Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

Summary

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

Abstract

L'ingegneria del tessuto cardiaco umano può avere un impatto fondamentale sulla scoperta terapeutica attraverso lo sviluppo di nuovi sistemi di screening specie-specifici che replicano la biofedeltà del miocardio umano nativo tridimensionale, consentendo anche un livello controllato di complessità biologica e consentendo il monitoraggio longitudinale non distruttivo della funzione contrattile dei tessuti. Inizialmente, i tessuti cardiaci ingegnerizzati umani (hECT) sono stati creati utilizzando l'intera popolazione cellulare ottenuta dalla differenziazione diretta di cellule staminali pluripotenti umane, che in genere producevano meno del 50% di cardiomiociti. Tuttavia, per creare modelli predittivi affidabili del miocardio umano e per chiarire i meccanismi di interazione eterocellulare, è essenziale controllare accuratamente la composizione biologica nei tessuti ingegnerizzati.

Per risolvere questo problema, utilizziamo lo smistamento delle cellule vive per il marcatore di superficie cardiaca SIRPα e il marcatore di fibroblasti CD90 per creare tessuti contenenti un rapporto 3:1 di questi tipi di cellule, rispettivamente, che vengono poi mescolati insieme e aggiunti a una soluzione di matrice a base di collagene. Gli hECT risultanti sono, quindi, completamente definiti sia nella loro composizione di matrice cellulare che extracellulare.

Qui descriviamo la costruzione di hECT definite come un sistema modello per comprendere i meccanismi delle interazioni cellula-cellula nelle terapie cellulari, utilizzando un esempio di cellule staminali mesenchimali (hMSC) derivate dal midollo osseo umano che sono attualmente utilizzate in studi clinici sull'uomo. La composizione tissutale definita è fondamentale per capire come le hMSC possono interagire con i tipi di cellule cardiache endogene per migliorare la funzione tissutale. Viene anche descritto un sistema di bioreattore che coltiva simultaneamente sei hECT in parallelo, consentendo un uso più efficiente delle cellule dopo la selezione.

Introduction

Ingegneria tissutale cardiaca ha avanzato enormemente negli ultimi dieci anni, con più gruppi editoriali risultati completamente funzionale, tessuti battendo realizzati da entrambi i cardiomiociti murini ^1-6 e, più recentemente, umani cellule staminali derivate miociti cardiaci ^7-12. Il campo di ingegneria dei tessuti cardiaco è guidata da due obiettivi primari e sostanzialmente indipendenti: 1) per sviluppare innesti esogeni che possono essere trapiantate in mancanza di cuori per migliorare la funzione ^4-6; e 2) sviluppare modelli in vitro per lo studio fisiologia e malattie, o come strumenti di screening per sviluppo terape....

Protocol

Nota: eseguire tutte le manipolazioni di cellule in condizioni asettiche con una classe II cappa di sicurezza biologica HEPA filtrata e sterilizzare tutte le soluzioni da filtrandoli attraverso un filtro 0,2 micron. Esegui creazione tessuti e collaudo funzione sia stesse condizioni asettiche o una cappa a flusso laminare.

1. Semina di H7 hESC in preparazione differenziazione cardiaca

1. (Giorno 1) Preparazione della matrice di membrana basale
   1. Scongelare 150 ml aliquota di hESC matrice membrana basale qualificata su ghiaccio durante la notte a 4 ° C.
2. (Giorno 0-4) placcatura di hESC su piastre rivestite ....

Results

Per ottenere miociti cardiaci, una versione leggermente modificata dei metodi di differenziazione Boheler e Lian viene utilizzata ^30,31. È indispensabile che la differenziazione inizia durante il log-fase di crescita delle cellule, ma anche che la popolazione di partenza è sufficientemente confluenti di ottenere un numero utilizzabile di celle dopo ordinamento (circa il 75% è ottimale). Tipicamente, per H7 hESCs, placcatura con una densità di 140.000 hESC per pozzetto di un piatto 6 pozzetti in essenziali 8 m.......

Discussion

Costruzione di tessuti umani ingegnerizzati definiti cardiaci (hect) in grado di fornire un modello più coerente e affidabile della funzione dei miociti cardiaci umana. Criticamente, tutti componenti cellulari ed extracellulari nel sistema sono noti e possono essere manipolati come desiderato, eliminando così l'influenza confondenti di altri tipi di cellule sconosciuti risultanti dal processo di differenziazione. Per bilanciare la crescita cellulare rapida e ad alto rendimento, è preferibile che la differenziazione .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Coltura cellulare	Azienda	Numero di catalogo	Comments
Amfotericina B	Sigma-Aldrich	A2411	Preparare un stock da 2,5 mg/ml in DMSO e sterilizzare con filtro
B27 con Insulin	Life Technologies	17505055
B27 senza insulina	Life Technologies	A1895601
CHIR99021	Stemgent	04-0004	Crea 6 μ M stocca, quindi aliquotare e conservare a -20  °C.
Essential 8 Media	Life Technologies	A1517001
H7 Cellule staminali embrionali umane	WiCell	WA07
hESC Matrice qualificata, Corning Matrigel	Corning	354277	scongelare su ghiaccio a 4 ° C pernottamento poi aliquota 150 μ l in provette separate e conservare a -20  °C.
IWR-1	Sigma-Aldrich	I0161	Crea 10 mM di azioni e aliquota. Conservare a -20 ° C
Siero neonatale per vitelli	Life Technologies	16010159
Reagente di dissociazione non enzimatica: Reagente di dissociazione cellulare delicato	Tecnologie per le cellule staminali	7174
Penicillina-Streptomicina	Corning	30-002-CI
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Conservare in frigorifero
Y-27632 (inibitore ROCK)	Stemgent	04-0012	Risospendere a una concentrazione di 10 mM, aliquotare e conservare a -20  °C. Evitare cicli di gelo e disgelo.
Cell Sorting	>Azienda	Numero di catalogo	Comments
4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato (DAPI)	Life Technologies	D1306
CD90-FITC	BioLegend	328107
Reagente di dissociazione enzimatica: Kit di distacco cellulare I (0,04% tripsina/ 0,03% EDTA, soluzione di neutralizzazione della tripsina e soluzione salina tamponata di Hanks)	PromoCell	C-41200
Siero fetale bovino Atlanta	Biologics	S11250
SIRPα-PE/Cy7	BioLegend	323807
Costruzione dei tessuti	Company	Numero di catalogo	Comments
0.25% Tripsina/0.1% EDTA	Fisher Scientific	25-053-CI	Opzionale: Per la raccolta di cellule supplementari di interesse
10x MEM	Sigma-Aldrich	M0275-100ML
10x pacchetti PBS	Sigma-Aldrich	P3813
Collagene, Bovino Tipo I	Life Technologies	A10644-01	Tenere sul ghiaccio
DMEM/F12	Life Technologies	11330057
Dulbecco' s Eagles modificato medio (DMEM), alto glucosio	Sigma-Aldrich	D5648
polidimetilsilossano (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Sodium HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Sodium Hydroxide	Sigma-Aldrich	221465
Materials	Company	Numero catalogo	Comments
1,5 ml provette per microcentrifuga	Fisher Scientific	NC0536757
15 ml provetta per centrifuga in polipropilene	Corning	352096
5 ml in polistirene Tubo a fondo tondo	Corning	352235	Con 35 &mu integrato; Filtro cellulare M
Provetta da centrifuga in polipropilene da 50 ml	Corning	352070
Piastra trattata per colture tissutali a fondo piatto a 6 pozzetti	Corning	353046
Raschietto cellulare, monouso	Biologix	70-2180
Polisulfone	McMaster-Carr
Politetrafluoroetilene (Teflon)	McMaster-Carr
Equipment	Company	Numero di catalogo	Comments
Microscopio da dissezione	Olympus	SZ-61	O simile, deve avere un supporto per la fotocamera ad alta velocità da collegare
di stimolazione elettrica	Astro-Med, Inc	Grass S88X Stimolatore
ad alta velocità Fotocamera	Pixelink	PL-B741U	O simile, ma deve essere in grado di raggiungere i 100 fotogrammi al secondo per un'acquisizione accurata dei dati
Controllo della temperatura			Utilizzato per mantenere la temperatura del supporto durante l'acquisizione dei dati.
Custom Materials	Company	Catalog Number	Comments
LabView Post-tracking Program			disponibile su richiesta agli autori