Articolo metodologico

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

DOI:

10.3791/53424

⸱

28 novembre 2015

 ,  , 
1Department of Medical Biochemistry, Experimental Vascular Biology, Academic Medical Center, Amsterdam

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La riprogrammazione metabolica è una caratteristica e un prerequisito per la polarizzazione dei macrofagi M1 e M2. Questo manoscritto descrive un test per la misurazione dei parametri fondamentali della glicolisi e della funzione mitocondriale nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo. Questo strumento può essere applicato per studiare come particolari fattori influenzano il metabolismo e il fenotipo del macrofago.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vie metaboliche specifiche sono sempre più riconosciute come caratteristiche critiche dei sottogruppi di macrofagi. Mentre i macrofagi M1 o M(LPS) classicamente attivati indotti da LPS sono pro-infiammatori, IL-4 induce un'attivazione alternativa dei macrofagi e questi cosiddetti M2 o M(IL-4) supportano la risoluzione dell'infiammazione e la guarigione delle ferite. Recenti evidenze mostrano il ruolo cruciale della riprogrammazione metabolica nella regolazione della polarizzazione dei macrofagi M1 e M2.

In questo manoscritto, viene applicato un analizzatore di flusso extracellulare per valutare le caratteristiche metaboliche dei macrofagi naive, M1 e M2 polarizzati di topo derivati dal midollo osseo. Questo strumento utilizza sensori di pH e ossigeno per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR), che possono essere correlati al metabolismo ossidativo glicolitico e mitocondriale. Pertanto, sia la glicolisi che il metabolismo ossidativo mitocondriale possono essere misurati in tempo reale in un unico test.

Utilizzando questa tecnica, dimostriamo qui che i macrofagi M1 infiammatori mostrano un metabolismo glicolitico potenziato e una ridotta attività mitocondriale. Al contrario, i macrofagi M2 antinfiammatori mostrano un'elevata fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) e sono caratterizzati da un'aumentata capacità respiratoria di riserva (SRC).

Il test funzionale presentato funge da quadro di riferimento per studiare come particolari citochine, composti farmacologici, knock out genici o altri interventi influenzino il fenotipo metabolico e lo stato infiammatorio del macrofago.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mentre i macrofagi hanno un ruolo centrale in quasi tutte le malattie, i meccanismi molecolari che regolano la loro fenotipo non sono ancora completamente svelati. I macrofagi mostrano elevata eterogeneità e in risposta al microambiente adottare diversi fenotipi 1. LPS (+ IFNγ) indotta classicamente attivati ​​M1 o M (LPS) macrofagi favoriscono l'infiammazione e proteggere l'host contro diversi tipi di minacce microbiche 2. Altri usano IFNγ solo o in combinazione con TNF come stimoli per suscitare M1 polarizzazione. IL-4 e / o IL-13 induce l'attivazione dei macrofagi alternativa e questi M2 o M (IL-4) cellule sono potenti soppressori e controller di risposte immunitarie in corso 3. Macrofagi polarizzati mostrano un regolamento distinto di metabolismo cellulare con macrofagi M1 LPS-attivati ​​subendo un interruttore metabolico a una maggiore glicolisi 4-6. Ossidazione degli acidi grassi al contrario, maggiore (FAO) e oxidativ mitocondrialee fosforilazione (OXPHOS) fornisce energia sostenuta IL-4-indotte macrofagi M2 7-9. Così, il metabolismo alterato non è solo una caratteristica di sottoinsiemi macrofagi polarizzati, è anche un prerequisito per una corretta polarizzazione e regolazione infiammatoria. È importante sottolineare che l'inibizione della glicolisi o OXPHOS / FAO ha dimostrato di mettere in pericolo l'attivazione M1 o M2, rispettivamente, 8,10. In quanto tale, individuando cambiamenti metabolici nei macrofagi potrebbe essere applicato come strumento per valutare il loro stato di polarizzazione e il potenziale infiammatorio.

Un test che misura consistente metabolismo macrofagi potrebbe quindi essere utilizzato per prevedere se un farmaco, gene abbattere o altro trattamento colpisce macrofagi polarizzazione e la funzione. In questo video, un analizzatore di flusso extracellulare è utilizzato per caratterizzare i profili di bioenergetica di ingenui, M1 e M2 macrofagi.

Dettagli Questo manoscritto un protocollo ottimizzato che consente la misurazionedi tutti i parametri rilevanti glicolisi (glicolisi, glicolisi massima e riserva glicolitico) e le caratteristiche della funzione mitocondriale (respirazione totale, basale respirazione mitocondriale, la produzione di ATP, di perdita di protoni, respirazione massima e la capacità respiratoria di scorta) in un unico dosaggio. Usando questa configurazione sperimentale, la bioenergetica possono essere confrontati tra controllo e 'alterato' (ad es gene abbattere, sovraespressione transgenici o trattamento farmacologico) cellule.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. I macrofagi coltura e polarizzante midollo osseo

  1. Day 0: femore e tibia Isolare ossa di 6-10 settimane di età i topi di interesse (C57Bl / 6 in questo test).
  2. Rimuovere il tessuto muscolare dalle ossa e posto le ossa in un nove centimetri Petri-piatto pieno di ghiaccio freddo PBS.
  3. Trasferire le ossa per un piatto di nove centimetri di Petri riempite con il 70% di etanolo e agitare leggermente la piastra per 30 sec.
  4. Trasferire le ossa per un nuovo 9 centimetri piastra di Petri pieno di ghiaccio freddo PBS sterile.
  5. Tagliare il femore e tibia ad entrambe le estremità con le forbici sterili.
  6. Sciacquare le ossa con 10 ml di ghiacciata PBS sterile utilizzando una siringa da 10 ml e un ago 25 G. Raccogliere il midollo osseo in un tubo da 50 ml.
  7. Trasferire le cellule del midollo osseo in un tubo da 50 ml con un ago 23 G.
  8. Ripetere questa fase con un ago da 25 G. Nota: sono necessari Questi passaggi per eliminare grumi di cellule e residui ossei.
  9. Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C.
  10. Eliminare il supernatant e risospendere le cellule in terreno 40 ml coltura cellulare (RPMI-1640 più 2 mM L-glutammina, 10% FCS, penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 mcg / ml) e 15% filtrato L-929 cellule ( ATCC CCL-1) medium contenente -conditioned M-CSF (o in alternativa 10 ng / ml M-CSF ricombinante invece di L-929 a medio-cell condizionata).
    Nota: La generazione di medio-cell condizionata L-929 è stato dettagliato in precedenza in questa rivista nel 2013. 11
  11. Coltivare le cellule da un mouse a due 15 centimetri piastre di Petri (non utilizzare piastre di coltura trattata con cellule da macrofagi non si staccherà da questa plastica) in 20 ml di terreno di coltura per piastra in un 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
  12. Aggiungere 10 ml fresco mezzo di coltura cellulare il giorno 3, senza rimuovere i 20 ml più vecchio mezzo di coltura cellulare.
  13. Sostituire il vecchio mezzo di ogni piatto con 20 ml di terreno di coltura fresco il giorno 6. In questo modo, saranno rimosse le cellule non aderenti.
  14. 8 ° giorno:
    1. Staccare le cellule incubando loro 5 min a 37 ° C in 10 ml di soluzione salina di citrato (cloruro di potassio 135 mM e 15 mM citrato di sodio in H 2 O, autoclavato) e lavare con 10 ml di PBS. Conte macrofagi osso maturo derivate dal midollo (BMDM) il giorno 8 con un contatore di cellule.
    2. Verificare la formazione di una matura (CD11b + F4 / 80 +) BMDM mediante ispezione visiva o mediante citometria a flusso. Block 10 5 cellule con 1/100 anti-CD16 / CD32 in PBS per 20 minuti a 100 l di PBS, incubare con 1/200 anti-CD11b-FITC più 1/200 anti-F4 / 80-APC-Cy7 a temperatura ambiente, lavaggio e analizzare mediante citometria a flusso.
      Nota: i macrofagi derivate dal midollo osseo di topo Coltura è stato pubblicato in dettaglio in precedenza in questa rivista da Ying et al 11..
  15. Seed 50.000 cellule (conta delle cellule ottimali devono essere ottimizzate) per bene in una micropiastra coltura cellulare in 100 microlitri terreno di coltura. Non seminare cellule in pozzi di correzione di fondo (A1, A12, H1, H12) e mettere a medio solo (non le cellule) in questi pozzi. Suggerimento: Tenere la pipetta in un angolo unincontro a metà strada lungo il lato dei pozzi per strato cellulare più omogeneo.
  16. Permettono alle cellule di stabilirsi a temperatura ambiente in una cappa di coltura cellulare per 1 ora. Ciò promuoverà la distribuzione uniforme delle cellule e ridurre gli effetti di bordo. Monitorare l'adesione utilizzando un microscopio e la cultura a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
  17. Tre ore dopo la placcatura, stimolare le cellule per 24 ore con 10 ng / ml LPS, o 20 ng / ml il mouse ricombinante IL-4 per generare M1 o M2 macrofagi, rispettivamente. Includere trattati naïve (M0) macrofagi come controllo. Valutare corretta M1 e M2 macrofagi polarizzazione misurando LPS-indotta secrezione di IL-6, IL-12, TNF (ELISA) e IL-4-indotta arginase-1 e / o MMR (CD206) e MGL (CD301) espressione di superficie (citometria a flusso) come descritto in precedenza 3,11.
    Nota: A questo punto, le cellule possono essere (pre) -treated con composti farmacologici di interesse o macrofagi possono essere stimolati con altri fattori. Dal momento che, la variazione tra pozzetti separati potrebbe essere substantial, è consigliabile utilizzare almeno 4 e idealmente 6 pozzetti per condizione.

2. Preparazione del saggio extracellulare Flux

  1. Idratare la cartuccia della sonda un giorno prima di eseguire il test:
    1. Posizionare la cartuccia della sonda a testa in giù accanto al piatto di utilità.
    2. Riempire ciascun pozzetto della piastra di servizio con 200 ml di soluzione calibrante e abbassare la cartuccia del sensore sulla piastra utility immergendo i sensori nella soluzione calibrante.
    3. Verificare il livello della soluzione calibrante è abbastanza alto per mantenere i sensori sommerse e posto in un non-CO 2 a 37 ° C incubatore O / N.
  2. Preparare terreno di coltura il giorno del test come segue:
    1. Caldo medio 50 ml XF di base a 37 ° C.
    2. Aggiungere 500 microlitri 200 mm L-glutammina si porta sul 2 mM concentrazione finale.
    3. Regolare il pH a 7,4 con NaOH 1 N e sterilizzare con un filtro da 0,2 micron e mantenere il terreno di coltura a 37 ° C.
  3. Rimuovere delicatamente il terreno di coltura cellulare dai macrofagi polarizzati e conservarlo a -20 ° C per un uso futuro (ad esempio ELISA esaminare corretto macrofagi polarizzazione). Lavare le cellule con 100 microlitri terreno di coltura, aggiungere 180 microlitri terreno di coltura per pozzetto e verificare sotto il microscopio che le cellule non sono state spazzate via. Posizionare la piastra di coltura cellulare in un 37 ° C incubatore senza CO 2 per 1 ora prima la sessione d'analisi.
  4. Preparare 10 x composto iniezione miscele A fino D come descritto in Tabella 1, riscaldare a 37 ° C, regolare il pH a 7,4 e filtro sterilizzare.
    1. Rendere tutti composti in queste miscele a 10 volte la concentrazione finale nei pozzetti di coltura cellulare e ottimizzare queste concentrazioni per ogni tipo di cellula.
  5. Caricare la cartuccia della sonda con le guide di carico forniti con volumi indicati (Tabella 1) dei preparati 10x miscele composte iniezione nei porti A, B, C e D, faucibusctively.
Miscela / Iniezione Composti Volume aggiunto per ottenere 10x miscela (ml) Volume del dosaggio medio (ml) Volume iniettato durante il funzionamento (ml) Concentrazione finale nel saggio
UN 2,5 M (45%) di glucosio 300 2.7 20 25 MM
B 5mM oligomicina A (OM) 9 3.0 22 1.5 micron
C 5 FCCP mM 9 2.7 25 1.5 micron
Soluzione 100 mM sodio piruvato 300 1 mM
D 5 mM Antimicina A (AA) 15 3.0 28 2,5 micron
5 rotenone mm (Rot) 7.5 1.25 micron

Tabella 1. miscele di iniezione.

3. Caratterizzazione bioenergetica di Polarized M1 e M2 BMDM utilizzando un extracellulare Flux Analyzer

  1. Creare un modello di test con la procedura guidata test con due minuti MIX e 3 volte minuti di misurare e (almeno) 3 misurazioni mix e dei tassi di cicli prima di ciascuno dei 4 iniezioni (Tabella 1) e dopo l'ultima iniezione.
    Nota: Queste concentrazioni sono valide per i macrofagi del midollo osseo e RAW264.7 linee cellulari dei macrofagi, ma dovrebbe essere ottimizzato per ogni tipo di cellula. Aggiunta piruvato nella miscela FCCP è necessaria per alimentare la respirazione massima.
  2. Inizia la corsa spingendo il fondo di avvio e seguire le istruzioni dell'apparato. In primo luogo di carico della vetturaPiastra cartuccia con le sonde idratati per permettere la calibrazione da apparecchi e successivo carico la piastra di cella.
  3. Dopo il test, scartare accuratamente tutto terreno di coltura e memorizzare la coltura cellulare analizzato micropiastra a -20 ° C per una futura normalizzazione cella utilizzando il kit di analisi proliferazione cellulare come descritto in dettaglio dal fornitore.
    1. Brevemente, preparare una memoria di cella-lisi 1x diluendo componente B 20 volte in acqua distillata e diluire composto A 400 volte nel tampone di lisi cellulare 1x. Aggiungere 200 ul per pozzetto, incubare 5 minuti a temperatura ambiente e misurare la fluorescenza con ~ 180 nm di eccitazione e ~ 520 massimi di emissione nm.
      Nota: Quando si lavora con le cellule non aderenti o scarsa aderenza è un problema, il kit di proliferazione cellulare diretto può essere usato come alternativa poiché questo protocollo non richiede scartando tutto terreno di coltura. Tuttavia, questo protocollo diretta è leggermente meno sensibile rispetto al protocollo utilizzato in questo laboratorio.
  4. Dopo la misurazione della fluorescenza, normalizzareil numero di cellule in ciascun pozzetto come rapporto in cui la conta cellulare media di tutti i pozzetti macrofagi naive è impostato a 1.
    Nota: Proteine ​​quantificazione (ad esempio utilizzando un test BCA) potrebbe essere usato come un modo alternativo per normalizzare le cellule conteggi. Tuttavia, nelle nostre mani questo saggio era meno sensibile rispetto al kit saggio di proliferazione cellulare.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dopo aver terminato il flusso di test extracellulare e delle cellule quantificazione, i dati possono essere normalizzati per la conta delle cellule e analizzati. Questo sarà tipicamente resa ECAR e OCR trame come illustrato nella Figura 1A e 1B Figura.

Dopo l'iniezione di glucosio (A), l'aumento ECAR rappresenta il tasso di glicolisi. L'ulteriore aumento ECAR dopo inibizione ATP sintetasi con oligomicina (B) fornisce informazioni sulla riserva di glicolitico e capacità (Figura 1A). Analizzando i valori OCR, oligomicina iniezione (B) consente il calcolo del consumo di ossigeno utilizzato per la sintesi di ATP mitocondriale. FCCP (C) disaccoppia respirazione mitocondriale e le corrispondenti misure di OCR cedere dati sulla massima e la capacità respiratoria di riserva. Infine, l'iniezione di rotenone (Rot) e antimicina A (AA) bloccano mitocondriale complesso I e III e l'OCR residua rappresenta i contro di ossigeno non mitocondrialiumption (Figura 1B).

figure-results-1
Figura 1: parametri metabolici derivati ​​da un test di flusso XF extracellulare. (A) A seguito parametri della glicolisi cellulare sono calcolati a partire dai valori ECAR (in mph / min): la glicolisi, la capacità massima glicolisi e riserva glicolitico. Misure (B) OCR (in pmoli / min) vengono utilizzati per calcolare i successivi parametri fondamentali della funzione mitocondriale: respirazione basale, la produzione di ATP, perdita protonica, massimo la respirazione e la capacità respiratoria di riserva. Gluc = glucosio; OM = oligomicina A; FCCP = carbonile cianuro 4- (trifluorometossi) fenilidrazone; AA = antimicina A; Rot = Rotenone Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Dopo la corsa, ECAR e OCR misurazioni 1 till 15 per ogni bene può essere esportato in Excel e seguenti parametri glicolitici può essere calcolata in base alle misurazioni ECAR come segue:

Acidificazione non glicolitico = avg. ECAR (1,2,3)

Glicolisi = avg. ECAR (4,5,6) - avg. ECAR (1,2,3)

Il numero massimo glicolisi = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (1,2,3)

Riserva glicolitico = avg. ECAR (7,8,9) - avg. ECAR (4,5,6)

Dai tassi OCR, le caratteristiche metaboliche successivi possono essere determinate:

La respirazione non mitocondriale = avg. OCR (13,14,15)

Respirazione basale = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (13,14,15)

La produzione di ATP = avg. OCR (4,5,6) - avg. OCR (7,8,9)

Perdita Proton =avg. OCR (7,8,9) - avg. OCR (13,14,15)

Respirazione massima = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (13,14,15)

Capacità respiratoria di ricambio (SRC) = avg. OCR (10,11,12) - avg. OCR (4,5,6)

figure-results-2
Figura 2:. Caratteristiche del metabolismo degli ingenui (M0), LPS (M1) e IL-4- (M2) macrofagi polarizzati Per ogni misura, la media e l'errore standard della media (SEM) di 8 singoli pozzi è presentato. (A) i tassi di acidificazione extracellulare (ECAR, in mph / min) e (B) Tassi consumo di ossigeno (OCR, in pmoli / min) sono misurati per differenziale polarizzato (M1 e M2) e macrofagi naïve (M0). Tutte le misurazioni sono stati normalizzati per la conta delle cellule (come misurato con CyQUANT) e la conta delle cellule media dei macrofagi ingenui è stato fissato a 1.iniezione A = glucosio; B = oligomicina; C = FCCP; D = A + antimicina rotenone. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Come mostrato in Figura 2A, l'attivazione dei macrofagi con LPS induce aumento del metabolismo glicolitico. Le differenze tra LPS e macrofagi IL-4-trattati sono ancora più evidenti quando si guarda consumi ossigeno (OCR) in Figura 2B. Infatti, mentre il metabolismo ossidativo massima è altamente soppressa nel M (LPS), IL-4 induce la respirazione basale e soprattutto massima nei macrofagi M2. Si deve notare che l'aumento della glicolisi è piuttosto unico di M (LPS) macrofagi e non è necessariamente una caratteristica di macrofagi M1 da M (IFNγ) macrofagi non visualizzano migliorare glicolisi.

Nel complesso, questa analisi flusso extracellulare dimostra that IL-4-indotta macrofagi M2 sono caratterizzate da metabolismo ossidativo maggiore e soprattutto una elevata capacità respiratoria di riserva (SRC), mentre mostra LPS-attivati ​​macrofagi migliorato metabolismo glicolitico e non possiedono alcuna capacità respiratoria di riserva.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lo scopo del nostro laboratorio è quello di capire come la polarizzazione e la funzione dei macrofagi possono essere influenzati con l'obiettivo finale di migliorare il risultato di aterosclerosi e altre condizioni infiammatorie 12. Per valutare la polarizzazione dei macrofagi, si misura in genere i LPS (+ IFNγ) -indotta e IL-4-indotta espressione genica di M1 e M2 geni marcatori (qPCR), determina l'IL-6, IL-12, TNF e NO secrezione (con ELISA e Griess reazione) ed esamina IL-4 indotta da CD71, espressione CD206, CD273 e CD301 superficie (mediante citometria di flusso) e arginasi attività di 3,13. Inoltre, saggi di apoptosi (di annessina-V / PI colorazione), saggi di fagocitosi (con perline fluorescenti di lattice e / o pHrodo E. coli) e saggi di formazione di cellule schiumose (da DII-oxLDL captazione, LipidTOX colorazione neutra lipidi) possono essere eseguite per valutare la funzionalità dei macrofagi 14. Inoltre, l'analisi del flusso extracellulare può essere effettuata per misurare bioenergetica profili di mac polarizzatorophages come una nuova e alternativa di lettura funzionale.

Questo manoscritto dimostra che la polarizzazione dei macrofagi induce riprogrammazione metabolica con macrofagi LPS-indotta di commutazione ad un aumento della glicolisi come fonte di energia. Viceversa, macrofagi M2 IL-4-indotti, usare la fosforilazione ossidativa mitocondriale come principale fonte di ATP. È importante sottolineare che, riprogrammazione metabolica non solo fornisce energia per le particolari esigenze di M1 e M2 macrofagi polarizzati. In effetti, i cambiamenti metabolici influito sulle concentrazioni del metabolita che sono regolatori diretti del macrofagi fenotipo 10,15,16. Quindi, il metabolismo dei macrofagi non è solo una caratteristica (come mostrato qui in figura 2), ma anche un pilota di diversi stati di polarizzazione dei macrofagi e questa nuova conoscenza ha sostenuto la rapida crescita del settore della ricerca immunometabolism durante l'ultimo paio di anni.

Tuttavia, le misure robuste di profili metabolici nella macrofagi rimasta difficile e avevano i loro limiti. In questo studio, un analizzatore flusso extracellulare viene applicato per misurare robusto glicolisi, riserva glicolitico, massima capacità glicolitica, acidificazione non glicolitico, basale e respirazione massima, la produzione di ATP, capacità respiratoria ricambio, perdita protonica e respirazione non mitocondriale in tempo reale in una quantità minima di macrofagi.

Pertanto, abbiamo modificato e migliorato i protocolli del produttore come segue. La prova di stress Mito standard (# 103015-100) suggerisce di utilizzare media con glucosio e piruvato e un protocollo con 3 iniezioni (OM, FCCP, AA / Rot). Optiamo per avviare il test con glucosio / terreno privo di piruvato, aggiungere glucosio come prima iniezione nel canale A (come nella glicolisi Stress Test # 103.020-100) e aggiungere piruvato insieme sganciamento FCCP porta C. In questo modo , tutti i parametri glicolisi rilevanti derivano dalle misure ECAR 1-9 e tutte le informazioni utili su mitochondrifunzione al di misure OCR 4-15.

Si noti che è fondamentale per iniettare piruvato insieme con FCCP per alimentare la respirazione massima su sganciamento. Prima di utilizzare questo protocollo combinato, si dovrebbe anche verificare che il 2-Deoxy-D-glucosio (2-DG) abbassa i livelli di ECAR dopo il test ai valori basali (1-3) e che i tassi di ECAR registrati 4-6 sono infatti dovuti a glicolisi. Inoltre, si dovrebbe comprendere che le concentrazioni composti e numero di cellule utilizzate in questo manoscritto sono valide per i macrofagi del midollo osseo e RAW264.7 linee cellulari dei macrofagi e dovrebbero essere ottimizzati per altri tipi di cellule. Inoltre, è da notare che M-CSF, che viene utilizzato per generare macrofagi del midollo osseo promuove un fenotipo antinfiammatorio M2-like. I risultati presentati dai macrofagi del midollo osseo possono quindi non essere pienamente comparabili a misurazioni con macrofagi del tessuto primario o macrofagi linee cellulari che non richiedono M-CSF durante Culturi celluleng.

Rispetto ai metodi esistenti, questo protocollo richiede minime quantità di macrofagi e fornisce rapidamente quasi tutti caratteristiche cellulari metaboliche fondamentali. Ciò si traduce in cellule in eccedenza sufficiente per eseguire altri test immunologici e anche le cellule usate per la profilazione bioenergetica potrebbe ancora essere utilizzato per altri purposed dopo il test. Inoltre, la particolare disposizione della piastra 96 ​​e consente di valutare più condizioni in tempo reale allo stesso tempo. Tuttavia, la variazione tra singoli pozzetti può essere considerevole e quindi l'uso di almeno 4 pozzi per condizione è spesso desiderato. Preso questa limitazione in considerazione, l'analisi flusso extracellulare descritta consente comunque di eseguire più di 10 condizioni sperimentali (n = 6) in una sola volta, che è molto più rispetto alle tecniche tradizionali.

Nel complesso, questo articolo fornisce un test funzionale semplice e riproducibile che consente di misurare tutto glicolisi pertinenti e param mitocondrialeetri a sottoinsiemi macrofagi polarizzati. Questa tecnica può servire come una domanda futura per valutare la funzione dei macrofagi e per valutare l'effetto di manipolazioni distinti (ad esempio gene abbattere, nuovi farmaci, etc.) il (metabolica) fenotipo del macrofago. Come tale, i dati di flusso extracellulari possono essere utilizzati in combinazione con altri metodi per permettere caratterizzazione approfondita dello stato di attivazione dei macrofagi.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Accesso gratuito a questo articolo è sponsorizzato da Seahorse Bioscience.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan Van den Bossche ha ricevuto una borsa di studio Junior Postdoc dalla Netherlands Heart Foundation (2013T003) e una borsa di studio VENI da ZonMW (91615052). Menno de Winther è un ricercatore affermato della Netherlands Heart Foundation (2007T067), è supportato da una sovvenzione della Netherlands Heart Foundation (2010B022) e detiene una borsa di studio AMC. Ringraziamo anche il sostegno dell'Iniziativa olandese per la ricerca cardiovascolare, della Federazione olandese dei centri medici universitari, dell'Organizzazione olandese per la ricerca e lo sviluppo sanitario e dell'Accademia reale olandese delle scienze per il progetto GENIUS "Generazione dei migliori bersagli farmaceutici basati sull'evidenza per l'aterosclerosi" (CVON2011-19). Ringraziamo Seahorse Bioscience per aver reso possibile la pubblicazione ad accesso aperto. Gli autori ringraziano Riekelt Houtkooper e Vincent de Boer (Laboratory Genetic Metabolic Diseases, Academic Medical Center, Amsterdam, Paesi Bassi) per tutta l'assistenza fornita con l'analizzatore Seahorse.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Aghi 23G e 25GBecton Dickinson#300800 e #300600Siringhe da 10 ml per midollo osseo lavato
Becton Dickinson#307736per midollo osseo
lavato Greiner#639161Per coltivare cellule di midollo osseo
Kit per il saggio di proliferazione cellulare CyQUANT Sonde molecolari#C7026Per la quantificazione cellulare in un momento successivo (funziona solo per le cellule aderenti)
Kit per il saggio di proliferazione cellulare diretta CyQUANT Sonde molecolari#35011Per la quantificazione cellulare immediatamente dopo il saggio (cellule non aderenti)
XFe96 micropiastra per colture cellulariCavalluccio marino#101085-004Piastra a 96 pozzetti in cui vengono coltivate le cellule e in cui viene eseguito il saggio
interleuchina-4 di topo ricombinante (IL-4)Peprotech#214-14-BUtilizzato per indurre l'attivazione
alternativa dei macrofagilipopolisaccaride (LPS)Sigma#L2637con stimolo pro-infiammatorio
 Seahorse Bioscience#102416-100Contiene le sonde per la misurazione di pH e O2
Seahorse XF Calibrant Seahorse Bioscience#100840-000Necessario per idratare le sonde durante la notte 
XF base media Seahorse Bioscience#102353-100Terreno senza tampone che consente una misurazione efficiente delle variazioni di pH
L-glutamminaLife Technologies#25030-081
D-(+)-GlucosioSigma#G8769Alimenta la glicolisi una volta aggiunta alle cellule
oligomicina A Sigma#75351Inibisce l'ATP sintasi mitocondriale
FCCP( Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone)Sigma#C2920Separa la respirazione mitocondriale
100 mM Soluzione di piruvato di sodioLonza#BE13-115EConsente la massima respirazione mitocondriale senza la necessità di glicolisi
Antimicina ASigma#BE13-115EA8674Inibisce il complesso III dei mitocondri
RotenoneSigma#BE13-115EA8674R8875Inibisce il complesso I del mitocondri
Contatore di cellule CasyRoche Diagnostics#05 651 697 001Strumento per contare le cellule
anti-CD16/CD32eBioscience#14-0161Citometria a flusso a blocchi del recettore Fc
anti-F4/80-APC-eFluor780eBioscience#47-4801Anticorpo per colorare i macrofagi
anti-CD11b-FITCeBioscience#11-0112Anticorpo per colorare i macrofagi
Per piastre di Petri Cartuccia sensore cavalluccio marino

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).">Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41, 14-20 (2014).
  2. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).">Hoeksema, M. A., et al. IFN gamma Priming of Macrophages Represses a Part of the Inflammatory Program and Attenuates Neutrophil Recruitment. J Immunol. , (2015).
  3. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).">Vanden Bossche, J., et al. Pivotal Advance Arginase 1 independent polyamine production stimulates the expression of IL 4 induced alternatively activated macrophage markers while inhibiting LPS-induced expression of inflammatory genes. Journal of leukocyte biology. 91, 685-699 (2012).
  4. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).">Pearce, E. L., Pearce, E. J. Metabolic pathways in immune cell activation and quiescence. Immunity. 38, 633-643 (2013).
  5. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436(2014).">Yang, L., et al. PKM2 regulates the Warburg effect and promotes HMGB1 release in sepsis. Nature communications. 5, 4436(2014).
  6. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).">Freemerman, A. J., et al. Metabolic reprogramming of macrophages glucose transporter 1 (GLUT1) mediated glucose metabolism drives a proinflammatory phenotype. The Journal of biological chemistry. 289, 7884-7896 (2014).
  7. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).">Tavakoli, S., Zamora, D., Ullevig, S., Asmis, R. Bioenergetic profiles diverge during macrophage polarization implications for the interpretation of 18F FDG PET imaging of atherosclerosis. J Nucl Med. 54, 1661-1667 (2013).
  8. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).">Vats, D., et al. Oxidative metabolism and PGC 1beta attenuate macrophage mediated inflammation. Cell metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).">Huang, S. C., et al. Cell intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nature immunology. 15, 846-855 (2014).
  10. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).">Tannahill, G. M., et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL 1beta through HIF 1alpha. Nature. 496, 238-242 (2013).
  11. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).">Ying, W., Cheruku, P. S., Bazer, F. W., Safe, S. H., Zhou, B. Investigation of macrophage polarization using bone marrow derived macrophages. J Vis Exp. (76), (2013).
  12. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).">Hoeksema, M. A., et al. Targeting macrophage Histone deacetylase 3 stabilizes atherosclerotic lesions. EMBO Mol Med. 6, 1124-1132 (2014).
  13. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).">Vanden Bossche, J., et al. Alternatively activated macrophages engage in homotypic and heterotypic interactions through IL 4 and polyamine induced E cadherin catenin complexes. Blood. 114, 4664-4674 (2009).
  14. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).">Van den Bossche, J., et al. Inhibiting epigenetic enzymes to improve atherogenic macrophage functions. Biochem Biophys Res Commun. 455, 396-402 (2014).
  15. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420(2014).">Galvan Pena, S., O Neill, L. A. Metabolic reprograming in macrophage polarization. Frontiers in immunology. 5, 420(2014).
  16. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).">Zhu, L., Zhao, Q., Yang, T., Ding, W., Zhao, Y. Cellular metabolism and macrophage functional polarization. International reviews of immunology. 34, 82-100 (2015).

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Polarizzazione dei macrofagi M1Polarizzazione dei macrofagi M2Metabolismo glicoliticoMetabolismo ossidativo mitocondrialeTasso di consumo di ossigenoTasso di acidificazione extracellulareCapacit respiratoria di riservaSaggio metabolico in tempo reale

Articoli correlati