eventi molecolari sottostanti e, in larga misura, dei fattori coinvolti e della loro regolazione. Descriviamo qui un sistema cell-free che ricapitola fedelmente la decondensazione della cromatina in vitro, basato su cluster mitotici di cromatina purificati da cellule HeLa sincronizzate e dall'estratto di uova di X. laevis. Il nostro sistema cell-free fornisce uno strumento importante per un'ulteriore caratterizzazione molecolare della decondensazione della cromatina e la sua coordinazione con i processi che si verificano simultaneamente durante l'uscita mitotica, come l'involucro nucleare e il riassemblaggio del complesso dei pori.
Introduzione
Xenopus laevis estratto uovo è uno strumento potente e ampiamente applicato per studiare eventi cellulari complicati nella semplicità di un test cell-free. Fin dalla loro prima descrizione da Lohka & Masui 1 che sono stati ampiamente utilizzati per studiare i processi mitotici quali la condensazione della cromatina 2, del fuso 3, rottura membrana nucleare 4, ma anche il trasporto nucleocytoplasmic 5 o 6 replicazione del DNA. Gli eventi che si svolgono al termine della mitosi, necessari per la riforma del nucleo interfasico quali riforma membrana nucleare e poro nucleare complesso rimontaggio s....
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Protocollo
Mitotico cromatina Isolamento cluster da cellule HeLa
1. Preparativi
- Cultura cellulare Soluzioni
- Preparare mezzo modificato Eagle completa Dulbecco (DMEM) con l'aggiunta di siero fetale bovino al 10%, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e glutammina 2 mM al DMEM. Preparare tampone fosfato salino (PBS) contenente 2,7 mM KCl, NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O e 2 mM KH 2 PO 4 in acqua deionizzata, e regolare il pH a 7,4 con NaOH 10 N.
NOTA: PBS può essere mantenuto come 10x soluzione madre nel tempo a....
- Preparare mezzo modificato Eagle completa Dulbecco (DMEM) con l'aggiunta di siero fetale bovino al 10%, 100 unità / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina e glutammina 2 mM al DMEM. Preparare tampone fosfato salino (PBS) contenente 2,7 mM KCl, NaCl 137 mM, 10 mM Na 2 HPO 4 2H 2 O e 2 mM KH 2 PO 4 in acqua deionizzata, e regolare il pH a 7,4 con NaOH 10 N.
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Risultati
Ora la dipendenza della reazione decondensazione
La figura 1 mostra un tipico andamento temporale del dosaggio decondensazione. Il cluster di cromosomi visibili all'inizio della reazione decondenses e si fonde in un unico, rotondo e liscio nucleo. Quando l'estratto uovo è sostituito dal saccarosio tampone cluster cromosoma rimane condensata, che suggeriscono che l'attività decondensazione è presente nell'estratto uovo.
Decondensaz.......
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Discussione
Xenopus laevis estratti a base di uova sono uno strumento molto utile per riprodurre fedelmente i processi cellulari in vitro, e questo sistema è stato utilizzato con successo nella caratterizzazione degli eventi del ciclo cellulare e la divisione cellulare 2, 3,5,6,17. A causa di grandi negozi di componenti nucleari sequestrati nell'uovo durante oogenesi, estratti a base di uova sono una fonte eccellente di componenti cellulari. Rispetto ad altri approcci come RNAi su linee c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca e l'ERC (AN377 / 3-2 e 309.528 CHROMDECON a WA) e un PhD Fellowship della Boehringer Ingelheim Fonds a AKS Figura 1 e 2 sono ristampati da Developmental Cell 31 (3), Magalska , RuvB-come la funzione ATPasi nella cromatina decondensazione alla fine della mitosi, 305-318, 2014 et al., gentile concessione di Elsevier.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tetracloridrato di spermina | Fluka analitico | 85610-25G | |
| tricloridrato di spermidina | Sigma | S2501-5G | |
| digitonina ad alta purezza | Millipore | 300410-1GM | |
| PMSF | Applichem | A0999,0100 | tossica |
| Calbiochem | 6060 | ||
| nocodazolo | Calbiochem | 487928 | soluzione tossica |
| di formaldeide al 37% | Roth | 7398-1 | tossica |
| di trypan blue (0,4% ) | Sigma | T8154 | tossico |
| 1,4-ditiotreitolo (DTT) | Roth | 6908.2 | |
| AEBSF cloridrato | Applichem | A1421,0001 | |
| pepstatina | Roth | 2936.1/2/3 | |
| leupeptin | Roth | CN334 | |
| aprotinina | Roth | A162.3 | |
| Percoll (particelle di silice colloidale GE | Healthcare | 17-0891-01 | |
| glutammina | Gibco | 25030-024 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Flaconi per colture tissutali da 75 cm² | Greiner Bio-one | 658175 | |
| siero fetale bovino inattivato termicamente (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
| Omogeneizzatore (40 ml macinatore di tessuti) | Wheaton | 357546 | |
| Neubauer camera | Assistent | 441/1 | |
| Oak Ridge Provette per centrifuga, policarbonato (50 ml) | Nalgene | 3118-0050 | |
| 100 µ filtro per cellule m, nylon | BD Falcon | 352360 | |
| citocalasina B | Applichem | A7657,0010 | |
| cicloesimide tossica | Roth | 8682.3 | |
| L-cisteina tossica | Merck | 1,028,381,000 | |
| hCG disponibile come Ovogest | MSD | 1431593 | |
| PMSG disponibile come Intergonan | MSD | 1431015 | |
| A23187 (misto calcio-magnesio-sale) | Enzo | ALX-450-002-M010 | |
| aghi per siringhe tossiche (1,20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2") | Braun | 4665120 | |
| ATP | Serva | 10920.03 | |
| GTP, 2 Na x 3 H20 | Roth | K056.1/2/3/4 | |
| creatina fosfato sale disodico | Calbiochem | 2380 | |
| creatina fosfochinasi | Sigma | C3755-35KU | |
| DMAP | Sigma | D2629-1G | |
| DAPI | Roche | 10236276001 | |
| Provette | tossiche | PFA Sigma | P-6148 |
| per TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 pollici) | Beckman Coulter | 343775 | |
| "Cell-Saver" (punte con ampia apertura, 1.000 &; l) | Biozym | 729065 | |
| soluzione di glutaraldeide al 50%, grado I | Sigma alderich | G7651-10 ml | tossica |
| di poli-L-lisina allo 0,1% (p/v) | Sigma | P8920-100 ml | |
| provette a fondo piatto (6 ml, 16,0/55 mm) | Greiner Bio-one | 145211 | |
| Vectashield supporto di montaggio | Vector laboratories | H1000 | |
| tubi per TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 pollici) | Beckman Coulter | 343778 | |
| "Cell-Saver" (punte con ampia apertura, 200 &; micro; l) | Biozym | 729055 | |
| vetrini coprioggetti da 12 mm | Thermo Scientific | 0784 #1 |
Riferimenti
- Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
- de la Barre, A. E., Robert-Nicoud, M., Dimitrov, S. Assembly of mitotic chromosomes in Xenopus egg ext....
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Ristampe e permessi
