Articolo metodologico

Imaging strutture subcellulari nell'embrione Living Zebrafish

DOI:

10.3791/53456

⸱

2 aprile 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Neuronal Cell Biology, Technische Universität München, 2Cell Biology, Department of Biology, Faculty of Science, Utrecht University, 3Faculty of Biology, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 4Adolf-Butenandt-Institute, Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität-München, 5German Center for Neurodegenerative Diseases, 6Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University

In questo articolo

Sommario

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L'imaging del comportamento dinamico degli organelli e di altre strutture subcellulari in vivo può far luce sulla loro funzione in condizioni fisiologiche e patologiche. Qui, presentiamo metodi per marcare geneticamente due organelli, centrosomi e mitocondri, e per l'imaging delle loro dinamiche in embrioni di zebrafish viventi utilizzando la microscopia a campo largo e confocale.

Abstract

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L'imaging in vivo fornisce un accesso senza precedenti al comportamento dinamico delle strutture cellulari e subcellulari nel loro contesto naturale. L'esecuzione di tali esperimenti di imaging in vertebrati superiori come i mammiferi richiede generalmente l'accesso chirurgico al sistema in studio. L'accessibilità ottica del pesce zebra embrionale e larvale consente di eludere tali procedure invasive e consente l'imaging nell'organismo intatto. Infatti, il pesce zebra è ora un modello consolidato per visualizzare comportamenti cellulari dinamici utilizzando la microscopia in vivo in una vasta gamma di contesti di sviluppo, dalla proliferazione alla migrazione e differenziazione. Uno sviluppo più recente è l'uso crescente del pesce zebra per studiare eventi subcellulari, tra cui il traffico mitocondriale e la dinamica del centrosoma. La relativa facilità con cui queste strutture subcellulari possono essere marcate geneticamente da proteine fluorescenti e l'uso di tecniche di microscopia ottica per visualizzarle sta trasformando il pesce zebra in un modello in vivo di biologia cellulare. Qui descriviamo i metodi per generare costrutti genetici che etichettano in modo fluorescente gli organelli, evidenziando i mitocondri e i centrosomi come esempi specifici. Utilizziamo il sistema bipartito Gal4-UAS in molteplici configurazioni per limitare l'espressione a specifici tipi di cellule e fornire protocolli per generare pesci transgenici stabili e ad espressione transitoria. Infine, forniamo linee guida per la scelta dei metodi di microscopia ottica più adatti per l'imaging della dinamica subcellulare.

Introduzione

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Imaging in vivo fornisce la visualizzazione diretta dei comportamenti cellulari nel contesto più fisiologico. La trasparenza di embrioni di zebrafish, il loro sviluppo rapido ed esterna e una ricca gamma di strumenti genetici che consentono l'etichettatura fluorescente hanno contribuito al crescente utilizzo della microscopia in vivo per chiarire la dinamica degli eventi chiave dello sviluppo. Studi di imaging di sviluppo del sistema nervoso in zebrafish hanno ad esempio notevolmente ampliato la nostra conoscenza del comportamento delle cellule progenitrici neurali e il destino della loro progenie compreso il loro successiva migrazione, differenziazione e integrazione del circuito 1-8.

Il palcoscenico è ora impostata per indagare le dinamiche subcellulari alla base di tali comportamenti cellulari. Infatti, zebrafish sono già sfruttate come strumenti per in vivo biologia cellulare. Ora è possibile visualizzare i mitocondri 9-11, centrosomi 2,8,12-14, Golgi 15, Il citoscheletro microtubuli 4 e actina 16, endosomi 17 e componenti della membrana apicale complesso 1,18, tra le altre strutture subcellulari in embrioni di zebrafish in vivo. Finora, gran parte di ciò che si conosce la funzione di questi organelli viene da studiare il loro comportamento in cellule in coltura. Mentre gli studi in vitro hanno dato un enorme comprensione della biologia delle cellule, cellule in coltura non rappresentano appieno la complessità della situazione in vivo e quindi non riflettono necessariamente la funzione e le dinamiche di organelli subcellulari in vivo. Embrioni di zebrafish offrono una valida alternativa in vivo per esaminare le dinamiche subcellulari.

Come vertebrati, zebrafish possiede molti organi (ad esempio, retina neurale) che sono omologhi a quelli trovati in specie di mammiferi. Inoltre, gli embrioni di zebrafish sono sempre più utilizzati per modellare malattie umane 19,20 , compresi quelli relativi alla funzione centrosomica (ad esempio, microcefalia 21 e amaurosi 22 congenita di Leber) e per la funzione mitocondriale (ad esempio, il morbo di Parkinson 23, tauopatie 10,24 e sindrome di Barth 25). In vivo l'imaging a livello cellulare e subcellulare in questi casi consenta una migliore comprensione della biologia cellulare alla base di questi stati patologici.

L'obiettivo generale dei metodi descritti qui è quello di fornire una guida completa per indagare organelli e altre strutture subcellulari in embrioni di zebrafish utilizzando in microscopia ottica vivo. L'intero flusso di lavoro coinvolti nella visualizzazione e il monitoraggio delle strutture subcellulari in vivo è descritto - da approcci genetici di etichettatura, a generare transitoriamente esprimere e pesce transgenico stabile, e, infine, per l'imaging con grande campo e microscopia confocale. Mentre ciascuno di questi procedures è utilizzato da numerosi laboratori di zebrafish, i protocolli descritti sono ottimizzati e semplificato per indagare le dinamiche di strutture subcellulari. Due aspetti specifici del lavoro descritto qui meritano menzione: In primo luogo, l'uso del sistema di espressione GAL4-UAS in più configurazioni per geneticamente organelli etichette in specifici tipi di cellule. In secondo luogo, un confronto diretto di tutto il campo e microscopia confocale a strutture subcellulari di immagini in vivo.

Le attuali strategie geneticamente organelli etichette e altre strutture subcellulari in zebrafish o fare uso di capped mRNA 1,4,8 o costrutti di DNA a base dove elementi promotori di auto direttamente l'espressione di proteine ​​di fusione 9,14,15. Trascritto in vitro ricoperto risultati di RNA a rapida e ampia espressione, che non è tessuto-specifica però. Inoltre, i livelli di espressione diminuiscono nel tempo come RNA capped viene diluito o degradato. Pertanto, l'uso di RNA basatocostruisce per esaminare le dinamiche organelli in fasi successive di sviluppo è limitata (in genere fino a 3 giorni dopo la fecondazione).

Queste limitazioni possono essere superate usando costrutti di DNA, dove il controllo spaziale e temporale di espressione è determinato da elementi promotori specifici. Quando costrutti di DNA a base sono utilizzati nel contesto del sistema GAL4-UAS significativi miglioramenti a livello di espressione del transgene si osservano 26,27. In questo sistema di espressione bilaterale, di tipo a cella specifici elementi promotori guidano l'espressione di un attivatore trascrizionale GAL4, mentre geni reporter vengono clonati a valle della sequenza attivante a monte GAL4-binding (UAS). Combinando UAS giornalisti con opportuni driver GAL4, espressione può essere limitata a specifici tipi di cellule, eludendo la necessità di clonare geni reporter dietro vari promotori ogni volta che un pattern di espressione specifici si desidera. Inoltre, l'espressione di geni multipli UAS giornalista può essereguidato da un unico attivatore GAL4. Il sistema GAL4-UAS fornisce quindi un approccio genetico versatile e flessibile per l'etichettatura subcellulare.

Wide-field e microscopi confocale sono i cavalli di lavoro della maggior parte dei laboratori. sistemi a grande campo tipicamente utilizzano una lampada ad arco come sorgente luminosa e rilevare la luce emessa con una camera sensibile che è posto al termine del percorso della luce. Questa modalità di imaging è in genere limitata a campioni sottili come fuori-di luce fuoco oscura informazioni di messa a fuoco in campioni più spessi. Microscopi confocali differiscono dai sistemi largo campo dal fatto che essi sono costruiti per favorire segnali provenienti dal piano focale rispetto a quelli che hanno origine fuori fuoco (cioè, "sezionamento ottico") 28. Per ottenere sezionamento ottico un foro è inserito nel percorso di emissione in grado coniugato alla sorgente di luce puntiforme. I laser sono utilizzati come sorgenti di luce ed i segnali vengono rilevati con tubi fotomoltiplicatori (PMT). In pratica, un laserfascio viene strisciato sul campione punto per punto e l'emissione di fluorescenza ad ogni punto (pixel) viene rilevata dal PMT.

Qui immagine le stesse strutture subcellulari in embrioni di zebrafish vivere utilizzando sia a livello di campo e di microscopia confocale per fornire un confronto diretto di entrambe le modalità di microscopia. L'obiettivo di fondo di fornire tali confronti è quello di offrire le linee guida per la scelta della tecnica di microscopia più appropriata per la questione specifica a portata di mano.

Utilizzando gli approcci descritti qui dimostriamo GAL4-UAS basato etichettatura genetica dei mitocondri e dei centrosomi. Questi organelli vengono esposte in diversi tipi di cellule del sistema nervoso e in cellule muscolari con largo campo e microscopia confocale a dimostrare l'idoneità di ogni modalità di imaging. I metodi descritti qui possono essere facilmente adattate per indagare altri organelli e strutture subcellulari nell'embrione zebrafish vivente.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla normativa vigente del governo della Baviera (Monaco di Baviera, Germania).

1. Etichettatura organelli e altre strutture subcellulari

NOTA: Qui giornalista genetica costrutti che centrosomi tag fluorescenza, i mitocondri e le membrane cellulari sono descritti.

  1. Utilizzare metodi di clonazione convenzionali 29 per generare proteine ​​di fusione che etichetta fluorescente centrosomi e mitocondri. Clonare la sequenza codificante di centrin4 zebrafish (cetn4) in-frame con una proteina fluorescente 2 (FP) come proteina fluorescente gialla per generare cetn4-YFP. Clonare la sequenza di targeting mitocondriale di subunità VIII della citocromo c ossidasi in-frame con un FP come proteina fluorescente Ciano per generare mitoCFP 9-11.
  2. Per limitare l'espressione delle proteine ​​di fusione (cetn4-YFP o mitoCFP) alle cellule specifiche del zebrafISH embrione (ad esempio i neuroni o cellule muscolari) utilizzare il sistema di espressione bipartito GAL4-UAS 26,27. In primo luogo generare un giornalista costrutto UAS. Utilizzare i metodi convenzionali per clonare la proteina di fusione in un vettore di espressione UAS, a valle della cassetta UAS GAL4-binding (varianti vanno da 1x a 14x UAS, vedi Discussione) 26,27,30 e un promotore minimo (E1b promotore basale da carpa βactin gene), e generare UAS: cetn4-YFP e UAS: mitoCFP.
    NOTA: Per preparare UAS giornalista costrutti per stabile generazione linea transgenica elementi aggiuntivi devono essere clonato (vedere 3 di seguito)
  3. Per visualizzare il contesto cellulare in cui centrosomi o mitocondri sono etichettati, generare UAS giornalista costrutti in cui le membrane cellulari sono etichettati dai PQ. Clone primi venti amminoacidi di zebrafish GAP43 (contenenti siti palmitoylation) in-frame con FP target che FP alla membrana cellulare (memFP) 31,32.
  4. otten costrutti driver o linee transgeniche in quale cella di tipo specifici elementi promotori guidare l'espressione dell'attivatore trascrizionale GAL4-VP16 27, 33 o Gal4FF KalTA4 30.
  5. Unire il giornalista UAS costruisce con un costrutto driver appropriato per limitare l'espressione alla cellula-tipo desiderato di interesse (ad esempio, nei neuroni o cellule muscolari). Per fare questo co-iniettare conducente GAL4 UAS e giornalista costruisce allo stadio unicellulare di uova fecondate (per le istruzioni dettagliate vedere 2 sotto) per generare transitoriamente esprimere pesce. In alternativa, generare una stabile linea transgenica UAS giornalista (per le istruzioni dettagliate vedere 3 di seguito) e attraversare a una linea transgenica stabile conducente GAL4 di generare prole tenendo entrambi i transgeni.
    NOTA: E 'anche possibile iniettare UAS giornalista costruirà / s in uova fecondate da una stabile linea transgenica conducente GAL4 o un driver di GAL4 costruire in fertilizUova Ed da una linea transgenica stabile UAS giornalista.
  6. Per co-esprimere più proteine ​​di fusione distinta utilizzando il sistema GAL4-UAS, utilizzare un driver GAL4 UAS e reporter / s in una delle seguenti configurazioni: A. multipla, costrutti UAS giornalista separate (ad esempio, UAS: mitoCFP e UAS: memYFP co -injected con un driver costrutto GAL4) 10, B. più cassette UAS su un singolo giornalista (per esempio, UAS: cetn4-YFP, UAS: memCerulean) 12 C. Bidirezionale giornalista UAS (ad esempio UAS: memYFP, mitoCFP) 2,10,24 (Figura 1).

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Figura 1. Le strategie di co-espresse proteine ​​di fusione che utilizzano il sistema GAL4-UAS.
Co-espressione di più proteine ​​di fusione può essere ottenuto utilizzando UAS cassette giornalista in diverse configurazioni: (A) multipla, const UAS-driven separataructs, (B) più cassette UAS su un unico costrutto o (C) un UAS cassetta bidirezionale su un unico costrutto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Generare Transientemente Esprimendo Pesce

NOTA: Il seguente è un adattamento dei protocolli precedentemente pubblicati 34,35. Una configurazione di iniezione base dovrebbe includere uno stereomicroscopio con una gamma di ingrandimento fino a 12x, un micromanipolatore con un supporto micropipetta e una fonte di pressione d'aria. Preparare 2,1-2,5 prima del tempo:

  1. Per preparare uova camere microiniezione, preparare una soluzione di 1,5% (w / v) di agarosio in acqua. Aggiungere la polvere di agarosio all'acqua e forno a microonde fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Riempire una capsula di Petri (100 x 15 mm) con questa soluzione.
    1. Lasciare che la soluzione di agarosio raffreddare a approximately 45 o C prima di effettuare una plastica stampo microiniezione (40 mm x 66 mm, con 6x 50 millimetri lunghe creste che sono 1,5 mm di larghezza, 1 mm di profondità e distanziate 3 mm tra i) sulla superficie del agarosio fuso, facendo attenzione a non introdurre bolle all'interfaccia.
    2. Dopo i set di agarosio, conservare a 4 o CO / N. Rimuovere con attenzione lo stampo con una spatola. Preparare camere multiple microiniezione alla volta, conservare a 4 ° C e usare ripetutamente per diverse settimane.
  2. Utilizzare un estrattore micropipetta per generare capillari di iniezione di vetro con un lungo gambo 36.
    NOTA: Le impostazioni specifiche utilizzate per generare capillari di iniezione deve essere determinato empiricamente. capillari di iniezione può essere tirato in anticipo e memorizzati prima dell'uso.
  3. Misurare la concentrazione di DNA plasmide (conducente GAL4 e costrutti reporter UAS) per microiniezione utilizzando uno spettrofotometro in base al manuale del costruttore. Misurare60; il rapporto di assorbanza a 260 nm e 280 nm (A260 / 280). Diluire il DNA ad una concentrazione finale di 100 ng / ml in acqua priva di nucleasi.
    NOTA: A / rapporto A260 280 del ~ 1.8 significa DNA puro. Considerare l'utilizzo di un kit commerciale (basato su matrice legante a base di silice) per purificare il DNA plasmidico da utilizzare per l'iniezione. Plasmid DNA deve essere di alta qualità per prevenire la tossicità.
  4. Preparare 10 ml di iniezione-mix mediante la combinazione di DNA (da 0,5 a 2,5 ml di una / magazzino ml 100 ng per una concentrazione finale di 5 a 20 ng / ml), la soluzione di Danieau (0,33 ml di 30x magazzino), rosso fenolo (0,25 ml, acqua opzionale) e priva di nucleasi per un volume totale 10 ml.
    NOTA: empiricamente determinare la concentrazione di DNA che produce espressione adatto. conducente GAL4 e plasmidi reporter UAS devono essere co-iniettato. Nessuna espressione risulterà quando solo il conducente GAL4 UAS o giornalista plasmide viene iniettato nella wild-type uova fecondate. Se invece tha fecondato le uova sono da una linea conducente GAL4 poi l'iniezione di uno o più plasmidi UAS giornalista sufficiente rilevare. Viceversa, se microinjecting in una linea giornalista UAS, solo il driver plasmide GAL4 deve essere iniettato. Infine, mentre rosso fenolo può aiutare molto a visualizzare iniezioni, è anche un composto fluorescente stessa. Pertanto, fenolo rosso potrebbe oscurare PQ visualizzando se l'imaging è previsto prima di 24 ore dopo la fecondazione (HPF), in quanto non può essere sufficientemente diluito da questo momento.
  5. La sera prima iniezioni sono in programma, istituito diverse paia (in genere da 5 a 10), di sesso maschile e femminile zebrafish per la riproduzione. Utilizzare vasche di allevamento con un inserto contenente un fondo a griglia ed un partitore rimovibile per separare il maschio e pesce femmina.
    NOTA: maschio e femmina zebrafish possono generalmente essere distinguono per la loro forma del corpo. I maschi tendono ad essere magro mentre le femmine tendono a mostrare un addome ventrale sporgente. I maschi inoltre tendono ad avere una col giallo-rossooring sulla loro zona addominale ventrale.
  6. Immediatamente prima iniezioni DNA, rimuovere i divisori per consentire il maschio e femmina per accoppiarsi. Circa 15 a 30 minuti dopo aver rimosso il divisore, controllare le uova sul fondo del serbatoio. Trasferire il pesce adulto utilizzando una rete da pesca di un nuovo serbatoio di allevamento.
  7. Versare l'acqua, contenente le uova fecondate appena stabilite, fuori dalla vasca di riproduzione in un setaccio (ad esempio, una plastica tè colino). Lavare le uova nel setaccio utilizzando uno spray contenente la soluzione di Danieau. Invertire il setaccio su una capsula di Petri e utilizzare un flacone spray con una soluzione di Danieau di recuperare tutte le uova (in genere da 50 a 200 uova per allevamento coppia di pesci adulti).
  8. Usando una pipetta microloader, back-riempire una capillare iniezione tirato con il DNA di iniezione-mix. Montare la capillare iniezione nel supporto di un micromanipolatore e tagliare la punta, sotto il controllo visivo di uno stereomicroscopio, con pinze per creare una micropipetta che può penetrate il corion e citoplasma cellulare pur essendo in grado di fornire un adeguato volume di DNA.
    NOTA: Il grado in cui viene tagliata la punta del capillare di iniezione deve essere determinato empiricamente e può essere meglio giudicato quando si inietta le uova.
  9. Per determinare il volume di DNA iniettabile, scaricare una goccia della soluzione iniettabile in olio minerale. Misurare il raggio (r) della goccia con un micrometro calibrazione e calcolare il volume (4/3 π R 3). Modulare il volume regolando la pressione di iniezione e / o la durata di ciascun impulso di iniezione.
  10. Usando una pipetta di plastica, trasferire tutti gli uova raccolte (tipicamente 50-200, dal 2,7 al di sopra) nelle trincee di una camera di microiniezione. Sotto il controllo visivo di uno stereomicroscopio, usare il forcipe per orientare le uova in modo che il citoplasma della cellula (trasparente) e tuorlo (denso, non trasparente) possono essere facilmente identificati.
  11. Sotto il controllo visivo di un impianto stereomicroscopio, iniettare DNA nel citoplasma delle cellule dell'uovo fecondato, avendo cura di assicurare che il volume iniettato (da 1 a 2 nl) corrisponde a circa il 10% del volume della cella.
    NOTA: rosso fenolo nei aiuti soluzione DNA nella visualizzazione del volume iniettato.
  12. Dopo l'iniezione, allentare le uova da trincee dello stampo ad iniezione da vampate di calore con un flacone spray contenente la soluzione di Danieau. Successivamente trasferire le uova in una capsula di Petri fresco con una pipetta di trasferimento di plastica e mantenere in un incubatore a 28.5 o.
  13. Mantenere le uova non-iniettato come controlli per determinare se le iniezioni contribuiscono ad alti tassi di mortalità, sia a causa di danni fisici subiti durante la penetrazione micropipetta o il mix di DNA.
    NOTA: Gli alti tassi di mortalità dopo iniezioni potrebbe essere a causa di numerosi fattori, tra cui i volumi di concentramento o di iniezione eccessivamente alto DNA e / o plasmidi con contaminazionenti. Per prevenire la tossicità da preparazioni di DNA di bassa qualità, kit commerciale (basato su matrice legante a base di silice) possono essere utilizzati.
  14. A intervalli regolari seguenti iniezioni, usare uno stereomicroscopio per lo screening per le uova non fecondate ed embrioni morti o malformati e scartare questi.
    NOTA: ritengono le uova che sembrano essere in fase di una cella parecchie ore dopo la fecondazione, come non fecondato. Identificare embrioni malformati di difetti anatomici lordi come un compromesso assi antero-posteriore del corpo. materiale amorfo all'interno di un chorion suggerisce che l'embrione non ha proceduto attraverso fasi di sviluppo ed è morto. Per accertare se gli embrioni che sono stati microiniezione subiscono un normale corso di sviluppo consultare atlanti anatomici 37.
  15. Trasferire gli embrioni utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica per la soluzione di Danieau contenente 1x 1-fenil 2-tiourea (1xPTU) tra 10 e 24 HPF per prevenire la formazione del pigmento. Mantenere gli embrioni in soluzione continua di Danieauaining PTU per la durata dell'esperimento.
    NOTA: Oltre a melanofore, iridofore sulla superficie della pelle può essere problematico per l'imaging. Mentre PTU non inibisce iridophore formazione, esistono linee mutanti con un numero ridotto di iridofore come Roy Orbison (roy) e possono essere utilizzati 38.
  16. Dopo botola embrioni (di solito il secondo o terzo giorno dopo la fecondazione, 2 o 3 DPF), eliminare le chorions e scambiare la soluzione del Danieau contenente PTU.
    NOTA: Questi passaggi sono importanti per garantire la qualità del mezzo embrione e la vitalità degli embrioni sani.

3. Generare stabili linee transgeniche

NOTA: Stabile linee transgeniche possono essere generati in modo efficiente utilizzando il sistema di trasposoni Tol2. Un Tol2 trasposoni vettore contenente il transgene di interesse è co-iniettata con mRNA che codifica per l'enzima trasposasi in fertilizzared uova in fase di una cella. Proteine ​​trasposasi derivato dal mRNA iniettato catalizza la escissione della cassetta transgene dal vettore trasposone e la sua integrazione nel genoma 39.

  1. Clonare il reporter cassetta transgene (ad esempio, UAS: mitoCFP) tra Tol2 invertito ripetizioni terminali in uno dei vettori Tol2 attualmente in uso nella comunità zebrafish come descritto 40.
    NOTA: vettori Tol2 contenenti una cassetta selezionabile in cui elementi promotori guidano espressione FP in organi estranei alla zona di interesse (ad esempio, il cuore 41 o lente 42) sono utili per lo screening linee transgeniche UAS giornalista in assenza di GAL4 transattivazione.
  2. Utilizzando un kit commerciale (basato su matrice legante a base di silice), purificare il DNA plasmidico da utilizzare per l'iniezione. Assicurarsi che il DNA plasmide è di alta qualità per prevenire la tossicità.
  3. Trascrivere Tol2 mRNA trasposasi-codifica usando unappropriata vettore di trascrizione come PC-TP 43. In breve, linearizzare PCS-TP e utilizzare un kit commerciale per generare capped mRNA e seguire il protocollo del produttore. Fare attenzione ad evitare la contaminazione con RNasi (ad esempio, utilizzare RNase-free puntali e tubi). Aliquotare l'RNA, ad una concentrazione di 100 ng / ml, monouso e conservare a -80 ° C.
  4. La mattina delle iniezioni, scongelare un'aliquota di trasposasi mRNA sul ghiaccio. Mescolare il vettore trasposone DNA (2 ml di 100 ng / ml) e trasposasi mRNA (2 ml di 100 ng / ml) in un rapporto 1: 1, e aggiungere 6 ml di acqua RNase-free per portare il volume totale a 10μl.
    NOTA: Una concentrazione di 20 ng / ml è raccomandato per ciascuno ma la concentrazione ottimale dovrebbe essere determinata empiricamente. Utilizzare acqua RNasi-free per la diluizione. Utilizzare guanti durante la manipolazione del mix di iniezione di DNA-RNA e tenerlo in ghiaccio per tutto il periodo di iniezioni per prevenire il degrado del mRNA.
  5. Utilizzando le istruzioni dettagliate al precedente punto 2, iniettare il mix di iniezione di DNA-RNA in uova fecondate allo stadio unicellulare. Sotto il controllo visivo di uno stereomicroscopio bersaglio il citoplasma della cellula allo stadio unicellulare per i più alti tassi di efficienza transgenesi. Mantenere gli embrioni iniettati a 28,5 ° C fino al momento di screening di espressione del transgene.
    NOTA: PCR può essere fatto per verificare l'efficienza del trasposasi Tol2 come descritto in precedenza 44.
  6. embrioni schermo in una capsula di Petri per transgenesi usando gli oculari di un microscopio a fluorescenza dissezione.
    NOTA: Utilizzare i set di filtri appropriati del microscopio di visualizzare FP espressione della cassetta selezionabile (vale a dire, la fluorescenza nel cuore o l'obiettivo) a 2 o 3 dpf. Identificare i potenziali embrioni transgenici con espressione (nel cuore o l'obiettivo) e sollevare questi embrioni fino all'età adulta (F 0 generazione) utilizzando le normaliprotocolli 45. In alternativa, identificare potenziali embrioni transgenici mediante PCR come descritto in 46.
  7. Una volta che il giornalista F UAS 0 pesci sono 2,5 - 3 mesi di età, li (vedi 2.5 per i dettagli) attraversare wild-type pesci non transgenici per acquisire le uova per stabilire una generazione F 1. In alternativa, attraversare il UAS giornalista F 0 pesce ad una linea conducente GAL4 di stabilire una generazione F 1. In quest'ultimo caso, il transgene UAS-driven può essere monitorato direttamente negli embrioni ottenuti dalla croce.
  8. Utilizzare una a fluorescenza dissezione microscopio per lo screening F 1 embrioni per l'espressione del transgene o cassetta selezionabile.
    NOTA: quando l'espressione viene confermato poi il transgene si può dire di essere trasmessa linea germinale. Transgenesi è non-mendeliana nella fase F 0. Il numero di embrioni che esprimono il transgene può variare da un piccolo numero alla stragrande maggioranza in clutche individualeS. Integrazione trasposoni in diversi F 0 pesce può variare notevolmente, con conseguente diversi pattern di espressione. Quindi mantenere la F 1 pesci provenienti da diverse F 0 fondatori come sub-linee separate. Integrazioni trasposoni in F 1 pesci sono stabili e sono passati alle generazioni successive in modo mendeliana.
  9. Mantenere ogni F 0 pesci in serbatoi separati di ri-identificare i portatori transgene.

4. Preparare embrioni per l'imaging su un microscopio verticale

NOTA: Le procedure descritte qui sono stati ottimizzati per l'imaging su microscopi in posizione verticale con lungo lavoro obiettivi a distanza acqua-immersione-cono.

  1. Utilizzare una a fluorescenza dissezione microscopio per lo screening degli embrioni per l'espressione del transgene.
    NOTA: Espressione di un reporter transgene UAS dipenderà dalla specifica linea conducente GAL4 utilizzata. Selezionare gli embrioni per esperimenti di imaging basate su exp desideratomodello ression.
  2. Trasferire gli embrioni selezionati con una pipetta di plastica per una capsula di Petri separata contenente tampone di Danieau con 1x PTU e 1x Tricaine.
    NOTA: quando l'etichettatura è scarsa (solo poche cellule in un sistema di organo) montare gli embrioni in agarosio (vedi 4,3-4,7 sotto) e schermo per l'espressione del transgene utilizzando un microscopio a livello di campo con obiettivi ad alto ingrandimento (vedi 5.1 sotto). Tricaine anestetizza il pesce e dovrebbe essere efficace in pochi secondi. Se il pesce non sono immobilizzati è probabile che il Tricaine ha degradato. Possibili cause di questo degrado sono la cattiva conservazione dei Tricaine, che è sensibile alla luce 47.
  3. Preparare la agarosio per incorporare il pesce sciogliendo bassofondente polvere agarosio in tampone di Danieau ad una concentrazione finale dello 0,7%. Aliquota (1 ml) e tenere in un calore blocco a 40 ° C fino al momento dell'uso.
    NOTA: Higher concentrationi di agarosio (fino a 1,5%) può anche essere utilizzato per incorporare i pesci.
  4. Aggiungere 50 ml di un 20x magazzino di Tricaine e 20 ml di una soluzione 50x magazzino di PTU al 1 ml aliquota di basso punto di fusione agarosio e mescolare bene toccando il lato del tubo. Ritorna il tubo al calore-blocco. Usando una pipetta di trasferimento di plastica, Pipetta delicatamente un paio di (1-10) embrioni anestetizzati in agarosio, trasferendo il meno liquido possibile per evitare di diluire l'agarosio.
  5. Usando una pipetta di trasferimento di plastica tutti gli embrioni con una piccola quantità di agarosio ad un fondo di vetro piatto di petri.
  6. Lavorando relativamente veloce, utilizzare pinze per posizionare gli embrioni nell'orientamento desiderato, a seconda della struttura da acquisire.
    NOTA: gli embrioni Orient dalla loro parte se la retina o ROHON-Barba (RB) neuroni sensoriali dovrebbero essere ripreso.
  7. Lasciare che il agarosio solidificare per almeno 15 minuti. Aggiungere tampone di Danieau contenente 1xPTU e 1xTricaine per coprire gli embrioni incorporati in AgaroSE. Porre la capsula contenente gli embrioni di agarosio-embedded in un incubatore a 28,5 ° C fino al momento di immagine.

5. imaging cellulare e subcellulare strutture usando Wide-field o Microscopia confocale

NOTA: Wide-field microscopia e punto-a scansione microscopia confocale sono le modalità più utilizzate per l'immagine embrioni di zebrafish fluorescente La tabella 1 riassume i principali vantaggi e svantaggi di entrambi i sistemi.. Per entrambe le forme di microscopia, embrioni sono montati in agarosio come descritto nel precedente punto 4, e mantenuta a 28,5 ° C per tutto l'esperimento di imaging utilizzando una camera di riscaldamento sul palco del microscopio. È importante sottolineare che il piatto con embrioni di agarosio-embedded è lasciato equilibrare al 28,5 ° C prima di imaging inizia come variazioni di temperatura provocano la deriva nella Z-dimensione. Nel condurre esperimenti di imaging a lungo termine (oltre Several ore), posizionare un coperchio in plexiglas sulla piastra di Petri per ridurre l'evaporazione del buffer.

Ampio campo Point-confocale a scansione
Costo Relativamente poco caro Costoso (circa. 5x più)
Photo-candeggio Basso Alto. Il campione è esposto alla luce laser sopra e sotto il piano focale.
Photo-tossicità Basso Alta (vedi foto-sbiancamento sopra)
velocità di acquisizione Veloce Lento
Risoluzione in xy La legge di Abbe legge di Abbe (può essere migliorata app 40% utilizzando un piccolo foro di spillo,. tuttavia,la maggior parte delle impostazioni di questo ha poco applicazione pratica)
sezionamento ottico Povero Sì (può essere regolata in base alle dimensioni pinhole)
penetrazione nel tessuto Limitato a strutture superficiali (ad esempio, ROHON-Barba cellule o fibre muscolari) Limitatamente alle <100 mm dalla superficie dell'embrione

Tabella 1. confronto generale di tutto il settore e il punto di scansione microscopia confocale

  1. Microscopia Wide-field
    NOTA: Qui linee guida sono previste per l'imaging embrioni di zebrafish utilizzando un montante del microscopio a livello di campo con lunga lavorazione obiettivi a distanza acqua-immersione-cono. Il microscopio è dotato di una camera CCD raffreddata, e set di filtri per la visualizzazione differenti fluorofori montato su una ruota filtro automatico per una rapida acquisizione di più canali.Acquisizione delle immagini è controllata da μManager, un pacchetto software open microscopia fonte 48. Un esempio specifico per l'imaging mitocondri nei neuroni sensoriali RB è fornito. Cellule RB sono geneticamente etichettati utilizzando membrana mirati YFP ed i loro mitocondri sono CFP-targhetta (vedi punto 1.1).
    1. Embrioni Mount dalla loro parte in basso punto di fusione agarosio come descritto in 4 di cui sopra.
    2. Lasciare che il piatto con il pesce montato equilibrare a 28,5 ° C in una camera di riscaldamento sul palco del microscopio prima di iniziare l'imaging.
    3. Utilizzare un obiettivo di acqua-immersione-cono basso ingrandimento e guardare attraverso gli oculari del microscopio a scegliere una zona sulla superficie dell'embrione all'immagine.
      NOTA: Se la linea transgenica MitoFish giornalista stabile, Tg (UAS-E1b: PFP, mitoCFP) mde6, viene utilizzato in combinazione con una linea pilota come HuC: GAL4 poi i neuroni più RB sono etichettati, e appaiono come una fitta mesh-lavoro di gazebo neuriti sulla superficie dell'embrione. Se la microiniezione di DNA costrutti viene utilizzato per ottenere l'etichettatura sparse (ad esempio, sensoriale: GAL4-VP16 con UAS: mitoCFP e UAS: MA-YFP), embrioni schermo per identificare le cellule doppio marcato.
    4. Aprire il software microscopio (μManager 1.4) e cliccare su "Illuminazione '' in" Impostazioni di configurazione "per definire il set di filtri corretti per la lunghezza d'onda di interesse (YFP o CFP per l'esempio corrente). In" Impostazioni della fotocamera "inserire il tempo di esposizione richiesto per acquisire un'immagine adatta.
      NOTA: Le "Impostazioni Illuminazione" è pre-impostato dall'utente al momento dell'installazione del software e viene caricato durante l'apertura μManager. Se il software non è configurato per controllare la ruota del filtro, spostare manualmente la ruota del filtro nella torretta nella posizione appropriata.
    5. Passare a un obiettivo di acqua-immersione-cono distanza lungo lavoro che vanno da 40-100x ingrandimento. sceglierel'obiettivo che ha la più alta apertura numerica (NA) e viene cromaticamente corretto (apochromat).
    6. Clicca su "live" scegliere il campo visivo: Nel caso del neurone RB, immagine Trasporto mitocondriale al assone stelo, emana dal corpo cellulare, o nel mozzo periferico.
      NOTA: I mandrini periferici dei neuroni RB in piega pinna caudale dell'embrione forniscono un'opportunità ideale per un'immagine di grande campo di vista che è piatta e può dunque essere catturato su un singolo fotogramma con un microscopio a grande campo. È quindi importante montare l'embrione come categoricamente possibile su un lato, in modo che la piega caudale è parallela al fondo della capsula di Petri.
    7. Dopo aver scelto un campo di vista, fare clic sul pulsante "selezione rettangolare" nel menu ImageJ, definire una regione di interesse (ROI) e cliccare su "ROI" nella finestra μManager. Dopo aver selezionato il ROI per l'imaging, fai clic su "Stop" e "Salva" per take un'immagine del canale YFP per registrare la morfologia locale del neurite / s.
    8. Per un'immagine di trasporto mitocondriale cliccare su "Multi-D Acq." pulsante. Osservare una finestra aggiuntiva ( "Multi-dimensional Acquisizione") e selezionare il numero di punti temporali e l'intervallo tra punti temporali in questa finestra. Utilizzare frame rate di 0,3-1 Hz. Effettuare le registrazioni per almeno 10 minuti per raccogliere il maggior numero punti di dati possibile.
    9. Nella finestra "multi-dimensionale di acquisizione", cliccare su "Canali", aggiungere e definire la lunghezza d'onda per l'imaging (PCP per mitocondri in questo esempio) e il tempo di esposizione. Mantenere tempi di esposizione al di sotto di 400 msec per l'imaging del trasporto mitocondriale.
    10. Fare clic sull'opzione "Save Images" nella finestra "multi-dimensionale di acquisizione", per salvare automaticamente i file in una cartella specifica indicato nella 'root directory'. Clicca su "Acquisisci" nell'angolo in alto a destra per iniziare timl'imaging e-lapse.
    11. regolare manualmente la messa a fuoco durante la registrazione time-lapse per compensare qualsiasi deriva nella dimensione z.
      NOTA: L'utilizzo di questi parametri trasporto mitocondriale nei neuroni RB possono essere esposte per tutto il tempo di 4 ore.
  2. microscopia confocale
    NOTA: Qui vengono fornite linee guida per l'imaging con un montante Olympus FV1000 microscopio confocale e gli obiettivi di acqua-immersione-cono a distanza lungo lavoro. Il microscopio è dotato di più linee laser e più rivelatori (PMT convenzionali e rilevatori di arseniuro di gallio fosfuro più sensibili) che permettono per l'imaging multicanale. si fa riferimento specifico al software Olympus Fluoview. Tuttavia, i parametri di imaging qui descritte dovrebbero essere facilmente trasferibile ad altri sistemi confocale.
    1. Montare embrioni in bassofondente agarosio in un orientamento appropriato per l'organo / struttura da essere ripreso, come descritto sopra 4.
    2. Lasciare che il piatto con il pesce montato equilibrare a 28,5 ° C in una camera di riscaldamento sul palco del microscopio prima di iniziare l'imaging.
    3. Utilizzare distanza lungo lavoro obiettivi acqua-immersione-cono per microscopi confocale in una configurazione verticale. Scegliere obiettivi con il più alto possibile NA per massimizzare la quantità di segnali fluorescenti che possono essere raccolti e il potere migliore risoluzione. Quando si raccolgono le immagini provenienti da più canali di scegliere obiettivi cromaticamente corrette (Apocromatici).
    4. Aprire il software del microscopio e clicca su "Trans lampada" o "Epi lampada" per utilizzare la luce trasmessa o fluorescenza, rispettivamente, per identificare la regione di interesse attraverso gli oculari del microscopio.
    5. Utilizzare il software per impostare i seguenti parametri di scansione per acquisire pile di immagini:
      1. Nella finestra "Acquisition Setting" verificare che l'obiettivo prescelto per l'imaging corrisponde l'obiettivo che appare sul drop-Dowmenù n degli obiettivi disponibili.
        NOTA: Questo è quello di garantire che tutti i parametri pre-calcolato per un particolare obiettivo (e la risoluzione assiale ad esempio, laterali, dimensione del confocale dell'apertura etc.) valgono e possono essere utilizzati in modo affidabile.
      2. Selezionare i filtri appropriati linea laser / s, e di eccitazione e dicroiche emissione di immagine proteina fluorescente specifico (s). A tale scopo, fare clic sul pulsante "lista Dye" nella finestra "Image Acquisition Control" e scegliere l'appropriata fluoroforo / s. In alternativa, cliccare sul pulsante "percorso chiaro e coloranti" per impostare manualmente questi parametri.
        NOTA: Quando l'opzione tasto "Dye List" viene scelto, il software seleziona automaticamente i filtri dicroici linee laser, eccitazione e di emissione appropriati e regola la dimensione dell'apertura confocale appropriato.
      3. Nella finestra "Acquisizione Setting", regolare il fattore di "zoom" e "Formato aspect rapporto "(vale a dire, 512x512, 1024x1024 etc.) dell'immagine acquisita per ottenere la dimensione dei pixel necessaria per risolvere al meglio le strutture viene esposta. Impostare la dimensione dei pixel di essere circa la metà della risoluzione teorica dell'obiettivo, quindi secondo criteri di campionamento di Nyquist . per determinare la dimensione in pixel dell'immagine acquisita Fare clic sul pulsante con il simbolo di informazioni ( "i") nella finestra "acquisizione di immagini di controllo".
      4. Impostare la velocità di scansione per il più veloce possibile (2 ms / pixel) nella finestra "Acquisizione Setting".
      5. Nel "Acquisizione di immagini di controllo" finestra clicca su Kalman linea media per ridurre il fattore noise.A di 2 a 3 di solito sufficiente.
      6. Selezionare una modalità di scansione sequenziale in cui l'imaging fluorofori con sovrapposizione spettri. Per fare ciò, clicca su "sequenziale" e "Line" nella finestra "Acquisizione di immagini di controllo".
      7. Regolare la potenza delle pertinenti linea laser / s (tipicamentesotto del 5%). I valori specifici devono essere determinati empiricamente.
      8. Fare clic sul pulsante "XY Ripeti" o la "Focus x2" o "Focus x4" per eseguire la scansione continuamente la regione selezionata durante la regolazione delle impostazioni del rivelatore per ogni canale. Regolare "HV", "Gain" e "Offset" per ogni canale di acquisire immagini che hanno la più alta gamma dinamica di valori di grigio.
        NOTA: I valori specifici per queste impostazioni devono essere determinati empiricamente. "HV" regola la tensione sul rivelatore di cambiare la sua sensibilità, "offset" regola il segnale di uscita del rivelatore e "Gain 'moltiplica il segnale di uscita del rivelatore per un fattore costante.
      9. Premere Ctrl + H per visualizzare le immagini acquisite tramite una tabella di look-up (Hilo) che identifica in-saturi (appaiono blu) e oltre saturi pixel (appare rosso), entrambi i quali deve essere generalmente evitato. Rivalutare la potenza del laser rilevante line / s e le impostazioni del rivelatore.
        NOTA: L'utilizzo ad alta potenza del laser e un alto livello di "HV" del rivelatore porterà a più segnali. Maggiore potenza del laser sarà comunque portare ad un aumento candeggio e foto-tossicità. L'aumento del "HV" porterà ad un aumento del rumore. Pertanto, un compromesso deve essere trovato quando si imposta la potenza del laser e "HV" per acquisire le immagini con livelli accettabili di rumore evitando foto-danni (vedi anche tabella 1).
      10. Raccogliere immagini da un volume definito concentrandosi sui limiti superiore e inferiore della zona di interesse. Nella "Acquisizione Impostazione" finestra clicca sui pulsanti "Fine Set" e "Start Set" insieme di finestra z-stack ai limiti superiore ed inferiore del volume da acquisire. Selezionare una dimensione passo che è la metà della Z-risoluzione per il dato oggettivo (ad es., Se la risoluzione z è 2 micron scegliere 1 micron). Per determinare la z risoluzione del d'obbiettivoe fare clic sul pulsante con il simbolo di informazioni ( "i") nella finestra "Acquisizione di immagini di controllo".
      11. Impostare una serie tempo per raccogliere z-stack a una frequenza temporale che è appropriato per la dinamica della struttura subcellulare di essere ripreso. Nella sotto-finestra "TimeScan" inserire la frequenza con cui z-stack devono essere acquisiti ( "Intervallo" ') e il numero di volte che le immagini dovrebbero essere acquisite ( "Numeri").
      12. Fare clic sui pulsanti "Time" "profondità" e nella finestra "Acquisizione di immagini di controllo" per confermare che un z-stack e time-series saranno acquisite. Infine, fare clic sul pulsante "XYZT" per iniziare l'acquisizione di immagini time-lapse.
      13. Dopo il completamento di acquisizione delle immagini, osservare "Serie Fatto" sull'interfaccia del software. Fare clic su di esso e salvare le immagini in formato "OIB" per registrare le immagini ei metadati ad essi associati.
        Nota: le immagini ottenute sullain tutto il campo ottico e microscopio confocale possono essere visualizzati e analizzati utilizzando software come FIJI, un pubblico dominio programma di elaborazione di immagini gratuito.

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Risultati

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Qui l'uso di tutto il campo e microscopia confocale a mitocondri immagini e centrosomi in embrioni di zebrafish vivente è direttamente confrontato e contrapposto. A seconda della posizione delle cellule in cui dinamiche organelli devono essere esaminate e la frequenza intrinseca degli specifici eventi subcellulari, generalmente o grande campo o la microscopia confocale è la scelta migliore. Abbiamo ripreso organelli nei neuroni RB situati sulla superficie dell'embrione e in cellu...

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Discussione

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Qui, dimostriamo la versatilità del sistema di espressione GAL4-UAS ai mitocondri tag fluorescenza, centrosomi e le membrane cellulari del specifici tipi di cellule in vivo in embrioni di zebrafish. Molte proteine ​​di fusione fluorescenti che etichettano altri organelli o strutture subcellulari si possono trovare nella letteratura pubblicata e possono essere ottenuti dal rispettivo laboratorio, fonti commerciali o depositari plasmide non commerciali (ad esempio, Addgene). Per progettare una nuova prot...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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P.E. è supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 e dalla Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. è stato supportato da TUM-GS. L.T. è supportato da una borsa di studio EMBO (EMBO ALTF 108-2013). Il lavoro di D.P. sul pesce zebra è stato sostenuto dal DFG attraverso il Sonderforschungsbereich "Molecular Mechanisms of Neurodegeneration" (SFB 596); il Centro per le Scienze Integrate delle Proteine (Monaco di Baviera) e il Settimo Programma Quadro della Comunità Europea (FP7/2007-2013) nell'ambito della convenzione di sovvenzione n. 200611 (MEMOSAD). Attualmente è membro della New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller ed è stato sostenuto da una borsa di studio dell'Accademia tedesca delle scienze Leopoldina. L.G. è sostenuta da finanziamenti del DFG attraverso SFB 870 "Assembly and Function of Neuronal Circuits", Progetto A11.

Siamo grati a Kristina Wullimann per la manutenzione del nostro impianto ittico, a Yvonne Hufnagel per il supporto tecnico e a Thomas Misgeld per i commenti sul manoscritto. Siamo grati a R. Köster (Technische Universität Braunschweig) per aver fornito il vettore M1 Medusa (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) da cui abbiamo clonato Centrin-YFP e S.C. Suzuki e T. Yoshimatsu (University of Washington) per aver fornito la cassetta 14xUAS:MA-cerulea che abbiamo utilizzato per generare il costrutto reporter per creare CentrinFish. Ringraziamo inoltre S.C. Suzuki e T. Yoshimatsu (University of Washington) per la linea transgenica Otx2:Gal4, A. Sagasti per il costrutto Sensory:Gal4-VP16 (UCLA) e M. Nonet (Washington University in St. Louis) per il vettore pCold Heart Tol2. Ringraziamo Bettina Schmid, Alexander Hruscha e Christian Haass (Centro tedesco per le malattie neurodegenerative di Monaco di Baviera - DZNE) per aver contribuito allo sviluppo di MitoFish.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Agarosio (2-idrossietilagarosio)Sigma-AldrichA4018-10GBassa temperatura di gelificazione Tipo VII
Riscaldatore a blocchiEppendorfThermomixer compatto
Ca(NO3)2 Nitrato di calcio idrato, 99,996% Aldrich202967-50gPer preparare la telecamera CCD 30x di Danieau
QimagingRetiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 ForcipeDumont - Fine Science Tools11252-50#5 Pinze
Microscopio confocale a scansione laserOlympusFV1000 Fluoview
Riscaldatore per piatti di colturaWarner Instrument CorporationDH-35Anello riscaldante
Etile 3-amminobenzoato metanosolfato salePharmaQTricaina PharmaQ-25gTricaina (anestetico)
Microscopio da dissezione a fluorescenzaLeicaM205 FA
Kit GeneCleanMP Biomedicals 111001200
Piastre per colture con fondo in vetroMatTek CorporationP35G-0-14-CPiastra di Petri da 35 mm, micropozzetto da 14 mm, vetro di copertura n. 0
Aghi di vetroWorld Precision Instruments Inc.TW100F-4Per microiniezioni
HEPESSigmaH3375-250gPer preparare 30x
grasso per alto vuotoDow CorningDCC000001242 150gGrasso al biossido di silicio
KCl 99%Sigma-AldrichS7643-5kgPer preparare 30x MgSO
4.7H2O     Reagente Solfato di magnesio eptaidrato 98+% A.C.SSigma-Aldrich230291-500gPer preparare 30x Microiniettore di Danieau
 EppendorfFemtoJet
Microloadertips Eppendorf9300010070,5-20 ul
MicromanipolatoreMaerzhaeuser WetzlarMM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Supporto per micropipetteIntracelP/N 50-00XX-130-1
mMESSAGGIO mMACHINE SP6 Kit di trascrizioneAmbionAM1340Per trascrivere PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99,5%Sigma-AldrichP9541-1kgPer preparare 30x
NanofotometroPer misurare la concentrazione di DNA/RNA
Estrattore ad agoStrumento SutterP-1000Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0,80W NikonObiettivo a cono per immersione in acqua
N-Feniltiourea Grado I, circa 98%SigmaP7629-10GPTU (previene la pigmentazione)
Piastre di PetriSarstedt AG 82147292 x 16 mm 
Stampi in plastica Strumenti scientifici adattiviTU-1Per microiniezioni Coperchio
plexiglas con foroSuIl foro nel coperchio in plexiglas deve essere 3 mm più grande del diametro dell'obiettivo a cono per immersione nell'acqua
Filtro per il tè (plastica)Per raccogliere le uova di pesce zebra
Regolatore di temperaturaWarner Instrument CorporationTC-344BDoppia temperatura automatica Controller
Pipette di trasferimentoSarstedt AG 86.1171Pipette di trasferimento in plastica da 3,5 ml
UMPlanFI 100x/1,00 WObiettivo a cono per immersione in acquaOlympus
UMPlanFLN 20x/0,50 W OlympusObiettivo a cono per immersione in acqua
Microscopio a campo largoOlympusBX51WI
PTU (50x Stock)Sciogliere 76 mg di PTU in 50 ml di acqua distillata
Mescolare energicamente a temperatura ambiente 
Conservare a -20 oC in aliquote da 1 ml
Utilizzare a 1x soluzione di lavoro
Tricaina (20x Stock)Sciogliere 200 mg di Tricaina in 48 ml di acqua distillata
Aggiungere 2 ml di base Tris 1M (pH9)
Regolare a pH 7 
Conservare a -20 oC in aliquote da 1 ml
Utilizzare a 1x soluzione di lavoro
Soluzione di Danieau (30x Stock)1.740 mM  NaCl 
21 mM          KCl 
12 mM          MgSO4.7H2O 
18 mM          Ca (NO3)2
150 mM      Tampone HEPES 
Acqua distillata fino a 1 L 
Store a 4 oC 
Utilizzare con soluzione di lavoro 0,3x
di Danieau di Danieau in misura

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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