Questo metodo valuta l'invasione delle cellule tumorali dagli sferoidi in una matrice 3D circostante. Gli sferoidi vengono generati con il metodo della coltura a goccia sospesa e quindi incorporati in una matrice composta da materiali a membrana basale e collagene di tipo I. L'invasione degli sferoidi viene successivamente monitorata.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un Cancer Cell Saggio sferoide valutare Invasion in un Ambiente 3D
In questo articolo
Sommario
Abstract
Si ritiene che la natura invasiva delle linee cellulari tumorali sia correlata al loro potenziale metastatico. La maggior parte dei saggi tradizionali, tuttavia, non esamina queste caratteristiche invasive in un ambiente tridimensionale e i dati risultanti soffrono di una ridotta applicabilità biologica. Qui viene presentato un approccio per visualizzare la capacità invasiva delle linee cellulari in un contesto fisiologicamente rilevante. Il test di invasione degli sferoidi delle cellule tumorali utilizza innanzitutto la gravità per generare sferoidi all'interno di gocce di terreno che pendono dal coperchio di un piatto di coltura cellulare. Successivamente, questi sferoidi sono incorporati in una matrice 3D costituita da una miscela di materiali della membrana basale e collagene di tipo I. L'esgressione delle cellule tumorali dagli sferoidi nella matrice circostante viene quindi monitorata nel tempo. Il metodo qui descritto può essere modificato per esaminare l'invasione dopo la cocoltura di diversi tipi di cellule, l'inclusione di farmaci/inibitori o le alterazioni dei costituenti della matrice extracellulare (ECM).
Introduzione
È accertato che la motilità delle cellule tumorali è predittiva di potenziale metastatico, dato che tale comportamento facilita l'invasione attraverso la membrana basale e l'ingresso nel sistema circolatorio 1. Maggior parte delle ricerche sulla motilità si è concentrata su come le cellule si comportano in un ambiente bidimensionale (2D), anche se sta diventando ampiamente riconosciuto che il movimento delle cellule in una tridimensionale (3D) matrice è più rappresentativo di come queste stesse cellule saranno effettivamente comportarsi in vivo 2. Sistemi di coltura 3D sono sempre più utilizzati per studiare i comportamenti cellulari che vanno dalla morfologia delle cellule, di cinetica di crescita e sensibilità ai farmaci 3. Il desiderio di controllare l'invasione delle cellule del cancro nel contesto di un ambiente 3D ha portato alla sintesi di tecniche precedentemente stabilito che comportano la generazione di aggregati di cellule 3D (sferoidi) tramite il metodo di coltura goccia pendente 4, seguita da incorporare questi sferoidi in un extracellulare 3D matrice (ECM), composto di collagene e membrana basale materiali 5. Questo metodo cerca di migliorare queste tecniche precedentemente stabiliti fornendo un approccio semplificato che può essere facilmente utilizzato per confrontare invasione sotto una varietà di condizioni sperimentali.
Altri modi tradizionali per valutare la motilità cellulare in vitro sono il saggio di graffi ferita e il dosaggio transwell 6. Il primo test raffigura motilità cellulare in un ambiente 2D, ed è quindi indipendente di una varietà di caratteristiche critiche per l'invasione in vivo, ad esempio attività della proteasi 7. Il test può transwell invasione delle cellule modello migliore quando gli inserti e sono rivestiti con i substrati ECM, ma solo un unico parametro, cioè la comparsa di cellule sulla superficie della membrana opposta è misurata, e molte sfumature di invasione delle cellule non sono così facilmente osservabile. In contrasto con queste tecniche, il saggio delle cellule del cancro invasione sferoide (Figura 1 </ strong>) permette per il monitoraggio in tempo reale di invasione delle cellule in un ambiente che non è solo fisiologicamente rilevanti, ma permette anche importanti caratteristiche specifiche della linea di cellule per essere visualizzati, come la migrazione delle cellule individuale contro collettiva 8. Questo metodo permette anche vantaggi rispetto ai saggi di crescita della cultura 3D standard. La generazione di aggregati cellulari tramite il metodo goccia appeso limita inizialmente il movimento delle cellule, in modo che le cellule saranno incentivati ad invadere dopo questo vincolo viene sollevato. Inoltre, una volta che vincolo viene sollevato, l'uscita cella procederà in una direzione uniforme, che può quindi essere quantificata convenientemente.
I materiali ECM più popolari utilizzati per cellulari tumorali sferoidi test sono Matrigel e collagene di tipo I, dove ognuna di queste componenti ha ruoli importanti e distinti a influenzare il comportamento metastatico. Matrigel è una miscela di secreto proteine prodotte da cellule di sarcoma Engelbreth-Holm Sciame di topo, e si arricchisce in basemeproteine di membrana nt quali laminina, entactina, e collagene di tipo IV 9. Per questo motivo Matrigel è seguito definita come "materiali della membrana basale." Questi materiali forniscono membrana basale ligandi essenziali necessari per integrina adesione durante l'invasione delle cellule del cancro 10 oltre a molte altre proteine che esercitano una gamma di effetti sul comportamento cellulare 11. In confronto, collagene di tipo I, comunemente preparato da acido digest di tendini e altre strutture collagene dense 12, è un materiale di matrice molto più semplice che serve come un importante elemento strutturale dei tessuti e stroma sostegno tessuti connettivi ed organi del corpo. È stato dimostrato che le caratteristiche fisiche di collagene possono regolare un numero di caratteristiche di motilità cellulare; per esempio, l'allineamento delle fibrille di collagene all'interfaccia tumore stromale permette alle cellule tumorali di migrare successivamente lungo queste fibrille quando invadere nel stroma 13. Nel saggio qui presentato, sia di tipo I collagene e di materie membrana basale sono utilizzate come strumenti per studiare le interazioni cellula-stroma cancro 3D.
L'effetto di inibizione o stimolazione di vie che controllano invasione può essere monitorato dopo le cellule sono stati incorporati nella matrice 3D. Le celle possono essere pretrattati durante la crescita in gocce sospese o al momento del trasferimento alla cultura 3D, a seconda che un trattamento prolungato sarà richiesto per modulare invasione. Per i trattamenti brevi, si raccomanda che il farmaco essere miscelato con la sospensione sferoide dopo la raccolta, così come i mezzi che circonderà le culture 3D, per facilitare un'adeguata esposizione al farmaco alle cellule. Successivamente, le cellule stromali normali o tumore-associati possono essere mescolati con il materiale di matrice per valutare il loro ruolo nel modulare l'invasione delle cellule tumorali, o per determinare come il comportamento paracrino e autocrino cellule influenze segnalazione. Questa idea è stata mostrata in uno studio in cui la coculture di colsul cancro e le cellule endoteliali in appesi gocce portato ad una rete vascolare all'interno sferoidi 14. Infine, i costituenti ECM possono anche essere modificati, come l'invasione delle cellule tumorali è influenzata da diversi substrati 15. Il metodo presentato qui di seguito vi offre pertanto un quadro per la valutazione invasione delle cellule di cancro in una varietà di condizioni. In generale, si è riscontrato che non tutte le linee cellulari creeranno sferoidi nelle gocce appesi e linee cellulari epiteliali cercando tipicamente formare sfere regolare.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Generazione di Spheroids
- Preparare cella singola sospensione per appendere le culture goccia staccando colture di cellule di cancro aderenti del ~ 70% di confluenza con un PBS lavaggio seguito da esposizione a 0,05% soluzione di tripsina-EDTA.
- Neutralizzare la soluzione di tripsina con colture cellulari e contare le cellule utilizzando una aliquota della sospensione cellulare. Nota: I mezzi di coltura cellulare specifico dipenderà dalla linea cellulare in fase di test. Seguire ATCC raccomandazioni dei media, dove i media di coltura cellulare è tipicamente DMEM + 10% FBS. Ulteriori informazioni si possono trovare nella tabella dei materiali.
- Eseguire una diluizione per consentire la semina di 500-1.000 cellule per 20 microlitri goccia di colture cellulari.
- Acquisire 10 centimetri piatto e aggiungere 5 ml di PBS sterile fino in fondo. Nota: Questo passaggio protegge l'impiccagione scende da evaporazione. A costi inferiori "batteriologiche grade" piatti può essere utilizzato al posto di piatti di coltura cellulare di grado, come le cellule non sarà contagire sulla superficie cultura.
- Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 20 gocce microlitri della sospensione cellulare diluita alla superficie interna del coperchio.
- Pipettare 40 gocce (5 righe di 8 gocce) sul coperchio del piatto 10 cm.
- Capovolgere il coperchio e posizionare sopra la capsula di Petri. Incubare le culture goccia che pendono a 37 ° C per 72 ore per generare sferoidi.
- Capovolgere il coperchio in un fiducioso, ancora modo controllato. Nota: Inversione il coperchio troppo veloce o troppo lento può causare le goccioline a spostare. Alcune linee cellulari possono formare sferoidi in 48 ore o meno, mentre altri possono richiedere più di 72 ore per la produzione di aggregati compatti.
2. Integrazione di Spheroids in 3D Matrix
- Scongelare una aliquota di crescita seminterrato materiali per membrane fattore ridotto a 4 ° C per una notte prima di incorporare sferoidi.
- Opzionale: pozzi di livello con ECM in anticipo per evitare una possibile interazione con il sferoide cultu tessutire di superficie.
- Pipettare 200 ml di ECM per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti.
- La piastra di assicurare che l'ECM copre l'intera superficie ben.
- Rimuovere con cura l'eccesso ECM con una pipetta.
- Incubare la piastra fino a pozzi sono asciutti: 3 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
- Opzionale: pozzi di livello con ECM in anticipo per evitare una possibile interazione con il sferoide cultu tessutire di superficie.
- Raccogliere sferoidi inclinando il coperchio del piatto di coltura tissutale e condivisione del media. Trasferire i media con sferoidi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Lasciare 10 min per sferoidi di depositarsi sul fondo della provetta. Spheroids dovrebbero essere visibili ad occhio.
- Mescolare 100 ml di materiali membrana basale con 100 ml di freddo (4 ° C), collagene di tipo I in un tubo di pre-raffreddata separata. Tenere la miscela a 4 ° C per prevenire o gel dalla solidificazione prematuramente.
- Utilizzare puntali pre-refrigerati se il trasferimento di piccoli volumi.
- Dare attenzione quandomescolando il tipo di materiali membrana basale e collagene che per evitare la formazione di bolle d'aria. Nota: Le bolle d'aria possono ostacolare l'imaging più tardi nel protocollo, se esse sono incorporati nel gel.
- Aspirare sferoidi dal 40 microlitri porzione di fondo della provetta, e si combinano con il materiale della membrana basale / collagene di tipo I miscela. Fare attenzione per evitare la formazione di bolle d'aria in fase di missaggio. Nota: La soluzione contenente 100 microlitri materiali membrana basale, 100 ml di tipo collagene I, e 40 ml di sferoidi creerò materiale sufficiente per 4 culture 3D indipendenti. Questo può essere scalata su o giù.
- Pipettare 40 gocce microlitri della miscela viscosa in centri di pozzetti in una piastra da 24 pozzetti. Mantenere il livello piastra per evitare che il composto scorre verso il lato del pozzo. Nota: Una singola colonna a 24 pozzetti - 4 pozzi - è consigliato per ogni condizione da testare.
- Posizionare la piastra di intoa 37 ° C incubatore e lasciare riposare per 30 minuti. La cultura 3D dovrà polimerizzare durante questo periodo.
- Lentamente immergere le culture 3D in 1 ml di coltura cellulare multimediale.
- Assicurarsi che il supporto è caldo quando aggiungerlo nei pozzetti per promuovere ulteriormente il gel di polimerizzazione.
- PUNTO CRITICO: aggiungere delicatamente il supporto alle culture 3D. Pipettaggio i media troppo in fretta nei pozzetti può portare al distacco delle culture 3D dalla superficie coltura di tessuti.
3. Monitoraggio e analisi Spheroid Invasion
- Invasione Immagine da sferoidi nella matrice 3D circostante a punti temporali decisi dallo sperimentatore. Acquisire fotografie utilizzando un microscopio invertito con la lente dell'obiettivo 20x. Nota: ideali punti temporali variano a seconda della linea cellulare in fase di test. Linee cellulari più invasive inizieranno la loro uscita dagli sferoidi poco dopo la placcatura e, di conseguenza, prendere fotografia iniziales entro un paio d'ore dopo la placcatura. In generale, le fotografie sono prese a 0 ore (dopo la placcatura), 24 ore e 48 ore. Invasione conclude tipicamente 24-48 ore dopo la placcatura.
- Quantificare la capacità invasiva utilizzando il software di analisi di immagine come immagine J.
- Analizzare invasione come la distanza cella dal bordo dello sferoide.
- Utilizzare lo strumento Disegna Dritto per segnare il raggio e / o massima distanza invasivo.
- Fai clic su "Analizza" nel menu in alto, e quindi fare clic su "Misura" per visualizzare la misura della lunghezza.
- Analizzare invasione come l'area totale invasivo al di fuori della sferoide.
- Utilizzare lo strumento Disegno a mano libera per tracciare il confine dello sferoide e / o area totale invasivo.
- Fai clic su "Analizza" nel menu in alto, e quindi fare clic su "Misura" per visualizzare la misura dell'area.
- Utilizzare un plugin come ROI Manager Tools per creare misure per una pila di immagini.
- Analizzare invasione come la distanza cella dal bordo dello sferoide.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Usando il saggio di invasione sferoide (figura 1), un pannello di linee cellulari di tumore è stato testato per la loro capacità di formare sferoidi, così come per la quantità di fuoriuscita di cellule esposte dopo l'impianto in una matrice 3D costituiti da materie membrana basale e collagene di tipo I (Tabella 1). Questi risultati dimostrano che non ogni linea cellulare di tumore creerà sferoidi ben formate, dove le linee cellulari che possiedono una morfologia epiteliale in vi...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo studio ha valutato le prestazioni di un pannello di linee cellulari di cancro in un saggio di invasione sferoide (Tabella 1). Generalmente, troviamo che la formazione sferoide è migliorata in più linee cellulari epiteliali cercando, dove la presenza di giunzioni cellula-cellula promuove la formazione di un'architettura sferoide-like. Linee cellulari noti che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale, come MDA-MB-231 cellule non formano sferoidi nella cultura goccia appeso molto proba...
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Supportato dal NIH sovvenzioni P30 CA051008 e T32 CA009686 (ATR).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Matrigel Fattore di Crescita Ridotto | Corning | CB-40234 | |
| Collagene Tipo I, Coda di Ratto, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0,05% tripsina-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Siero fetale bovino, inattivato a caldo | Omega Scientific | FB-12 | |
| Piastre trattate con TC da 100 mm | Corning Incorporated | 430167 | |
| piastre trattate con TC a 24 pozzetti | NEST Biotecnologia 702001 | ||
| microscopio invertito | |||
| Le linee cellulari sono state mantenute in DMEM + 10% FBS, con l'aspettativa di celle BT-474 e LNCaP, che sono state mantenute in RPMI + 10% FBS. |
Riferimenti
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
