Sviluppo di una striscia reattiva Immunocromatografico oro colloidale-based per il rilevamento di Cetacei mioglobina

Summary

Questo protocollo descrive lo sviluppo di due anticorpi monoclonali (mAb) di classe IgG fortemente reattivi alla mioglobina dei cetacei. Questi mAb vengono applicati su una striscia reattiva immunocromatografica all'oro colloidale basata sul formato a sandwich per differenziare il Mb dei cetacei dalla foca e da altri animali.

Abstract

Questo protocollo descrive lo sviluppo di una striscia reattiva immunocromatografica all'oro colloidale basata sul formato a sandwich che può essere utilizzata per differenziare la mioglobina (Mb) dei cetacei da quella delle foche e di altri animali. La striscia fornisce uno screening rapido e in loco per la carne di cetaceo, limitandone così il commercio e il consumo illegali. Sono stati sviluppati due anticorpi monoclonali (mAb) con reattività verso il Mb dei cetacei. Le sequenze aminoacidiche delle regioni reattive antigeniche di Mb provenienti da vari animali sono state analizzate al fine di progettare due peptidi sintetici (un peptide generale e un peptide specifico) e successivamente aumentare gli anticorpi monoclonali (sottoclasse IgG₁). Gli anticorpi monoclonali sono stati selezionati da ibridomi sottoposti a screening mediante ELISA indiretto, western blot e dot blot. Il CGF5H9 era specifico per i Mbs di conigli, cani, maiali, mucche, capre e cetacei, mentre mostrava un'affinità debole o nulla per i Mbs di polli, tonni e foche. CSF1H13 possono legare foche e cetacei con una forte affinità, ma non hanno mostrato alcuna affinità con altri animali. In questo studio sono stati utilizzati campioni di cetacei di quattro famiglie (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae e Kogiidae) e i risultati hanno indicato che questi due mAb hanno un'ampia capacità di legame con i Mbs di diversi cetacei. Questi anticorpi monoclonali sono stati applicati su una striscia reattiva immunocromatografica all'oro colloidale di tipo sandwich. Il CGF5H9, che riconosce molte specie, è stato marcato con oro colloidale e utilizzato come anticorpo di rilevamento. CSF1H13, che era rivestita sulla zona di prova, ha rilevato la presenza di cetacei e foche Mbs. Campioni muscolari di tonno, pollo, foca, cinque specie di mammiferi terrestri e 15 specie di cetacei sono stati testati in triplice copia. Tutti i campioni di cetacei hanno mostrato risultati positivi e tutti gli altri campioni hanno mostrato risultati negativi.

Introduction

Storicamente, la carne di cetaceo è stata consumata in molte parti del mondo e questo consumo continua ancora oggi¹. A causa del livello trofico dei cetacei, è noto che nella loro carne sono presenti alti livelli di mercurio e altre tossine². Pertanto, il consumo di carne di cetacei potrebbe portare a un problema di salute non solo per i gruppi ad alto rischio come le donne incinte, ma anche per la popolazione generale³. Inoltre, la contaminazione della carne di cetaceo con agenti patogeni zoonotici o potenzialmente zoonotici può verificarsi anche durante la sua lavorazione e conservazione⁴. È difficile anche per gli agenti esperti identificare le carni di cetacei solo dal loro aspetto. Pertanto, è necessario un metodo scientifico affidabile di identificazione per differenziare la carne di cetaceo da altre carni. Ciò contribuirebbe a limitare il consumo di carne di cetacei.

Gli attuali metodi di identificazione delle specie includono tecniche molecolari e metodi immunologici. Le tecniche molecolari, come la reazione a catena della polimerasi (PCR) e il sequenziamento del DNA, possono essere utilizzate per identificare campioni non solo da carne cruda⁵ e campioni decomposti⁶, ma anche da alimenti trasformati come salsicce cotte e mangimi^7,8. I metodi immunologici, come il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), sono comunemente applicati nella produzione alimentare per rilevare il contenuto di carne, ad esempio, di maiale⁹, manzo¹⁰ e pesce gatto¹¹. L'analisi del DNA basata sulla PCR per l'identificazione della carne di cetaceo è disponibile¹² e ha contribuito a prevenire il commercio internazionale illegale di carne di cetaceo in Giappone, Corea del Sud, Filippine, Taiwan, Hong Kong, Russia, Norvegia e Stati Uniti¹. Questi metodi sono efficaci e affidabili, ma possono richiedere ore o giorni per essere completati e comportare passaggi laboriosi. L'identificazione delle carni di cetacei si basa solitamente su tecniche molecolari e attualmente non è disponibile alcun metodo immunologico. Per le agenzie di regolamentazione, è altamente auspicabile sviluppare una tecnica affidabile e rapida che possa essere utilizzata sul campo per identificare le carni di cetacei.

Le strisce immunocromatografiche vengono utilizzate come strumenti di rilevazione con il vantaggio di produrre risultati rapidi tramite un protocollo semplice adatto per l'uso sul campo. I principi della striscia immunocromatografica e dell'ELISA sono molto simili e includono anticorpi, antigeni ed etichette. Molte etichette diverse come l'oro colloidale, il carbonio e il lattice sono state utilizzate nello sviluppo di strisce immunocromatografiche. Attualmente, questo metodo è comunemente usato per rilevare antibiotici, tossine, batteri e virus¹³, ma è raramente usato per identificare le proteine nella carne^14,15. Qui proponiamo un saggio immunoenzimatico cromatografico a flusso laterale per la rilevazione rapida della mioglobina dei cetacei (Mb).

Protocol

Etica Dichiarazione: Lo studio è stato eseguito in conformità con le linee guida internazionali e approvato dal Comitato Istituzionale cura e l'uso degli animali (IACUC) della Nazionale Chiayi University, ID di approvazione: 99022. L'utilizzo di esempio cetaceo è stato consentito dal Consiglio Agricoltura di Taiwan (Research Permesso 100M-02.1-C-99).

1. muscolare preparazione del campione e SDS-PAGE

Nota: I campioni muscolari provenienti da 23 specie, tra cui 16 specie di mammiferi marini, 5 specie di mammiferi terrestri, tonno e pollo sono stati utilizzati in questo studio (Tabella 1). I campioni di muscolo di cetacei sono stati ottenuti da individui bloccati, catture accessorie della pesca, e la confisca. Coniglio, ratto, cane e tessuti muscolari pollo sono stati ottenuti da animali diagnostico Centro Nazionale Chiayi University. I campioni di carne di manzo, maiale, agnello, e il tonno sono stati acquistati da un supermercato locale. Il campione di muscolo di Seal Harbor (Phoca vitulina ) è stato fornito da Farglory Ocean Park. Sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) è stato usato per separare le proteine ​​solubili con differenti pesi molecolari in campioni di muscolo.

1. Conservare tutti i campioni a -20 ° C fino al momento dell'uso.
2. Pre-cool malta a -20 ° C. Poi mettere 3 g di campione muscolare congelato in esso.
3. Omogeneizzare il campione con 10 ml di freddo fosfato salino (PBS) utilizzando un omogeneizzatore tessuto.
4. Centrifugare il campione omogeneizzato a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e conservarlo a -20 ° C fino al momento dell'uso.
5. Preparare 5 ml di 5% stacking gel (3,07 ml di acqua distillata, 1,25 ml di 4x tampone di gel superiore pH 6,8, 625 ml di 40% acrilammide, 50 ml di 10% ammonio persolfato (APS), e 5 ml di tetrametiletilendiammina ( TEMED)) e 10 ml di 15% gel di separazione (3,65 ml di acqua distillata, 2,5 ml di tampone di 4x inferiore gel a pH 8.8, 3.75 ml di 40% acrilammide, 100 ml di 10% APS,e 4 ml di TEMED).
   1. Nella cella elettroforesi, versare stacking gel (5% acrilammide) sulla parte superiore del gel di separazione (15% acrilammide) alla quale è solidificato. Inserire un pettine gel nel gel di impilamento.
6. Eseguire pagina in base alle seguenti condizioni: condizione corsa iniziale: 100 volt, 20 min e condizione finale: 120 volt, 40 min.
7. Macchia il gel con Coomassie Brilliant Blue a temperatura ambiente per 30 minuti fino a quando il gel è uniformemente colore blu.
   Nota: La colorazione è completa quando il gel è più visibile nella soluzione colorante.
8. Decolorare con soluzione di acido acetico (10%) a temperatura ambiente per 1 ora. Bande inizieranno ad apparire. Continuare la decolorazione a 4 ° C durante la notte fino a quando lo sfondo è chiaro.

2. Peptide Synthesis e monoclonale di produzione

1. Recuperare le sequenze di amminoacidi di Mb da GenBank tra cui il tonno, pollo, struzzo, mammiferi domestici, di tenuta e di 18 speciedei cetacei (Tabella 2).
2. Allineare le sequenze utilizzando una corretta software ^16:
   1. Lanciare l'allineamento Explorer selezionando l'Align: Modifica / Crea allineamento sulla barra di avvio; selezionare Crea nuovo allineamento e fare clic su OK. Apparirà una finestra di dialogo che chiede "State voi costruendo un allineamento di sequenze di DNA o proteine?"
   2. Fare clic sul pulsante "Protein"; selezionare Data: Open: Recupero sequenze di selezionare il file di sequenza di file e; selezionare l'Edit: Seleziona tutto il comando di menu per selezionare tutti i siti per ogni sequenza nel set di dati per la creazione di un allineamento di sequenze multiple.
   3. Selezionare Allineamento: Allinea dal ClustalW dal menu principale per allineare i dati di sequenze selezionate utilizzando l'algoritmo ClustalW; selezionare "BLOSUM" come proteine ​​Peso Matrix quindi fare clic sul pulsante OK.
3. Analizzare l'allineamento di sequenze:
   1. Focus su 5 antigenica si reattivaTES ^17: 1 sito (AKVEADVA, 15-22), sito 2 (KASEDLK, 56-62), sito 3 (ATKHKI, 94-99), sito 4 (HVLHSRH, 113-119) e il sito 5 (KYKELGY, 145- 151) e trovare il frammento conservato tra i cetacei. Un * (asterisco, simbolo consenso nella allineamento (protocollo 2.2.3)) indica le posizioni che hanno un singolo residuo, completamente conservato. I seguenti frammenti conservati nei cetacei sono stati trovati: sequenza KASEDLKKHG (che include posto 2) e la sequenza HVLHSRHP (che include posto 4).
4. Sintetizzare frammenti di sequenze candidate secondo l'analisi di sequenza, e coniugato con una proteina ovalbumina (OVA) come proteina carrier utilizzando servizi commerciali.
   1. Aggiungere amminoacidi idrofobici (ad esempio, metionina) al N-terminale di antigenico sito reattivo per impedire il peptide dalla decomposizione (ad esempio, M-KASEDLKKHG).
   2. Prolungare il C-terminale della antigenico sito reattivo per esporre il sito antigenico nucleo al immunocyte. Inoltre, conjucancello il peptide OVA con l'aggiunta di una cisteina (Cys, C) al C-terminale (ad esempio, M-KASEDLKKHG-NTVL-C).
5. Emulsionare adiuvante completo di Freund per immunogeno 1 o adiuvante incompleto di Freund per immunogeno 2 con un uguale volume di ciascun peptide sintetico in PBS (3 ml, concentrazione finale 30-50 mg / 100 ml).
6. Seminare immunogeno 1 (0,1 mg) per via sottocutanea in ciascuna delle 5 femmine topi BALB / c.
7. Eseguire iniezioni di richiamo sottocutanee cinque volte utilizzando immunogeno 2 a intervalli di due settimane e raccogliere i sieri a campione clip di coda dei topi prima di ogni richiamo.
8. Determinare titolo sieri per la prima proiezione.
   1. Sciogliere 100 mg di peptide libera in 25 ml di tampone di reazione e un'aliquota di 50 microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 10 ml soluzione di accoppiamento di reagente in ogni pozzetto e mescolare il piatto. Incubare la piastra per 2 ore a temperatura ambiente.
   2. Rimuovere il contenuto del pozzo,lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata, e bloccare la piastra aggiungendo 200 ml di soluzione bloccante. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Rimuovere il contenuto e lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata.
   3. Eseguire indiretta ELISA (Protocollo 5,1-5,7) per la determinazione sieri titolo per la prima proiezione. Scegliere il mouse con il più alto titolo (più alta densità ottica) per la raccolta della milza.
9. Tre giorni prima della raccolta della milza, inoculare 0,1 mg di immunogeno 1 per via sottocutanea nel mouse che presenta il più alto titolo.
10. Raccogliere le cellule della milza di topi immunizzati selezionati e si fondono con cellule murine mieloma F0 (SP2 / 0-AG14) per ottenere cellule ibridomi per la generazione di mAb ^18.
11. 14 giorni dopo la fusione, selezionare i cloni positivi per lo screening della reattività dei surnatanti ibridomi verso peptide sintetico gratuitamente utilizzando ELISA indiretto (Protocollo 5,1-5,7).
12. Diluire le cellule di un numero adeguato per bene per maximizzione della percentuale di pozzi che contengono solo un singolo clone (diluizione clonazione).
    1. Aggiungere 100 ml di terreno di coltura cellulare a tutti i pozzetti della piastra a 96 pozzetti tranne pozzetto A1 che viene lasciato vuoto.
    2. Aggiungere 200 ml di sospensione cellulare per pozzetto A1. Poi trasferire rapidamente 100 ml da A1 a B1 e mescolare pipettando delicatamente. Ripetere questi 1: 2 diluizioni lungo l'intera colonna, e poi scarta 100 microlitri da H1 modo che finisce con lo stesso volume pozzetti sopra di esso.
    3. Aggiungere ulteriori 100 ml di medio-colonna 1 con una micropipetta a 8 canali. Poi trasferire rapidamente 100 microlitri da ogni pozzetto della colonna 1 a quelle nella colonna 2 utilizzando la stessa pipetta, e mescolare pipettando delicatamente.
    4. Utilizzando le stesse punte, ripetere questi 1: 2 diluizioni attraverso l'intero piatto. Scartare 100 ml da ciascuno dei pozzi nell'ultima colonna.
    5. Portare il volume finale di ciascun pozzetto a 200 microlitri aggiungendo 100 microlitri medio in ciascun pozzetto. incubare plate indisturbato a 37 ° C in un umidificata CO ₂ incubatore.
    6. Controllare ogni bene e segnare tutti i pozzetti che contengono solo una singola colonia. Effettuare due o più clonazioni fino> 90% dei pozzetti contenenti singoli cloni sono positivi per la produzione di anticorpi.
13. Schermo i cloni di western blot e dot blot (protocollo 3,1-4,6). Poi colonie sottocultura dai pozzetti in vasi più grandi per espandere le cellule per ottenere il mAb. Di solito ogni clone viene trasferito in un unico bene in una piastra a 12 o 24 pozzetti.
14. Misurare l'affinità tra i mAbs e gli estratti del muscolo di vacca, capra, maiale, cane, coniglio, tonno, pollo, sigillo, e quattro specie di cetacei rappresentativi di western blot e dot blot (protocollo 3,1-4,6).
15. Seminare cellule di ibridoma selezionati (fino a 3 x 10 ⁶⁾ per via intraperitoneale in topi per indurre ascite. gonfiore addominale è in genere manifesta entro 7-10 giorni dopo l'iniezione di ibridomi. Raccogliere fluido usando un ago ipodermico(Meno di 20 gauge).
16. asciti Centrifuga (10.000 xg per 10 min) per rimuovere le cellule e detriti. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 micron. Aggiungere 1 a 20 ml del campione, 15 ml di tampone di legame, e da 3 a 5 ml di tampone di eluizione in colonna G Sepharose proteina. Raccogliere la frazione di eluizione contenente anticorpo purificato dal liquido ascitico topi.
17. Determinare la isotipo anticorpale dal kit isotyping anticorpi utilizzando le istruzioni del produttore.

3. Western Blot

1. Preparare tampone di caricamento 2x contenente β-mercaptoetanolo (BME) mescolando 950 ml di tampone campione 2x Laemmli con 50 ml di BME. Diluire il surnatante muscolari (protocollo 1.1-1.4) in tampone di caricamento con rapporto adeguato per ottenere buoni segnali: 1:50 (cetacei e foche) e 1: 5 (animali domestici e tonno) quando si utilizza l'anticorpo Mb policlonale di coniglio anti-umano, e 1: 1 (maiale, coniglio, pollo e tonno), 1: 5 (di mucca, capra e cane), e 1:25 (cetacei e il sigillo) quando unntibody è da ibridoma surnatante.
2. campione di calore a 95 ° C per 5 min. Caricare i campioni nei pozzetti di gel SDS-PAGE (4% acrilammide impilamento e il 12% di acrilammide separazione) insieme con marcatori di peso molecolare. Eseguire il gel per 5 minuti a 50 V quindi aumentare la tensione di 150 V per terminare la corsa in circa 1 ora.
3. Porre il gel in tampone di trasferimento 1x per 15 min. Trasferire la proteina separato per nitrocellulosa (NC) membrane dopo che sono separate da PAGE. Il trasferimento può essere fatto a 100 V per 60-90 min.
4. Preparare la soluzione bloccante: 1x PBS contenente 0,1% di Tween 20 con 5% latte in polvere senza grassi. Bloccare la membrana NC in 25 ml di soluzione bloccante a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare tre volte per 5 minuti ciascuno con 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato con Tween 20 (PBST).
5. Incubare la membrana e anticorpo primario (asciti o ibridoma surnatante) in 10 ml di tampone di diluizione anticorpo diluito con soluzione di saturazione 5% a 4 ° C durante la notte.
6. Lavare il membrane tre volte ancora con PBST per pulire anticorpi eccessivo.
7. Incubare la membrana con fosfatasi alcalina di capra coniugato anti-IgG di topo a 1: 1.250 in soluzione bloccante con agitazione per 1 ora a temperatura ambiente.
8. Lavare la membrana ancora e incubare in cloruro di fosfato / p-nitroblu tetrazolio 5-bromo-4-cloro-3-indolil (BCIP / NBT) fosfatasi miscela substrato per 10 a 20 minuti fino a quando lo sviluppo del colore.
9. Arrestare la reazione lavando la membrana in numerosi cambi di acqua distillata.

4. Dot Blot

1. Diluire il surnatante muscolari (protocollo 1.1-1.4) in 5% di albumina sierica bovina (BSA) in PBST con rapporto adeguato per ottenere buoni segnali: 1: 5 per gli animali domestici e tonno, e 1:25 per i cetacei e di tenuta. Spot 5 ml di campioni su una membrana. Minimizzare la zona che la soluzione penetri (solitamente 3-4 mm di diametro) applicando lentamente.
2. Essiccare la membrana a temperatura ambiente (ad esempio, </ Em> in un flusso laminare per 30-60 min), bloccarlo con soluzione bloccante in piastra di Petri per 1 ora a temperatura ambiente, e lavarlo con PBST.
3. Incubare la membrana con l'anticorpo primario (mAb da ibridoma supernatante a 1: 10.000 o asciti a 1: 100.000 diluito in soluzione di saturazione 5%) per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Utilizzare PBST per lavare la membrana tre volte per 5 minuti ciascuno per rimuovere l'eccesso di anticorpi, e poi incubare con anticorpo secondario (alcalina capra fosfatasi-coniugato anti-IgG di topo a 1: 1.250 in 5% soluzione di saturazione) per 1 ora a temperatura ambiente .
5. Lavare nuovamente la membrana e incubare nella miscela di substrato per la fosfatasi BCIP / NBT entro 10 a 20 minuti fino a quando lo sviluppo del colore.
6. Arrestare la reazione lavando la membrana in numerosi cambi di acqua distillata.

5. ELISA indiretto

1. Preparare tampone di lavaggio (0,002 M imidazolo salina tamponata con 0,02% Tween 20). Lavare la piastra 3 volte con il lavaggiocuscinetto tra ogni passo successivo (protocollo 5,2-5,5).
2. Preparare 01:25 diluizione supernatanti muscolari (protocollo 1.1-1.4) in tampone di rivestimento. Coat un 96-pozzetti ELISA con 100 microlitri supernatanti diluiti a 4 ° C durante la notte e bloccarlo con tampone di bloccaggio (1% BSA in PBS) per 1 ora a temperatura ambiente.
3. Preparare 1: 2.000 diluizione del mAb purificata con tampone diluito e aggiungere 100 ml di diluito mAb in ogni pozzetto. Incubare la piastra per 1 ora a temperatura ambiente.
4. Aggiungere capra anti-IgG di topo coniugato con perossidasi di rafano (diluizione 1: 200 in tampone diluito) per ulteriore incubazione.
5. Aggiungere substrato perossidasi a ciascun pozzetto (100 microlitri / pozzetto) e incubare per 10-15 min.
6. Arrestare la reazione enzimatica dalla soluzione di arresto perossidasi (100 l / pozzetto) quando si osserva lo sviluppo del colore.
7. Leggere la densità ottica a 450 nm utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre.

6. Preparazione di oro colloidale marcato mAb

Nota: Il colore della soluzione di oro colloidale, e la miscela deve sempre essere rosso. Regolare il pH, la concentrazione di mAb, velocità di centrifuga quando precipitato nero è notato. I passi 6.1 e 6.2 sono passaggi di ottimizzazione.

1. Aggiungere purificato rilevare mAb (50 ug / ml, 3 ml) a 100 ml di soluzione di oro colloidale con valori di pH variabili da 5-9. Il pH minima che mantiene il colore rosso per due ore è considerato come il pH ottimale. Nota: In questo studio, 0,1 M carbonato di potassio è stato usato per regolare la soluzione a pH 8,0 (pH ottimale) oro colloidale (40 nm).
2. Aggiungere varia quantità di purificati rilevare mAb (500 ug / ml, 1-20 microlitri) a 100 ml di soluzione di oro colloidale a pH 8,0. Nota: la concentrazione ottimale in questo studio è di 6 mg / ml (senza precipitato nero).
3. Secondo i risultati di cui sopra, aggiungere 60 mg di rilevare purificato mAb goccia a goccia a 10 ml di soluzione di oro colloidale. Emulsionare il composto delicatamente a temperatura ambiente per 10 min. Anno Dominid 2 ml di soluzione al 5% di BSA in PBS (pH 7,4) alla miscela e emulsionare delicatamente a temperatura ambiente per 15 minuti per ridurre l'interferenza sfondo.
4. Centrifugare la miscela a 10.000 xg per 30 min a 4 ° C.
5. Rimuovere il surnatante con l'anticorpo coniugato con attenzione e sospendere il pellet risultanti in 4 ml di PBST contenente 1% di BSA e 0,1% Tween 20, e ripetere centrifugazione e sospensioni più volte.
6. Sospendere i precipitati finali in 1 ml PBST e conservarlo a 4 ° C fino all'uso.

7. Costruzione di Immune Striscia

Nota: la figura 1 mostra la struttura della striscia immunitario. Preparare e assemblare le strisce in un basso di umidità laboratorio condizione ambientale (<20% di umidità relativa) per la durata di conservazione prolungata (> 1 anno). Le dimensioni del pad e membrana sono: coniugato pad 300 mm x 10 mm, tampone assorbente 300 mm x 24 mm, pad campione di 300 mm x 24 mm, NC membrana 300 mm x 25 millimetri, cartone 300mm x 80 mm.

1. Aggiungere la soluzione mAb marcato con oro colloidale dal punto 6.6 con una micropipetta per saturare il pad coniugato e poi asciugare a 37 ° C per 1 ora prima del montaggio.
2. Distribuire specifico antigene cattura mAb (500 mcg / ml) sulla zona di test, e coniglio anti-topo IgG (500 mcg / ml) sulla zona di controllo per rilevare mAb sulla membrana NC utilizzando una stampante pipetta o immunostrip. Mantenere la distanza (> 5 mm) tra le due zone per evitare interferenze.
3. Incollare il tampone coniugato, tampone assorbente e la membrana NC sul tavolo di montaggio con nastro biadesivo.
   Nota: Sovrapporre le pastiglie su ciascun lato della membrana NC di circa 2 mm. costruzione striscia inappropriato si tradurrà in una prova incompleta.
4. Posizionare il tampone campione sul tampone coniugato (2 mm) e incollarlo sul tavolo di montaggio.
5. Creare strisce larghe 6 mm con un taglierino. Imballare le strisce nel sacchetto di alluminio con essiccante, e conservarli a 4 ° C fino all'uso.

Prova 8. cross-reattività

1. Omogeneizzare 0,03 g di campione muscolo crudo con 1 ml di PBS (contenente 0,1% BSA) in una provetta da 1,5 ml centrifuga con un bastone di bambù o di rettifica asta.
2. Tenere la striscia dalla parte opposta alle aree test e immergere la parte pad campione nel campione per 5-10 min ed osservare direttamente il risultato.
   1. Opzionale: Raccogliere 500 microlitri surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da centrifuga.
      Nota: questo passaggio è suggerito se il segnale non è evidente quando la striscia viene direttamente impregnato nel supernatante.
3. Testare vari campioni di muscolo in triplice copia.
   Nota: Qui abbiamo testato il tonno, pollo, sigillo, 15 specie di cetacei e 5 specie di mammiferi terrestri.
4. Hanno cinque ispettori indipendenti ripetono 8.3 per cinque volte, vale a dire, utilizzare 575 strisce in totale.

Results

Caratteristiche anticorpo monoclonale

Abbiamo sviluppato due IgG ₁ anticorpi monoclonali (CGF5H9 e CSF1H13) riconoscere due peptidi sintetici (MKASEDLKKHGNTVLC e AIIHVLHSRHPAEFGC), rispettivamente, di cetacei Mb, e questi sono stati utilizzati per la costruzione di un panino di tipo striscia reattiva immunocromatografico oro colloidale per la rapida individuazione di Mb di cetacei. la Figura 2 mostra che CGF5H9 rileva cetacei e altri mammiferi com...

Discussion

Utilizzo di un peptide sintetico coniugato alla proteina carrier è notevolmente più efficace rispetto alla sua proteina cognate. Per una tecnica sandwich base, perché il mAb è sviluppato utilizzando epitopi con posizioni relative note, le due mAbs in questo studio non possono interferire con reciproca interazione con l'epitopo antigene bersaglio. Inoltre, la reattività tra proteina nativa e l'anticorpo di topi immunizzati con il peptide sintetico-coniugato potrebbe essere più forte della reattività tra proteina ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione salina tamponata con fosfato	AMRESCO	J373
Proteina G HP SpinTrap	GE  Healthcare	28-9031-34	colonna rotante contenente proteina G Sepharose
IsoStrip Kit di isotipizzazione di anticorpi monoclonali di topo	Roche	11493027001	Isotyping Strips, prerivestite con anticorpi anti-Ig di topo specifici per sottoclassi e catene leggere
Mini Trans-Blot	Bio-Rad	170-3935
Membrana in nitrocellulosa	Whatman	Z613630
Anticorpo soluzione bloccante	LTK BioLaboratories		Minimizzare le interazioni di legame aspecifiche delle IgG aspecifiche nei campioni
Substrato della fosfatasi BCIP/NBT	KPL	50-81-00
Rivelatore di proteine HRP Microwell Kit, Anti-Topo	KPL	54-62-18
Nunc Immunopiastra MaxiSorp Piastra ELISA	Thermo  Fisher Scientific	EW-01928-08
Multiskan  Lettore ELISA EX	Termo  Elettrone  Corporation	51118170
Soluzione di oro colloidale (40 nm)	REGA biotecnologie SA		40-50 nm è appropriato per immunostrip
Albumina sierica bovina	Gibco	15561-020
Test rapido immno-strip stampante	REGA biotechnology Inc.	AGISMART RP-1000	Adatto solo per la produzione su piccola scala di immunostrips per scopi di ricerca e sviluppo
Componenti a strisce (membrane NC, tamponi per campioni (vetro #33, S& S), pastiglie coniugate (#16S, S& S) e tamponi assorbenti (CF6, Whatman))	REGA biotechnology Inc.
Freund' s adiuvante e incompleto Freund' s adiuvante	Sigma-Aldrich	F5881, F5506	Utilizzato per produrre emulsioni acqua-in-olio di immunogeni
acrilammide, gel tampone, persolfato di ammonio (APS), tetrametiletilendiammina (TEMED)	Protech		Gel preparato per SDS-PAGE
Coomassie blu brillante R-250	Bio-Rad	1610436	Colorazione delle proteine nei gel SDS-PAGE Tampone
campione Laemmli e β-mercaptoetanolo	Bio-Rad	1610737, 1610710	Diluire i campioni proteici prima di caricarli sui gel SDS-PAGE