Misura e Analisi di extracellulare Acido prodotte per determinare glicolitica Tasso

Sommario

La glicolisi è un marcatore metabolico determinante in molteplici sistemi biologici. Il monitoraggio della glicolisi misurando il flusso extracellulare di H⁺ è comune, ma richiede una correzione quantitativa e inequivocabile. Qui, dimostriamo come raccogliere e correggere i dati del flusso extracellulare per distinguere tra fonti respiratorie e glicolitiche di acidificazione extracellulare.

Abstract

La misurazione extracellulare del consumo di ossigeno e della produzione di acido è un modo semplice ed efficace per monitorare i tassi di respirazione e glicolisi¹. Sia le reazioni mitocondriali (respirazione) che quelle non mitocondriali (altre reazioni redox) consumano ossigeno, ma queste reazioni possono essere facilmente distinte dall'inibizione chimica della respirazione mitocondriale. Tuttavia, mentre il consumo di ossigeno mitocondriale è una misura univoca e diretta della frequenza respiratoria², lo stesso non vale per la produzione di acido extracellulare e la sua relazione con la velocità glicolitica ^3-6. L'acido extracellulare prodotto dalle cellule deriva sia dal lattato, prodotto dalla glicolisi anaerobica, sia dal CO₂, prodotto nel ciclo dell'acido citrico durante la respirazione. Per la glicolisi, la conversione del glucosio in lattato^- + H⁺ e l'esportazione dei prodotti nel terreno di analisi è la fonte dell'acidificazione glicolitica. Per la respirazione, l'esportazione di CO₂, l'idratazione in H₂CO₃ e la dissociazione in HCO₃^- + H⁺ è la fonte di acidificazione respiratoria. Le proporzioni di acidificazione glicolitica e respiratoria dipendono dalle condizioni sperimentali, compreso il tipo di cellula e il substrato o i substrati forniti, e possono variare da quasi il 100% di acidificazione glicolitica a quasi il 100% di acidificazione respiratoria ⁶. Qui, dimostriamo i metodi di raccolta e calcolo dei dati necessari per determinare i contributi respiratori e glicolitici all'acidificazione extracellulare totale da parte di cellule intere in coltura utilizzando cellule mioblastiche C2C12 come modello.

Introduzione

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di misurare con precisione il tasso di glicolisi delle cellule utilizzando l'analisi del flusso extracellulare. Misurazione quantitativa della glicolisi con acidificazione extracellulare è il punto finale desiderato di molti esperimenti. Tuttavia, il tasso totale di acidificazione extracellulare è la somma di due componenti: acidificazione respiratoria, sotto forma di CO _{2 (che} idrata di H ₂ CO ₃ dissocia poi HCO ₃ ^- + H ^+), e l'acidificazione glicolitico, nella forma di lattato ^- + H ^+.

I contributi di CO _{2 a} totale acidificazione extracellulare sono stati fino a poco tempo considerato trascurabile nella piattaforma di misurazione utilizzato qui, l'analizzatore XF24 ^7. Tuttavia, è chiaro in più di altri sistemi _che la CO2 può essere un fattore importante di acidificazione extracellulare ^4-5. Molteplici documenti riconoscono questo concontributo, ma non tentare quantificazione diretta delle emissioni di CO ₂ -derived ^3,8,9 acido. Abbiamo recentemente dimostrato quantitativamente che il CO ₂ produzione è una fonte significativa di acidificazione extracellulare in questo sistema ^6. Inoltre, anche se ci sono più vie metaboliche che generano _CO2 dal catabolismo del glucosio, quelli effettuati da deidrogenasi matrice nel ciclo dell'acido citrico sono i contribuenti travolgente e tutte le altre fonti di generare quantità di CO ₂ che si trovano entro l'errore sperimentale ^6.

Senza correzione per CO ₂ produzione, acidificazione extracellulare è quindi un indicatore ambigua di glicolisi e non può essere utilizzato quantitativamente. La nostra precedente pubblicazione evidenzia diversi casi in cui respiratorio CO _{2 comprende} la massa del segnale totale acidificazione, anche in cellule generalmente creduto per utilizzare principalmente glicolisi ^6. Inoltre, larespiratorio CO ₂ di acidificazione totale varia ampiamente nel corso di esperimenti comuni profili metabolici, dimostrando che corretto confronto della glicolisi durante le diverse parti di un esperimento richiede correzione per CO _2.

Per misurare la glicolisi di celle utilizzando il tasso di acidificazione extracellulare, è necessario convertire variazioni di pH a variazioni totale H ⁺ generati, e sottrarre l'acidificazione extracellulare causato da CO ₂ rilasciata durante il funzionamento del ciclo dell'acido citrico. Qui, descriviamo un metodo semplice per misurare extracellulare tasso di produzione di protoni (da cambiamenti extracellulari di pH e la forza calibrata tampone del terreno di coltura) e _produzione di CO 2 (da cambiamenti extracellulari della concentrazione O _2), e dimostrare come calcolare glicolisi utilizzando queste misurazioni.

Questa forza metodo ens l'utilità della misura acidificazione extracellulare utilizzando per calcolare correttamente glicolisi come definito dalla produzione di lattato. Senza correzione per CO respiratoria ₂ (o misurazione diretta di lattato), è impossibile stabilire se e in che misura il tasso di acidificazione totale riflette glicolisi, confondendo l'interpretazione degli esperimenti che utilizzano totale acidificazione extracellulare come una misura diretta di produzione di lattato.

CALCOLI

_CO 2 e lattato sono, entro l'errore sperimentale, le uniche due collaboratori di produzione di acido extracellulare, sulla base di esperimenti con le cellule mioblasti ^6. Pertanto, il tasso di acidificazione totale extracellulare (PPR, velocità di produzione di protoni) può essere definito come:

PPR _{tot =} PPR _{rispettivamente} + PPR _GLYC Equazione 1

. _content "> dove tot = totale; resp = respiratorio; GLYC = glicolitico glicolitica PPR è quindi:

PPR _GLYC = PPR _tot - PPR _resp Equazione 2

Qui,

PPR _{tot =} ECAR _tot / BP equazione 3

dove ECAR = tasso di acidificazione extracellulare (mph / min), e BP = potenza di buffering (mph / pmol ^H + in 7 ml), mentre

PPR _resp = (10 ^{pH-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-PK ₁₎₎} (max H ⁺ / O ₂₎ (OCR _tot - OCR _{rot / myX)} Equazione 4

dove K ₁ = costante di equilibrio combinato di CO ₂ l'idratazione e la dissociazione di HCO ₃ ^- + H ^+; max H ⁺ / O ₂ = °e CO ₂ acidificazione -derived per una particolare trasformazione metabolica come completa ossidazione del glucosio ^6; OCR = tasso di ossigeno consumo (pmol O ₂ / min), e OCR _{rot / myX} = OCR non mitocondriale.

Equazione 4 isolati OCR mitocondriale sottraendo qualsiasi OCR non mitocondriale (definito come OCR che è resistente alla respiratoria mitocondriale veleni rotenone e myxothiazol) e rappresenta la massima H ⁺ generato per O ₂ consumata per ogni substrato (max H ⁺ / O ₂ ) (vedi ^6), nonché la concentrazione di CO ₂ dando luogo a H ⁺ alla temperatura sperimentale e pH (10 ^{pH-pK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-pK _1).} Per la piena ossidazione del glucosio, dell'ossigeno mitocondriale Consumo Rate (OCR) è esattamente uguale alla velocità di _produzione di CO 2. Nel volume confinato test di misurazione del flusso extracellulare, CO ₂ prodottid dalla respirazione rimane intrappolata nel terreno di coltura. La maggior parte del intrappolato CO ₂ è idratata a H ₂ CO _3, che poi dissocia in HCO ₃ ^- + H ^+. Una piccola frazione rimane disciolto ma non idratata, e un'altra piccola frazione è idratata ma non dissociato, come dettato termodinamicamente dalla costante di equilibrio combinato di CO ₂ idratazione e la dissociazione di HCO ₃ ^- + H ⁺ a temperatura sperimentale (37 ° C) e pH (~ 7.4).

Così, l'equazione completa per il calcolo PPR _g sottraendo PPR _{rispettivamente} da PPR _tot è:

PPR _GLYC = ECAR _tot / BP - (10 ^{pH-PK ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-PK ₁₎₎} (max H ⁺ / O ₂₎ (OCR _tot - OCR _{rot / myX)} Equazione 5

ion questo modo, i tassi di respirazione e glicolisi, così come i loro associati tassi di produzione di ATP, può essere determinata quantitativamente da misure dirette (consumo di ossigeno, acidificazione extracellulare, capacità tampone) e l'importazione o il calcolo di altri valori richiesti (H ⁺ / O ₂ , P / O, e l'equilibrio costante K ₁₎ ^6. L'esperimento descritto qui espande su tecniche standard per l'utilizzo del extracellulare flusso Analyzer come Seahorse XF24 ^10,11; per altri formati di misura del flusso extracellulare (ad esempio, XF ^e 96, o XFP), tutti i volumi sottostanti devono essere scalati in modo appropriato.

Il potere tampone del terreno di coltura può essere misurata con la costruzione di una curva standard direttamente nella piattaforma flusso extracellulare o separatamente utilizzando una sonda pH calibrata. Qui, tre opzioni per la misurazione buffer dal terreno di coltura di flusso extracellulare sono dati, compreso l'uso di tutti i iniezsulle porte dell'analizzatore flusso extracellulare con pozzetti dei campioni privi di cellule, o con solo l'ultimo di iniezione nella cella contenente pozzetti (sezione 1) o utilizzando una misurazione del pH esterno (sezione 2). Vedere il foglio allegato per l'intero calcolo dei dati di esempio.

Per misurare la potenza buffer utilizzando la funzionalità di rilevamento-pH dello strumento di flusso extracellulare, è più sicuro utilizzare i pozzi privi di cellule per minimizzare variazione del segnale. Tuttavia, entro l'errore, non esiste alcuna differenza statistica tra e cellule contenenti pozzetti durante l'esecuzione di questa misura acellulare (dati non mostrati). NOTA: La variazione descritto al punto 1.7 porta il vantaggio di contabilità per eventuali modifiche al buffer conferiti da composti aggiunti o dalla presenza di cellule, con lo svantaggio di segnale rumoroso. Tuttavia, come detto sopra, non state riscontrate differenze significative nel potere tampone calcolata tra la struttura senza cella mostrata in Tabella 1 eil design post-esperimento in Tabella 2, nelle condizioni sperimentali descritte qui.

Inoltre, su piccole serie ΔpH (<0,4 unità; sperimentalmente meglio limitate a 0,2 unità), la pendenza lineare, ottenuto riportando Δ mph / pmol ^H + approssima adeguatamente il rapporto tra la logaritmica ΔpH e [H ^+]. La pendenza di questa curva standard rappresenta quindi la potenza tampone del terreno di coltura in prova pH / nmol H ⁺ in 7 ml, o mpH / pmol H ⁺ in 7 ml. Si consiglia di aumentare il potere di buffering media o diminuire la densità delle cellule per i campioni che superano una variazione unitaria di 0,2 pH durante il tempo di misura. Il tempo di misura può essere diminuita, ma ciò potrebbe ridurre il tasso di acidificazione stato stazionario e di introdurre errori nel calcolo del tasso.

Protocollo

1. Misurazione buffering Potenza in un extracellulare strumento Flux: due varianti

NOTA: i calcoli ed i metodi qui descritti sono stati sviluppati utilizzando un extracellulare Flux Analyzer. Per gli altri strumenti, il volume di misura deve essere scalato in modo appropriato.

1. Preparare 0,1 M di serie HCl in acqua utilizzando HCl concentrato (vedi Materiali e attrezzature), secondo le istruzioni del produttore.
   Nota: Un esempio di calcolo per la preparazione di iniezioni HCl per l'uso in tutte le quattro porte di iniezione è mostrato in Tabella 1:

Tabella 1. consecutive iniezioni HCl in un saggio del flusso extracellulare così.

2. Preparare diluizioni dello standard HCl nel mezzo da dosare come in tabella 1 per il numero di repliche tecniche che sono carrIED in un piatto, più uno per permettere di errore pipettamento, ad esempio, per quattro repliche tecniche della porta A iniezione, preparare uno stock di (1,1 ml x 5) 0,1 M HCl a (48,9 ml x 5) terreno di coltura.
3. Distribuire 50 ml in ciascuna Port A della cartuccia sonda di misura. Ripetere questa procedura per i porti rimanenti B, C e D.
4. Eseguire un test flusso extracellulare ^{10 con} un ciclo di calibrazione standard, seguita da due cicli di [2 min mix, 1 min aspettare, e 5 min misura] per ciascuno dei quattro aggiunte di porta (vedere Figura 2).
   1. Programmare all'esperimento precedente nel software dello strumento secondo le istruzioni del software. Caricare la cartuccia disposta nella macchina ed eseguire la calibrazione secondo le istruzioni del software.
   2. Quando viene richiesto dal programma, rimuovere la piastra-calibrante contenente e inserire la piastra contenente terreno di coltura in ciascun pozzetto nello strumento; proseguire il programma.
5. U cantare la media di 8-10 punti di dati ottenuti allo stato stazionario (tipicamente gli ultimi 8-10 punti) prima e dopo ogni aggiunta porto, calcolare il (cumulativo) differenza di pH (ΔpH) causate da ogni iniezione di acido standard.
6. Tracciare ΔpH contro nmol H ⁺ contenuta nel volume 7 microlitri intrappolato dalla sonda di misura. La pendenza lineare è il potere di buffering (BP) in mph / pmol H ^+.
7. In alternativa ai punti 1,2-1,3, effettuare le misurazioni ΔpH seguenti un test in cui le porte A, B, e C sono utilizzati per lo svolgimento di un esperimento, seguita da una iniezione di HCl a Port D. Come nella tabella 2, quattro repliche tecniche sono usato per generare ogni punto di una curva standard a 5 punti in 20 pozzi sperimentali (esclusi i pozzi quattro sfondo di correzione della temperatura) della piastra test del flusso extracellulare.

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Tabella 2. Single HCl iniezione in un test di flusso extracellulare bene.

2. Misura buffer di alimentazione Uso un misuratore pH esterno

NOTA: Per misurare il potere tampone di un supporto tramite una sonda pH esterna, calibrare la sonda a 37 ° C e mantenere questa temperatura per tutti i reagenti durante l'esperimento.

1. Preparare 0,1 M di serie HCl in acqua utilizzando HCl concentrato in base alle istruzioni del produttore.
2. Sonda Warm pH, pH standard, il terreno di coltura il cui potere tampone deve essere misurata, e 0,1 M HCl a 37 ° C in un bagno d'acqua.
3. Calibrare sonda pH a 37 ° C in base alle istruzioni del produttore. Mantenere tutti i reagenti a 37 ° C durante tutta la seduta utilizzando una lastrina di calore o bagnomaria.
4. Aliquotare 10 ml di terreno di coltura in un piccolo beaker o tubo conico. Monitorare continuamente pH utilizzando una sonda pH immerso.
5. Aggiungere 0,1 M HCl al comedice di medie 10-20 aliquote microlitri.
   1. Garantire la miscelazione utilizzando un ancoretta o agitando manualmente il contenitore dopo ogni aggiunta di acido.
   2. Attendere alcuni secondi per la misurazione del pH si stabilizzi, quindi registrare il pH dopo ogni aggiunta.
   3. Come dimostrato nella tabella 3, fare un numero sufficiente di aggiunte per assicurare calcolo della pendenza preciso e per coprire il ventaglio di pH previsto durante l'esperimento.

Tabella 3. Misurazione potere tampone con un pH-metro. I dati rappresentano un tipico esperimento con sei aggiunte 20 microlitri di 0.1 M HCl.

6. Plot ΔpH contro nmol H ⁺ aggiunto per 7 microlitri, dando una pendenza lineare che rappresenta il potere tampone (Figura 1).

Figura 1. Determinare potere buffering. Curva standard HCl misurato come in Tabella 1, tabella 2 o (qui) come in tabella 3. La pendenza della curva di interpolazione lineare determina il potere tampone (pH / nmol H ⁺ in 7 ml). Ogni punto rappresenta media ± SEM di n = 9 replicati tecnici.

7. Una volta che il potere di buffering è conosciuto attraverso il metodo 1 o 2 di cui sopra, convertire il segnale ECAR (mph / min) di PPR (pmol H ⁺ / min / proteine ​​mg) dividendo ECAR dal potere buffer (BP) (mph / pmol ^H +) e il ridimensionamento al contenuto proteico di ogni bene:
   PPR _tot (pmol H ⁺ / min / mg di proteine) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol ^H + in 7 ml) / proteine ​​per bene (mg) Equazione 6
8. In alternativa, utilizzare gli stessi esperimenti nel metodos 1 o 2 per calcolare la (BC) valore buffering capacità utilizzata dal software strumento per calcolare automaticamente PPR durante la raccolta dei dati.
   NOTA: L'utente strumento manuale ¹² (pagina 107) fornisce informazioni dettagliate sul calcolo e l'utilizzo della capacità di buffering, dove aC è descritto come
   BC (mol / L) = moli H ⁺ / (ΔpH Volume x tampone (L)) L'equazione 7
   NOTA: la capacità tampone come definito nell'equazione 7 può essere calcolato in strumento o sonda pH esterno saggi sopra descritti. La conversione tra potenza buffering e capacità tampone è fatto facilmente (vedi foglio allegato):
   BC = 1 x 10 ^-9 / BP ((mph / pmol ^H + in 7 ml) / 7 ml) Equazione 8
   NOTA: Se noto prima di eseguire il test, il potere tampone può essere inserito direttamente nel software dello strumento durante l'installazione sperimentale.
9. Applicare questa procedura e calcoli utilizzati in precedenza per molti sistemi tampone convenzionali, come descritto nella precedente pubblicazione ^6.
   NOTA: La tabella 4 elenca il potere e la capacità di buffering buffer di diversi media tradizionali.

Tabella 4. potere buffering e capacità tampone di supporto selezionato.

3. Esecuzione di un extracellulare Flux test utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

NB Al punto 3.4.3, non sono state osservate differenze riguardo la CO ₂ -derived produzione di acido dipende dalla presenza di anidrasi carbonica nella cultura C2C12, suggerendo che la sua presenza non è richiesta per la conversione completa di CO ₂ di HCO ₃ ^- + H ^+. Tuttavia, empiricamente prove in diversi sistemi sperimentali è consigliato prima omitting carbonica.

1. Culture topo C2C12 mioblasti ¹³ a 37 ° C sotto 95% aria / 5% di CO ₂ in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con glucosio 11,1 mM, glutammina 2 mM, 10% v / v di siero fetale bovino (FBS), 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina.
2. 24 ore prima del saggio, cellule piastra / seme in 100 ml di terreno di coltura stessa a 20.000 cellule / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti test polistirene extracellulare flusso (vedi Materiali e Metodi) senza ulteriore rivestimento.
3. Diluire oligomicina, FCCP, e rotenone più myxothiazol, e HCl (opzionale) a 10 volte la concentrazione finale di Krebs Ringer fosfato HEPES (KRPH) a medio dosaggio (2 mM HEPES, 136 NaCl mm, 2 mm NaH _{2 PO} 4, 3.7 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 1.5 mM CaCl _2, 0.1% w / v sieroalbumina bovina grassi-acidi, pH 7,4 a 37 ° C).
4. Preparazione delle cellule
   1. 30 min prima del test, lavare cellule aderenti tre volte aspirando a gente rimuovere il supporto dal pozzo e poi, lentamente, aggiungendo 500 microlitri KRPH.
   2. Incubare le cellule dopo il terzo fase di lavaggio a 37 ° C sotto aria (non sotto 5% di CO _2, che altererà il pH di questa coltura privo di bicarbonato).
   3. All'avvio del test, sostituire KRPH in pozzi con 500 ml KRPH fresco contenente 500 U / ml carbonica e sia il glucosio (10 mm) o unico mezzo, senza alcun supporto aggiuntivo.
5. Caricamento della cartuccia sensore
   1. Dispensare 50 aliquote microlitri di ogni 10x composto preparato al punto 3.3 nei porti della cartuccia di una cartuccia extracellulare flusso sensore come segue (concentrazioni finali di test ben fornite): Porta A: 2 mg / ml oligomicina, Porta B: 0,5 micron FCCP, Port C : 1 mM rotenone, 1 mM myxothiazol, Port D: HCl (se eseguire una calibrazione acido-dosaggio come sopra descritto ed in Tabella 2).
      NOTA: ai fini della completa inibizione catena respiratoria descritto qui, 1 micron mieixothiazol può essere usato in modo intercambiabile con 1 micron antimicina A.
6. Extracellulare test di flusso:
   1. Eseguire un test di flusso extracellulare standard per determinare il controllo delle vie respiratorie, come descritto nel ^10.

NOTA: Per ogni segmento dell'esperimento, determinare il mix, attendere e tempi di misurazione desiderata, così come il numero di cicli per ogni segmento.

NOTA: I dati nella Tabella 5 sono stati raccolti in due cicli di dosaggio di 2 min mix, 1 min aspettare, e 5 min misura per ogni segmento, con tre cicli di dosaggio che si verificano dopo l'aggiunta Port D di diverse quantità di HCl (per la calibrazione del buffer potere come in Tabella 2).

Tabella 5. extracellulare configurazione test di flusso.

4. Gamma di misurazioneng End-point concentrazione di lattato

NOTA: Per convalidare il saggio indiretto qui descritto in un sistema diverso, punto di concentrazione di lattato fine alla fine di un esperimento flusso extracellulare può essere determinato direttamente in una piastra a 96 pozzetti convenzionale misurando la velocità iniziale (oltre 2 min) di riduzione ^NAD + → NADH catalizzata da lattato deidrogenasi, descritta in dettaglio nel nostro precedente pubblicazione ^6. Per i dati presentati in Rappresentante dei risultati, il punto finale concentrazione di lattato in pozzetti contenenti glucosio era ~ 40 micron.

1. Preparare medio idrazina 2x: 1 M Tris, 20 mM EDTA, idrazina 400 mM, pH 9,8 a 22 ° C). Immediatamente prima dell'inizio del test, aggiungere NAD ⁺ a 4 mM e lattato deidrogenasi (LDH) a 40 U / ml. Tessitura media dosaggio finale (1x): Tris 500 mM, EDTA 10 mM, idrazina 200 mM, 2 mM NAD ^+, 20 U / ml LDH.
2. Immediatamente dopo il dosaggio flusso extracellulare, rimuovere il 100ml di terreno di coltura da ciascun pozzetto della piastra di dosaggio flusso extracellulare e trasferimento in un pozzetto di una opaca (nero) piastra a 96 pozzetti.
3. Per ogni campione bene, aggiungere 100 microlitri 2x medio idrazina.
4. Caricare immediatamente il piatto in un lettore di micropiastre e iniziare a monitorare NADH fluorescenza a 340 nm di eccitazione / 460 nm di emissione.
5. Registrare la velocità iniziale per circa 2 minuti.
6. Eseguire un esperimento simile a costruire una curva standard tracciando velocità iniziale contro la concentrazione di lattato per le concentrazioni di lattato aggiunto 0-50 micron.
7. Calcolare la concentrazione di lattato in ogni sperimentale pozzetto utilizzando la curva standard.

5. Misurare contenuto proteico

1. Rimuovere restante terreno di coltura da ciascun pozzetto della piastra di dosaggio.
2. Lavare i pozzetti tre volte con 250 microlitri KRPH senza BSA, facendo attenzione a ridurre al minimo il sloggiare delle cellule dalla superficie ben inferiore.
3. Aggiungere 25 microlitri RIPA lisimedio (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v sodio desossicolato, 0,1% v / v SDS, pH 7,4 a 22 ° C) a ciascun pozzetto della piastra dosaggio.
4. Incubare la piastra in ghiaccio per 30 min.
5. Agitare piastra su un agitatore a 1200 rpm per 5 min.
6. Misurare concentrazione proteica con metodi standard, ad esempio, mediante test BCA, assicurandosi che la composizione del tampone di lisi è compatibile con il metodo di misurazione. Il contenuto proteico nell'esperimento di figura 2 era ~ 4 mg / pozzetto.

Risultati

La Figura 2 mostra i dati grezzi per un tipico esperimento. Gli ultimi 10 punti di misurazione della registrazione point-to-point di entrambi OCR e pH (ombreggiata barre verticali) sono stati utilizzati per i calcoli. Preoccupazioni iniziali che il valore medio (misura del punto centrale) di ciascun ciclo di test non fornirebbero una risoluzione sufficiente di tasso per un calcolo preciso, in particolare per quanto ci sembrava essere un leggero ritardo tra oltre porto e costante tasso di acidificazione di stato, non sono state confermate, ciò non appare contribuire significativamente all'errore di calcolo (non mostrato). In alternativa, se viene immessa la capacità tampone corretto durante l'installazione sperimentale, PPR può essere letta direttamente dalla lettura di raccolta dei dati dello strumento per la visualizzazione della potenza PPR nel software strumento o nel formato compatibile con PC disponibile come una delle impostazioni di output dei dati.

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Figura 2. Rappresentante tracce flusso extracellulari di _O 2 e H ^+. OCR e pH tracce per l'esperimento di esempio nella tabella 5, contenente glucosio 10 mM all'inizio del test. Port D ha avuto diverse concentrazioni di HCl per la calibrazione del potere buffer (non in queste tracce medi). I dati di pubblicazione precedente ^6. Ogni punto rappresenta media ± SEM di n = 8 repliche biologiche. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

L'analisi dei dati dei risultati rappresentativi

Utilizzando il foglio di calcolo indicato nella tabella 6 e ha fornito in allegato, i valori dei dati dei singoli pozzi possono essere inseriti nelle colonne indicate con le intestazioni di colore giallo. Tutte le sei colonne a destra sono calcolati da queste voci. L'esempio nella tabella 6 mostra i calcoli di PPR e PPR _{resp GLYC} usando ECAR e dati OCR da pozzi individuali per le condizioni native, con o senza aggiunta di glucosio, prima di Porto Un'aggiunta di oligomicina. Replicati tecnici su ogni preparato biologico sono normalmente una media di dare singoli valori delle uscite nelle ultime quattro colonne, quindi i dati provenienti da diversi preparati biologici sono mediati con un'adeguata propagazione delle statistiche di errore in BP e di questi quattro valori.

Tabella 6. Calcolo di respiratorie e acidificazione glicolitico. Colonne diretti in giallo indicano i valori da inserire dal calcolo (ad esempio, BP, max H ⁺ / O _2), o dalla raccolta dei dati (ad esempio, ECAR _tot, OCR). ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella |. Cliccate qui per scaricare la tabella come un foglio di calcolo di Excel .

Contributi della glicolisi e la respirazione a PPR dopo la correzione

La figura 3 mostra l'output grafico dei dati calcolati come nella Tabella 6 per i tassi nativi di acidificazione glicolisi e respiratoria, tassi seguenti oligomicina aggiunta (Porta A), e tassi seguenti FCCP aggiunta (Porta B). Questi dati dimostrano chiaramente come le proporzioni del cambiamento acidificazione respiratorie e glicolitico con la scelta di substrato (glucosio rispetto al controllo (CTL) con nessuno aggiunti) e con lo stato mitocondriale (funzione nativa vs funzione farmacologicamente alterata).

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Figura 3. Proton tasso di produzione (PPR) da fonti glicolitici e respiratorie. PPR da respirazione (porzioni aperti) e glicolisi (porzioni piene) delle cellule C2C12 calcolato con la formula 5 con glucosio aggiunto (tre barre a sinistra) o senza glucosio aggiunto (tre barre a destra). I dati provenienti da ^6. Tutti i dati rappresentano media ± SEM di n = 8 repliche biologiche.

Discussione

Acidificazione extracellulare è un'indicazione facilmente misurabile di cellulari tasso metabolico. Per determinare correttamente il tasso di glicolisi cellulare (come definito dalla produzione di lattato) è fondamentale conoscere la potenza tampone del terreno di coltura, e per convertire le misure di flusso extracellulari di consumo di ossigeno e acidificazione protone tassi di produzione. Eseguendo questo calcolo, l'acidificazione derivante da CO ₂ rilasciato nel ciclo dell'acido citrico può essere sottratto, lasciando l'acidificazione che risulta dalla produzione di lattato.

Le molteplici modi qui riportati per misurare la potenza buffer per la correzione portano diversi vantaggi e svantaggi. Misura esterna utilizzando una sonda pH è estremamente preciso e riproducibile, ma non può riflettere piccole differenze di rilevamento pH introdotto dai fluorofori contenuti nella piastra di dosaggio, l'aggiunta di composti durante il dosaggio, o la presenza di tegli cellule stesse. L'in-piatto misure di pH affrontare questi problemi, ma anche introdurre i vari livelli di rumore sperimentale.

La correzione CO ₂ per ECAR consente per la prima volta il calcolo univoca e quantitativa della glicolisi, e rivela variazione contributo respiratoria e glicolitico a ECAR totale durante il corso di un esperimento. Utilizzando Equazione 5 e le misure di OCR, ECAR, e il potere il buffering, glicolisi può essere calcolata utilizzando la semplice foglio di calcolo previsto (Tabella 6). Questo tasso può essere verificato misurazione del lattato post-hoc, se desiderato ^6. Nelle cellule dove la via dei pentoso fosfati è molto attivo, l'uso di inibitori pathway come 6-aminonicotinamide può essere utile per isolare glicolisi. Calcolo dei contributi sia di CO ₂ ^- e lattato di derivazione H ⁺ dal totale misurato extracellulare acidificazione Rate e ossigeno assorbita bobinaion Tasso è uno strumento prezioso per l'utilizzo dei dati di flusso extracellulari di rendere potenti e quantitativi dichiarazioni circa l'attività metabolica.

Utilizzando le procedure qui descritte, incluse varie modifiche per misurare il potere tampone, e ottimizzando l'esperimento flusso extracellulare per le cellule in esame e dati desiderati, il tasso di glicolisi in cellule intatte può essere quantificato in un'ampia gamma di condizioni sperimentali. Questo metodo è limitato alle cellule che possono crescere in coltura aderente sui (o cellule o organelli che possono essere rispettati) una superficie di polistirene. È più affidabile quando cellule coltivate sono omogenei e confluenti, se i dati utili possono essere ottenuti su una gamma di queste condizioni. I calcoli richiedono una certa conoscenza del metabolismo delle cellule, come max H ⁺ / O ₂ varia da 0,65 a 1,0 per la completa ossidazione di substrati diversi e di più per ossidazione parziale ^6, tuttavia, se le cellule sono known per ossidare il glucosio, un valore di 1,0 può essere assunto.

Sebbene pertinenti a tutti caratterizzazione metabolica, questo metodo può essere particolarmente utile se utilizzato in sistemi in cui il passaggio tra il metabolismo respiratorio e glicolitico mantenere approvvigionamento ATP cellulare è un fenotipo critica, compresa la caratterizzazione di cellule staminali e cellule tumorali derivate da tumore. Informazioni alterazioni metaboliche controllo in questi ed altri contesti consentirà un maggior grado di sofisticazione e precisione nel disegno sperimentale e l'analisi di questi tipi cellulari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pherastar FS	BMG	n/a	lettore di micropiastre
Seahorse XF-24	Seahorse Bioscience	n/a	strumento di flusso extracellulare
Seahorse XF piastra di analisi Seahorse	Bioscience	V7-PS	consumabile
XF Calibrant	Seahorse Bioscience	100840-000	soluzione
HCl standard	Sigma	38280	oligomicina chimica
	Sigma	O4876	chimica
FCCP	Sigma	C2920	chimica
Rotenone	Sigma	R8875	chimica
Myxothiazol	Sigma	T5580	chimica
DMEM	Corning	10-013-CV	componente medio
FBS	Corning	35-010-CV	media componente
penicillina/streptomicina	Corning	30-002-CI
anidrasi carbonica	Sigma	C2624	chimico
Piastra di dosaggio a 96 pozzetti	Corning	CLS3991	consumabile
NAD+	Sigma	N7004	chimico
LDH	Sigma	L1254	chimico

a componente medio