Articolo metodologico

A lungo termine cateterizzazione della intestinale linfa Tronco e Raccolta della linfa in neonatali Pigs

DOI:

10.3791/53457

⸱

5 marzo 2016

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1Department of Agricultural, Food and Nutritional Science, University of Alberta, 2Department of Surgery, University of Alberta

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo una procedura chirurgica per cateterizzare il tronco linfatico intestinale nei suini neonati per raccogliere grandi quantità di componenti del metabolismo lipidico dalla linfa efferente.

Abstract

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Il cateterismo del tronco linfatico intestinale nei suini neonatali è una tecnica che consente la raccolta a lungo termine di grandi quantità di linfa efferente intestinale (centrale). È importante sottolineare che la raccolta della linfa centrale dall'intestino consente ai ricercatori di studiare sia i meccanismi che le costituzioni lipidiche associate al metabolismo dei lipidi, all'infiammazione intestinale e alle metastasi del cancro, nonché le cellule coinvolte nella funzione immunitaria e nell'immunosorveglianza. Un approccio chirurgico ventrale della linea mediana consente un'eccellente esposizione chirurgica all'addome cranico e un accesso relativamente facile al vaso del tronco linfatico intestinale che si trova vicino al pancreas e al segmento ventrale destro della vena porta sotto l'aspetto viscerale del lobo epatico destro. Il vaso viene meticolosamente sezionato e rilasciato dalla fascia circostante e quindi dilatato con punti di sutura che consentono l'inserimento e il successivo fissaggio del catetere nel vaso. Il catetere viene esteriorizzato e viene raccolto circa 1 L/24 h di linfa in un periodo di 7 giorni. Sebbene questa tecnica consenta la raccolta di grandi quantità di linfa centrale per un lungo periodo di tempo, il successo dipende da un'attenta dissezione chirurgica, dalla manipolazione dei tessuti e da una particolare attenzione alla corretta tecnica chirurgica. Ciò è particolarmente importante con gli interventi chirurgici negli animali giovani, poiché i vasi linfatici possono facilmente lacerarsi, portando potenzialmente al fallimento chirurgico e sperimentale. Il video dimostra un'ottima tecnica chirurgica per la raccolta della linfa intestinale.

Introduzione

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Il sistema linfatico è una zona poco studiato della fisiologia. Modelli preclinici di cateterizzazione linfatico si verificano in diverse specie animali 1-8 e sono utilizzati da industrie farmaceutiche e istituti di ricerca per studiare i meccanismi coinvolti nella lipidico 8-12 e 13-15 metabolismo dei farmaci, metastasi del cancro 16 con trattamento sperimentale 17, e la funzione immunitaria 18 -26. Questo studio esplora l'utilizzo di cateterizzazione intestinale tronco linfa in un modello di maiale domestico per misurare i componenti del metabolismo delle lipoproteine. metabolismo Lipoprotein è coinvolta nella produzione e secrezione di chilomicroni, così come i cambiamenti in lipidi associati e proteine ​​totali. Queste sono considerazioni importanti in quanto vi sono grandi differenze nel metabolismo lipidico tra modelli di roditori comunemente usati e gli esseri umani e in quanto tali, impiegando modelli suini per raccogliere linfa intestinale potrebbe fornire informazioni più comparabili per lo studio dei lipidi memetabolismo nelle persone 27-31.

Diverse tecniche chirurgiche vengono utilizzati per raccogliere la linfa intestinale in grandi specie animali: un approccio spalla cranica (vale a dire, toracico condotto cateterizzazione) 5, una laterale approccio fianco superiore 32-34, ed una linea mediana ventrale o approccio paramediano 22,35. Questo video descrive in dettaglio la procedura chirurgica in suina utilizzando un approccio chirurgico ventrale linea mediana per la cateterizzazione del tronco linfatico intestinale. Un'attenta tecnica consente chirurgiche questo metodo di cateterizzazione linfatico per raccogliere grandi quantità di linfa ei componenti per periodi di tempo prolungati.

Questa tecnica apre una miriade di applicazioni per molte discipline che esaminano le varie funzioni fisiologiche. Le applicazioni potrebbero includere, ma non sono limitati a, tutto lipoproteine ​​corporeo e il metabolismo dei lipidi, immunosorveglianza, genesi tumorale e le metastasi, la funzione intestinale, e la svient e la progressione della malattia infiammatoria intestinale.

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Protocollo

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Tutte le procedure su animali sperimentali descritte in entrambi i video e manoscritti sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali e hanno seguito le linee guida stabilite dal Consiglio canadese di cura degli animali.

1. Anestesia chirurgica e preparazione chirurgica dei maiali neonatali

  1. In un antibagno separato, Premedicare 25 kg maiali vicino alla base del collo con una intramuscolare cocktail di farmaci sedativi-anestetico contenente: azaperone (0,3 mg / kg), ketamina cloridrato (10 mg / kg), la dexmedetomidina (15 mg / kg).
    Nota: Aggiungere buprenorfina (0,005-0,02 mg / kg) nel cocktail di droga pre-anestetico per una maggiore controllo del dolore intra-operatorio.
  2. Anestetizzare i maiali con inalato gas inalazione isoflurano (4-5% isoflurano a 500 ml-1000 ml / min O 2) utilizzando una maschera. Visualizza le corde vocali con un campo di applicazione della laringe veterinario (lunga 17-25 cm lama dritta), e applicare attualità il 10% lidocaina spay alla vocecorde. Lasciare lo spray lidocaina per contattare le corde vocali 30-60 secondi prima di intubazione per ridurre la possibilità di spasmi delle corde vocali e ostruzione delle vie aeree.
  3. Intubare i maiali passando un tubo endotracheale a manicotto (5,0-7,0 mm di diametro interno (ID)) tra le corde vocali e mantenere la dell'anestesia con il gas isoflurano (0,5-2,0% isoflurano a 1.000-2.000 ml / min O 2) utilizzando una chiusa circuito rebreathing sistema di anestesia durante l'intervento chirurgico. Valutare il livello di anestesia dal tono della mascella, ed entrambi i pedali e palpebrali risposte riflesse. gas anestetico scaduto è scavenging e ventilato al di fuori della sala operatoria.
  4. Pulire la superficie esterna del padiglione auricolare con il 2,0% clorexidina soluzione lavaggio chirurgico seguito da un risciacquo alcool isopropilico al 70%. Con un catetere endovenoso 20 G, cateterizzare una vena orecchio per fornire fluidi per via endovenosa (soluzione di Ringer lattato; 5-10 ml / kg / ora) durante l'intervento chirurgico. Fissare un pulsossimetro alla superficie della mucosa della lingua con mednastro iCal per monitorare la frequenza cardiaca e la saturazione di ossigenazione del sangue periferico (SpO2).
  5. Posizionare il maiale anestetizzato in posizione reclinata dorsale e radere l'addome ventrale dalla metà torace caudalmente all'aspetto ventrale del pube. Pulire questa zona con due alternando 2,0% clorexidina scrub chirurgico e lavaggi acqua sterile.
  6. Trasferire il maiale anestetizzato alla suite chirurgica e applicare il lavaggio chirurgico finale del 70% di risciacquo alcol isopropilico, lasciarlo asciugare, e poi drappo l'animale.
  7. Inserire una sonda di temperatura rettale di circa 2-4 cm nel retto per controllare la temperatura del corpo. Posizionare i maiali su una piastra elettrica a ricircolo d'acqua per mantenere la temperatura corporea normale (38-40 ° C) durante la procedura chirurgica.
  8. Passare il maiale con quattro asciugamani teli disposti in uno schema quadrante sovrastante intorno all'addome. Posizionare il primo drappo attraverso xiphisternum, il secondo telo lungo faccia laterale del ventre a circa 5 cm lateralmente alla linea mediana addominale. Posizionare il terzo copre tutta la cresta ileale del bacino e il quarto drappeggio, come il secondo telo (anche sul lato opposto), è posto lungo la faccia laterale dell'addome circa 5 cm lateralmente alla linea mediana addominale.
  9. Mettere un grande drappo tavolo, con una fessura di apertura che consente l'accesso al sito chirurgico, nel corso dei sottostanti tende asciugamano e coprire il maiale e tutto il tavolo operatorio. Il drappo finale è un steri-drappo monouso posto sopra il grande tavolo drappeggio.

2. chirurgia addominale e cateterizzazione della intestinale linfatico Tronco

  1. Fare un 20 centimetri incisione cutanea con una lama di bisturi per esporre i muscoli addominali sottostanti. Incidere strati muscolari addominali con elettrocauterizzazione mono-polare (20 impostazione Watt) per esporre il peritoneo parietale. Aprire un segmento lineare 20 cm peritoneo parietale con le forbici Metzenbaum per accedere visceri addominali e dei vasi linfatici.
  2. Posizionare riavvolgitore craniale dell'incisione chirurgica per mantenere la cavità addominale aperta per la durata dell'intervento.
  3. Bagnare tutti i tessuti con acqua calda (37 ° C) soluzione salina sterile per tutta la procedura chirurgica. Sollevare delicatamente un ampio segmento della intestinali, comprese colon, cieco, ileo e digiuno dalla cavità addominale e esteriorizzare al fianco sinistro del maiale per accedere alla parte superiore dell'addome, fegato e vasi linfatici. Fissare l'intestino esteriorizzato in posizione con tende asciugamani aggiuntivi in ​​modo da formare una fionda per sostenere delicatamente l'intestino.
  4. Individuare il vaso linfatico, depone circa 4 cm cranio-mediale della vena renale destra, 6 cm ventrale caudale-medial- dei capireparto cavali e sotto l'aspetto viscerale del lobo destro del fegato nei pressi del pancreas 22,36,37. Identificare il vaso linfatico come struttura traslucido giustapposto al segmento ventrale destro della vena porta 36,37.
  5. Separare il Vess linfaticaEL dalla fascia circostanti delicatamente prendere in giro via il tessuto attaccato con applicatori Q-Tip. Una volta che gli aspetti laterali del recipiente sono separati dal tessuto circostante, creare un'apertura "tunnel" sotto l'imbarcazione con fine smussato punta pinze.
  6. Passare tre 2-0 punti di sutura di seta sotto il vaso linfatico con una pinza sottile. Legare la sutura più caudale prima per occludere, dilatare e riempire il vaso di linfa. Volutamente lasciare le estremità di questa sutura relativamente lungo (4 cm) per fissare il catetere al vaso linfatico. Inserire altre due suture separate 1,0 cm l'una dall'altra e sono circa 1,0-1,5 cm cranici alla sutura caudale protetto. Lasciare questi due punti di sutura con un 'unica legame legatura sciolto' per consentire la più rapida messa in sicurezza del catetere nel vaso.
    Nota: Il segmento del vaso linfatico situato tra la sutura legatura più caudale e suturare mezzo (dei due suture craniche) è il sito per cateterizzazione. Per quanto riguarda sumateriale tura, 2-0 Polyglactin sutura può sostituire 2-0 punti di sutura in seta, se necessario.
  7. Tagliare un piccolo foro nel contenitore con forbici iris e dilatare il vaso con pinza sottile smussato. Inserire circa 1.0-1.5 cm di tubo del catetere specializzata (4.06 Diametro esterno (OD) X 2,31 millimetri ID) con una estremità smussata nel recipiente e legare le due suture craniche per fissare il catetere in posizione. Utilizzare i lati lunghi di sutura della sutura caudale per fissare il catetere alla nave.
  8. Lavare l'intestino esteriorizzato con abbondanti quantità di soluzione salina calda e delicatamente riportarlo alla cavità addominale assicurare il corretto posizionamento anatomica dell'intestino.
  9. Esteriorizzare il catetere a metà fianco sinistro (5-10 cm ventralmente dalla fossa paralombare). Effettuare una incisione cutanea con un bisturi e passare un trocar dalla cavità addominale per la superficie della pelle per creare un'apertura per l'esteriorizzazione del catetere. Utilizzare un grande pinza Kelly esteriorizzare il catetere dal cav addominaleIty attraverso l'apertura trequarti.
  10. Chiudere il peritoneo parietale con un semplice modello di sutura continua di 2-0 Polyglactin di sutura con un ago rotondo (conico). Chiudere gli strati muscolari addominali con un semplice modello di sutura interrotta con una sutura 2-0 Polyglactin su un ago rotondo.
  11. Chiudere la pelle in un modello sottocuticolare con 2-0 Polyglactin di sutura su un ago di taglio. Fissare il catetere esteriorizzato alla pelle con un modello di sutura a borsa di e una sutura 2-0 in nylon su un ago di taglio.
  12. Inserire un rivestimento speciale sul maiale pur anestetizzati per facilitare il suo posizionamento e ridurre lo stress del maiale durante il recupero.

Recupero 3. post-chirurgica e la linfa Collection

  1. Circa 10 minuti prima della sospensione del anestesia per inalazione, amministrare bupenorphine (0,1 mg / kg) per via intramuscolare di fornire immediata analgesia post-intervento chirurgico. Continuare bupenorphine (0,1 mg / kg) ogni 12 ore per 24-48 ore per mantenerepost-operatorio analgesia.
  2. Monitorare i maiali per complicazioni post-chirurgiche ogni 8-12 ore per un periodo di 7 giorni.
  3. Raccogliere la linfa in bottiglie da 500 ml di lavaggio in polipropilene, rivestito con etilendiammina tetraacetico (EDTA), e integrato con antibiotici; penicillina (6.000 UI), streptomicina (6 mg) e amfotericina B (3 mg) ogni 12 ore per un periodo di 7 giorni.

4. Quantificazione delle lipoproteine ​​ApoB48, trigliceridi, colesterolo e proteine ​​totali raccolti da Lymph

  1. Centrifugare il campione linfa a 1.800 xg per 5 minuti a 4 ° C. Raccogliere il surnatante e usarlo per la quantificazione dei trigliceridi, colesterolo e proteine ​​totali.
  2. Dividere il surnatante in tre campioni: un campione non diluito, un 01:20 acqua distillata campione diluito e un campione finale diluito 1: 100 con acqua distillata.
  3. Utilizzare il surnatante non diluito per misurare i livelli di colesterolo, con un kit disponibile in commercio.
  4. Utilizzare il 01:20 e 01:100 campioni diluiti per misurare trigliceridi e livelli di proteine ​​totali con un kit disponibile in commercio e il dosaggio della proteina acida totale bicinconinico rispettivamente.

5. Quantificazione delle lipoproteine ​​ApoB48, Raccolti da Linfa 38

  1. Determinare la concentrazione di lipoproteina ApoB48 con un adeguato sistema immunitario metodo di Western Blotting 38. linfa totale separata con 3-8% Tris-acetate- sodio dodecil solfato gel di poliacrilammide (SDS-PAGE).
  2. Trasferire le proteine ​​separate da una membrana di fluoruro di polivinile (0,45 micron) e incubare con un anticorpo policlonale di capra al ApoB (1: 4.000), poi si legano con un anticorpo secondario anti-capra.
  3. Quantificare la lipoproteina ApoB48 con chemiluminescenza utilizzando un confronto densitometrica lineare con roditore purificata standard di proteine ​​ApoB48.

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Risultati

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cateterizzazione linfatico del tronco linfatico intestinale dei suini neonatale permette la raccolta di circa 1 L / 24 ore di linfa centrale nel corso di un periodo di 7 giorni. La linfa raccolte in questo esperimenti conteneva componenti del metabolismo lipidico, proteine ​​cioè totale linfa, ApoB48 lipoproteine, trigliceridi, proteine ​​totali e colesterolo. Tabella 1 evidenzia importi rappresentativi di tali componenti lipidici da campioni di linfa pool di tre maiali. In particolare, ...

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Discussione

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Raccolta linfa intestinale è un ottimo metodo per studiare i meccanismi coinvolti nella lipidi 8-12 e 13-15 farmaco metabolismo, metastasi del cancro 16,17, il traffico delle cellule e la funzione immunitaria 18-26, in vari modelli sperimentali animali. Infatti, la capacità di raccogliere grandi quantità di ciascuna periferica (afferente) e centrale (efferente e grandi vasi tronco) linfa per un periodo prolungato è particolarmente importante per la comprensione dei cambiamenti...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Il lavoro è stato sostenuto in parte dal finanziamento dell'Alberta Livestock and Meat Agency e dalla sovvenzione del Natural Science and Research Council Discovery a S. D. Proctor.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Lama per laringoscopio MillerWelch Allyn68044lunghezza 182 mm
Surgivet advisor: Monitor dei segni vitaliSurgivetV9203
Sonda di temperatura rettaleSurgivetV3417
Generatore di elettrochirurgia monopolareValley Lab
Forbici MetzenbaumFine Science14518-18
Divaricatore TuffierStevens162-11-676
Pinze per zanzareStevens162-7-10
Forcipe Kelly-curvo (14cm)Stevens162-7-38
Forcipe per tessuti AllisStevens162-7-38
Forcipe dressing-eye (10,2cm)Stevens162-18-780
Forcipe per medicazione-Adison (12,1 cm)Stevens162-17-2510
Trascinatori ad agoStevens162-V98-42
Forbici per irideFine science14058-11
Pompa di circolazione dell'acquaJorvetJ-783X
Maxitherm-Coperta in vinileJorvetJ-784C
Applicatori di punte QFisher Scientific22-037-960
Cateterismo  tubi (4,06 OD X 2,31 ID)Braintree Scientific Inc.MRE-160Tubo di impianto Micro-Renetano
2-0 sutura in setaEthiconLA556
2-0 sutura in poliglactinaEthiconJ443H2-0 vicryl
Giacca per animali di grandi dimensioniLomir Biomedical Inc.SSJ2YC
Flaconi di lavaggio in polipropileneFisher Scientific03-409-22C500 ml
Penicillina-StreptomicinaSigma AldrichD4333
EDTASigma Aldrich60-00-4
Amfotericina BSigma AldrichA2411
AzaperoneElanco Animal HealthStresnil
Dexmedetomidina cloridratoZoetis6295Dexdomitor
IsofluranoAbbott Animale Salute05260-5IsoFlo
Ketamina cloridratoZoetis2626Ketaset
Bupenorfina cloridratoChampion Alstoe SaluteDIN:02347510
Tubo endotracheale da 6 mmJorvetJ-165d
10% Lidocaina sprayAstraZenecaDIN:02003767
4% Scrubchirurgico alla clorexidinaPartnar Animal HealthPCH-011Diluito: soluzione al 2,0%
3M Sterilizzatore chirurgico 3MHealth Care1040
SDS page gelInvitrogenEA0375BOX3-8% tris acetato
Membrana al fluoruro di polivinilideneMilliporeIPVH000100,45 μ m dimensione dei pori
Anticorpo ApoB EMD MilliporeAB7421:4000 diluizione
Asino anti-capra IgG-HRPSanta Cruz BiotechnologySc-2304
ECL Prime Western Blotting ReagenteGE Healthcare LifeSciencesRPN2232     
Kit di trigliceridiWako Pure Chemicals998-40391/994-40491
Kit di colesterolo totaleWako Pure Chemicals439-17501
Proteine totali  Pierce 23225Saggio dell'acido bicinconinnico
degli animali

Riferimenti

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